Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

Nach seiner Entwicklung hat sich das Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie in präklinischen Studien zu neovaskulären Netzhauterkrankungen durchgesetzt. Es wurde als Modell zur Untersuchung der pathologischen Angiogenese als Reaktion auf Hypoxie verwendet. Der Hauptvorteil dieses Modells besteht darin, dass es eine robuste neurovaskuläre Reaktion induziert, die reproduzierbar und leicht quantifizierbar ist.

Dieses Modell kann als präklinisches Modell verwendet werden, um die Auswirkungen möglicher therapeutischer Kandidaten zu untersuchen. Sie gilt als relevantes Modell für verschiedene menschliche Krankheiten, wie z. B. Frühgeborenenretinopathie, diabetische Retinopathie und feuchte altersbedingte Makuladegeneration. Notieren Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Hypoxie-Induktion und zum Zeitpunkt der Tötung.

Stellen Sie sicher, dass sich genügend Futter auf dem Boden des Käfigs befindet, und geben Sie Natronkalk mit Farbindikator auf den Boden der Kammer, um überschüssiges Kohlendioxid zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird. Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer und halten Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 65 %Bei Bedarf erhöhen Sie die Luftfeuchtigkeit der Kammer, indem Sie Geschirr mit Wasser auf den Boden stellen. Kalibrieren Sie den Sauerstoffsensor mit normaler Raumluft und 100% Sauerstoff.

Setzen Sie dann die P7-Mäuse in eine Kammer und stellen Sie den Sauerstoffgehalt auf 75 % einBewahren Sie die Mäuse fünf Tage lang bis P12 in der Kammer auf und überwachen Sie die Tiere während der Induktion. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Mäuse aus der Kammer. Wiegen Sie die Tiere und machen Sie Kennzeichnungen am Schwanz oder am Ohr.

Nachdem das Tier betäubt wurde, führen Sie eine Zehenkneifung durch. Ein kleiner Reflex ist akzeptabel. Halten Sie das Tier während der Behandlung auf einem Heizkissen.

Verwenden Sie für die IVT-Injektion eine Glasspritze mit einer 33- bis 34-Gauge-Nadel. Tragen Sie einen Tropfen Jod auf, drücken Sie dann das Augenlid nach unten und fassen Sie den Augapfel mit einer Pinzette. Führen Sie die Injektion hinter dem Limbus durch, etwa in einem 45-Grad-Winkel, der in Richtung des Sehnervs zeigt.

Halten Sie die Nadel nach der Injektion des Arzneimittels 30 Sekunden lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der injizierten Lösung zu vermeiden. Untersuchen Sie das Auge auf Komplikationen wie Blutungen oder Netzhautschäden, nachdem Sie die Nadel entfernt haben. Tragen Sie nach der Injektion eine antibiotische Salbe auf das Auge auf.

Falls gewünscht, führen Sie während der Nachbeobachtungszeit eine In-vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um Veränderungen aufzuzeichnen, die sich während der angiogenen Reaktionen in der Netzhaut entwickeln. Verwenden Sie die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich, um Netzhautschichten in vivo sichtbar zu machen. Sammeln Sie die Augen der Tiere, indem Sie das Gewebe um das Auge herum durchschneiden, mit einer gebogenen Pinzette hinter den Augapfel greifen und das Auge aus der Augenhöhle heben.

Inkubieren Sie die Augäpfel ein bis vier Stunden lang in frisch hergestelltem, gefiltertem 4%-Paraformaldehyd. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Augäpfel dreimal 10 Minuten lang pro Waschgang mit PBS. Präparieren Sie die Netzhaut sofort oder lagern Sie sie in PBS bei vier Grad Celsius.

Bereiten Sie retinale flache Halterungen vor, um das Ausmaß der Neovaskularisation und die Größe der avaskulären Bereiche oder AVAs zu quantifizieren. Präparieren Sie die Netzhaut unter einem Stereomikroskop mit einer Mikroschere und einer Pinzette. Legen Sie den Augapfel in PBS, um ihn feucht zu halten, und stechen Sie ihn mit einer 23-Gauge-Nadel in den Limbus, dann schneiden Sie mit einer gebogenen Mikroschere um den Limbus herum, um die Iris und die Hornhaut zu entfernen.

Platzieren Sie die Spitze der Schere vorsichtig zwischen RPE und neuraler Netzhaut und schneiden Sie den RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in Richtung Sehnerv. Machen Sie dasselbe mit der anderen Seite des Augapfels. Schneiden oder reißen Sie dann das Gewebe vorsichtig ab, bis die Netzhautschale freiliegt.

