Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen
9. September 2020
Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung von in vitro Ca2+ Flussflüssen in Midbrain-Neuronen und deren nachgelagerten Auswirkungen auf Caspase-3 unter Verwendung primärer Maus-Midbrain-Kulturen vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormalen Ca2+ Aktivität in Midbrain Neuronen zu studieren, und um neue Therapeutika für anti-apoptotische Eigenschaften zu überprüfen.
Dieses Protokoll quantifiziert Kalziumflüsse in dopaminergen Neuronen, die bei der Parkinson-Krankheit verloren gehen. Dies ist nützlich, um zu verstehen, wie abnormes Kalzium dopaminergen Neuronenverlust bei der Parkinson-Krankheit verursacht. Zum ersten Mal zeigen wir spontane Kalziumflüsse in kultivierten primären Midbrain-Neuronen.
Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Rezeptor-Beiträge zu sezieren, die an der Calcium-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Unsere Methode bietet eine Möglichkeit für hochhaltige Arzneimittel-Screens, um spezifische und effektive neuroprotektive Verbindungen für die Parkinson-Krankheit zu entdecken. Diese neuroprotektive Verbindungen würden Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron verhindern.
Beginnen Sie mit der Zubereitung eines Milliliters serumfreiem DMEM-Medium mit einem Mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV pro Schale. Das Zellkulturmedium aus jedem Gericht ansaugen und durch einen Milliliter des vorbereiteten DMEM durch hSyn-GCaMP6f ersetzen. Legen Sie das Geschirr für eine Stunde wieder in den 37 Grad Celsius Brutkasten.
Nach der Inkubation das Medium mit AAVs aspirieren und durch drei Milliliter Zellkulturmedium ersetzen. Die Gerichte fünf bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wechseln des Mediums alle zwei bis drei Tage während dieser Periode der Virusinfektion.
Bereiten Sie einen Liter des HEPES-Aufnahmepuffers, 200 Milliliter 20 Mikromollar-Glutamat-Aufzeichnungspuffer und 200 Milliliter 10 Mikromolar-NBQX-Aufnahmepuffer nach Manuskriptanweisungen vor. Füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern des Aufnahmepuffers. Nehmen Sie die Petrischale mit den infizierten Kulturen aus dem Brutkasten, dann schnappen Sie sich vorsichtig die Kante eines Deckelschlupfes mit feinen Spitzenzangen und übertragen Sie sie mit dem Aufnahmepuffer in die Schale.
Legen Sie den restlichen Deckelschlupf in Medium zurück in den 37 Grad Celsius Inkubator und transportieren Sie die Schale mit Aufnahmepuffer zum konfokalen Mikroskop. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware. Während der Initialisierung starten Sie die peristaltische Pumpe und platzieren Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer.
Dann kalibrieren Sie den Durchfluss auf zwei Milliliter pro Minute. Übertragen Sie den infizierten Deckelschlupf von der Petrischale in das Aufnahmebad mit feiner Zange. Mit dem 10X Wasser-Immersion-Objektiv und hellfeldlicht, finden Sie die Ebene des Fokus und suchen Sie nach einer Region mit einer hohen Dichte von Neuronen-Zellkörpern, dann wechseln Sie zum 40X-Objektiv und fokussieren Sie die Probe neu.
Wählen Sie AlexaFluor 488 im Listenfenster Farbstoffe aus und wenden Sie es an. Um Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu verhindern, beginnen Sie mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Für den AlexaFluor 488 Kanal stellen Sie den HV auf 500, den Gewinn auf 1x und den Offset auf Null.
Stellen Sie die Leistung für die 488-Laserlinie auf 5 % ein. Erhöhen Sie die Lochgröße auf 300 Mikrometer und verwenden Sie die Option Fokus x2-Scanning, um Emissionssignale optimal an die Subsättigung anzupassen. Die Einstellungen können dann für eine optimale Sichtbarkeit jedes Kanals angepasst werden.
Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie die Bühne, um einen Bereich mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Veränderungen in der GCaMP6f-Fluoreszenz anzeigen, und konzentrieren Sie sich auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung. Verwenden Sie das Clip-Korrekturwerkzeug, um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Frameintervall von knapp einer Sekunde erreichen kann. Legen Sie das Intervallfenster auf den Wert 1,0 und das Num-Fenster auf 600 fest.
Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option Zeit aus, und verwenden Sie dann die Option Xyt-Scan, um mit der Bildgebung zu beginnen. Beobachten Sie die Bildfortschrittsleiste und verschieben Sie die Linie aus dem HEPES-Aufnahmepuffer zum entsprechenden Zeitpunkt in den 20 Mikromolaren-Glutamat-Aufzeichnungspuffer. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche "Serie fertig" aus, und speichern Sie den fertigen T-Series-Film.