Ziehen Sie die Linse aus dem Netzhautbecher und geben Sie PBS in den Becher. Entfernen Sie alle hyaloiden Gefäße, Glaskörper und Ablagerungen, ohne die Netzhaut zu beschädigen. Machen Sie mit einer geraden Mikroschere vier Schnitte in die Netzhaut, um eine blütenartige Struktur zu erzeugen.

Verwenden Sie einen weichen Pinsel oder eine Transferpipette, um es zum Färben auf eine Well-Platte zu übertragen. Markieren Sie das retinale Gefäßsystem mit Isolektin B4, das die Oberfläche der Endothelzellen färbt. Inkubieren Sie die Netzhaut eine Stunde lang in Blockierungspuffer und waschen Sie sie 10 Minuten lang mit 1 % NGS und 0,1 % Triton in TBS.

Inkubieren Sie die Netzhaut mit 5 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter Fluoreszenzfarbstoff konjugiertem Isolektin B4 über Nacht bei vier Grad Celsius und dabei vor Licht geschützt. Waschen Sie die Netzhaut am nächsten Tag dreimal mit 1 % NGS und 0,1 % Triton in TBS für 10 Minuten pro Waschgang. Legen Sie die Netzhaut mit der inneren Netzhaut nach oben auf einen Objektträger.

Spreizen Sie dann die Netzhaut vorsichtig mit einem weichen Pinsel und entfernen Sie alle verbliebenen hyaloiden Gefäße oder Ablagerungen. Tragen Sie Eindeckmedium auf die Probe auf und legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger. Lagern Sie die Netzhäute bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.

Nehmen Sie die flachen Halterungen der Netzhaut mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv auf. Der Fokus liegt auf dem oberflächlichen Gefäßplexus und der präretinalen Neovaskularisation. Erstellen Sie ein Kachelscanbild, um die gesamte Netzhaut zu erfassen und die Kachelscans zusammenzuführen.

Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie die AVAs, den Bereich der Neovaskularisation und die gesamte Netzhautfläche mit einem Bildverarbeitungsprogramm messen. Zeichnen Sie die AVAs und den gesamten Netzhautbereich mit einem Freihandzeichenwerkzeug und wählen Sie die neovaskulären Bereiche mit einem Auswahlwerkzeug aus. Im Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie der Maus findet die Vaso-Obliteration in der zentralen Netzhaut statt.

Während es sich im Rattenmodell in der Peripherie ähnlich wie das menschliche ROP entwickelt. Die präretinale Neovaskularisation entwickelt sich in der Nähe der avaskulären Bereiche, insbesondere der zentralen Netzhaut bei der Maus und der Peripherie bei Ratten. Eine histologische Analyse mit Hilfe von Querschnitten oder flachen Halterungen kann durchgeführt werden, um morphologische Veränderungen in der OIR-Netzhaut oder das Vorhandensein von Zelltypen von Interesse, z. B. Entzündungszellen, zu bewerten.

Optional kann während der OIR-Nachbeobachtungszeit eine nicht-invasive In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Retinale und hyaloide Gefäße können mit der Fluoreszenzangiographie sichtbar gemacht werden, und die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich kann verwendet werden, um strukturelle Veränderungen in der Netzhaut zu beurteilen. Funktionsveränderungen können mittels Elektroretinographie gemessen werden.

Aflibercept, eine lösliche VEGF-Falle, hemmt sowohl die neovaskuläre als auch die physiologische Revaskularisation bei OIR. OIR-Augen, die an P14 mit einer hohen Dosis Aflibercept injiziert wurden, wiesen noch größere retinale AVAs auf als unbehandelte Augen, was darauf hindeutet, dass Aflibercept auch die physiologische Revaskularisation der Netzhaut blockiert, die durch Hypoxie ausgelöst wird. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die richtige Wurfgröße für Ihr Experiment im Voraus zu berücksichtigen und das Wohlbefinden der Muttertiere und der Jungtiere in der Sauerstoffkammer zu überwachen.

Berücksichtigen Sie, dass die postnatale Gewichtszunahme das Ergebnis im Modell beeinflusst. Netzhautproben, die aus diesem Modell gewonnen werden, können für analytische Methoden wie Immunhistochemie, Gen- oder Proteinexpressionsanalyse und zur Messung der Auswirkungen potenzieller therapeutischer Kandidaten auf die Netzhaut auf molekularer Ebene verwendet werden.