Setzen Sie das Glutamat für weitere fünf Minuten fort, so dass die Kultur der Neuronen Glutamat für insgesamt 10 Minuten ausgesetzt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abdeckbeleg, der abgebildet werden soll. Es ist möglich, Kalziumspuren und neuronale Zellkörper unmittelbar nach dem Experiment zu sehen.
Verwenden Sie das Ellipse-Tool, um die gewünschte Anzahl von ROIs um das neuronale Soma zu zeichnen. Und verwenden Sie die Schaltfläche Serienanalyse, um die Ablaufverfolgungen zu visualisieren. Nach der zusätzlichen fünfminütigen Exposition gegenüber Glutamat den Deckelschlupf mit feiner Zange aus dem Bad nehmen und mit dem Aufnahmepuffer wieder in die Petrischale legen, bis alle Bildgebung abgeschlossen ist.
Am Tag der Bildgebung wurden die VM-Kulturen entweder mit Glutamat oder einer Kombination aus Glutamat und NBQX behandelt. Unter beiden Bedingungen wurden heterogene und spontane Veränderungen der GCaMP6f-Blütenstand beobachtet, die auf spontane Kalziumflüsse hindeuten. Die Anwendung von Glutamat erzeugte eine robuste und anhaltende Kalziumreaktion sowohl in spontan aktiven als auch in stillen Neuronen.
Die Anwendung von NBQX reduzierte die spontane Aktivität und blockierte teilweise die Glutamatreaktion. Das Ausmaß, in dem die Glutamatanwendung eine Kalziumreaktion in jeder Erkrankung stimulierte, wurde anhand des Bereichs unter der Kurve, der Spitzenamplitude und der Latenz quantifiziert, um zu reagieren. Die Latenz auf die Reaktion nahm unter dem NBQX- und Glutamatzustand zu.
Zur Messung der Glutamat-vermittelten Apoptose wurden die Zellen fixiert und mit einem Anti-Caspase-3-Antikörper befleckt. Die mittlere Caspase-3-Intensität war bei beiden Behandlungsbedingungen signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollen. Eine gründlichere Analyse des angeregten toxischen Zelltodes kann durch Zählen der Anzahl der Immunstain-Tyrosin-Hydroxylase positive dopaminerge Neuronen in der Kontrolle und Glutamat behandelt Zustand durchgeführt werden.
Diese Technik hat den Weg für das Verständnis der relativen Beiträge der verschiedenen Rezeptoren und Eisenkanäle an Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron beteiligt geebnet.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Messung von in-vitro-Calcium-(Ca2+)-Flüssen in Mittelhirnneuronen unter Verwendung primärer Maus-Mittelhirnkulturen vor. Das Modell untersucht pathologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormer Calciumaktivität, insbesondere im Kontext der Parkinson-Krankheit, und bietet eine Plattform zur Untersuchung potenzieller neuroprotektiver Therapeutika.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neuropharmakologie
Hintergrund
- Der Kalziumfluss in Neuronen spielt eine entscheidende Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen.
- Der Verlust dopaminergener Neuronen ist ein Kennzeichen der Parkinson-Krankheit.
- Die Studie untersucht, wie abnormale Kalziumspiegel Apoptose in dopaminergen Neuronen auslösen.
- Die Applikation von Glutamat und NBQX hilft dabei, kalziumvermittelte Reaktionen und neuroprotektive Effekte zu bewerten.
Zweck der Studie
- Spontane Kalziumflüsse in primären Mittelhirn-Neuronenkulturen messen.
- Beiträge von Rezeptoren zum kalziumvermittelten Zelltod verstehen.
- High-Content-Screening für neuroprotektive Substanzen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Zellkulturen, die aus primären murinen Mittelhirnneuronen stammten, wurden verwendet.
- Die Kalzium-Bildgebung erfolgte unter Verwendung von GCaMP6f zur Überwachung von Fluoreszenzänderungen.
- Zu den wichtigsten Verfahren gehörten die Herstellung des Kulturmediums und die Applikation von Glutamat.
- Zeitkritische Bildaufnahmen wurden mittels Mikroskopie unter sorgfältiger Einstellung der Parameter durchgeführt.
- Die Zellen wurden entweder mit Glutamat oder mit einer Kombination aus Glutamat und NBQX behandelt.
Hauptergebnisse
- Die Kalziumantworten variierten je nach Behandlungsbedingungen und zeigten sowohl spontane als auch glutamatausgelöste Veränderungen.
- Die Caspase-3-Aktivität war in behandelten Neuronen signifikant erhöht, was auf apoptotische Prozesse hindeutet.
- Die Applikation von NBQX verringerte die spontane Aktivität und veränderte die Glutamatantworten.
- Die Methode zeigte ein Potenzial, um die rezeptorspezifischen Beiträge zum neuronalen Zelltod aufzuschlüsseln.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Kalzium-vermittelten Apoptose in dopaminergen Neuronen.
- Das Protokoll dient als wertvolles Werkzeug zur Identifizierung neuroprotektiver Wirkstoffe, die für die Parkinson-Krankheit relevant sind.
- Die Ergebnisse liefern Einblicke in pathologische Mechanismen und therapeutische Ansatzpunkte bei Neurodegeneration.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung spontaner und glutamatabhängiger Kalziumflüsse in primären mittelhirnischen Neuronen der Maus und stellt damit ein krankheitsrelevantes System zur Modellierung der exzitotoxischen Schädigung dopaminergener Neurone bei Morbus Parkinson bereit. Durch die Verknüpfung von Kalziumdynamik mit der Aktivierung von Caspase-3 unterstützt es die mechanistische Absicherung neuroprotektiver Substanzen mittels funktioneller Messgrößen zum neuronalen Überleben. Der Ansatz gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Target-Validierung bis zum präklinischen Screening, indem er eine hochinhaltsreiche Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf die kalziumvermittelte Apoptose ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich des Glutamatrezeptor-vermittelten Calciumeinstroms beim Verlust dopaminerger Neuronen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielstrukturvalidierung, indem der Calciumfluss als unmittelbare Messgröße der Rezeptoraktivität bestimmt wird.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Vorhersagekraft, indem die Modulation des Rezeptors mit downstream-apoptotischen Effekten über die Aktivierung von Caspase-3 verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht quantitative, Echtzeit-Messungen von intrazellulären Kalziumänderungen als funktionellen Assay-Output.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch definierte Behandlungsbedingungen mit Glutamat und NBQX sowie definierte Bildgebungsparameter.
- Skalierbarkeit: Unterstützt ein Hochdurchsatz-Screening-Format mittels Live-Bildgebung und automatisierter ROI-Analyse des neuronalen Soma.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Biomarker: Verwendet die Aktivierung von Caspase-3 als messbaren Endpunkt der Glutamat-induzierten Apoptose in Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen.
- Präklinisches Modell: Etabliert ein krankheitsrelevantes System unter Verwendung primärer ventraler Mesencephalon-Neurone, um die für die Parkinson-Krankheit relevante Exzitotoxizität zu modellieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Priorisierung von Substanzen basierend auf ihrer Fähigkeit, den Kalziumfluss und die nachgeschaltete Aktivierung von Caspase-3 zu unterdrücken.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, indem sie einen funktionellen Endpunkt für die neuronale Gesundheit in einem für die Parkinson-Krankheit relevanten Modell bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum Beitrag von Glutamatrezeptoren bei der kalziumvermittelten Apoptose in dopaminergen Neuronen.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Messungen des Kalziumflusses und Nachweis der Apoptose mittels Immunfärbung.
- Analytik: Erzeugt quantitative Auswertungen wie Fläche unter der Kurve, Spitzenamplitude und Reaktionslatenz für Kalziumspuren, wodurch ein Vergleich zwischen Bedingungen ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Verbindet eine Dysregulation des Kalziumhaushalts mit apoptotischem Zelltod in dopaminergen Neuronen und unterstützt die Zuordnung von Biomarkern zu neurodegenerativen Wegen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung neuroprotektiver Substanzen in mehreren Screening-Kampagnen, die auf die Kalziumhomöostase abzielen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem der Kalziumfluss als zentraler Auslöser der dopaminergen Neuronenapoptose isoliert wird.
- Operationaler Wert: Fördert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte virale Transduktion, Herstellung des Bildgebungs-Puffers und Einstellung der konfokalen Parameter.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch frühzeitige funktionelle Belege für Targetbindung und Neuroprotektion.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Substanzen, die die kalziumvermittelte Apoptose in krankheitsrelevanten Neuronen abschwächen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der primären Neuronenkultur, viralen Transduktion und lebendigen konfokalen Bildgebung.
- Abhängig von der Ausstattung, einschließlich eines konfokalen Mikroskops mit Perfusionsystem und Software zur Analyse von interessierenden Bereichen (ROI).
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Dauer der Glutamat-Exposition, der gleichzeitigen Anwendung von NBQX und der Protokolle zur Caspase-3-Färbung.
- Beinhaltet Anpassungen bei der Übertragung von Maus- auf humane Neuronenmodelle oder alternative Krankheitskontexte.
- Eingeschränkt durch die Variabilität der Transfektionseffizienz primärer Neuronen und der spontanen Grundaktivität zwischen verschiedenen Präparationen.
