Name: Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie einen Ex-vivo-Assay zur Untersuchung der Hyphalmorphogenese von Candida albicans im Magen-Darm-Trakt. Diese Methode nutzt Darmhomogenate und Immunfluoreszenzfärbung.

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Die Autoren würdigen Ressourcen und Unterstützung von Midwestern University Cellular and Molecular Core Research Facility.

Alle Tierprotokolle wurden vom Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wie vor57beschrieben genehmigt. Der Institutional Animal Care and Use Committee der Midwestern University genehmigte diese Studie im Rahmen des MWU IACUC Protocol #2894. Die MWU-Tierpflegerichtlinien folgen der Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes (PHS) zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Tierschutzgesetzes (AWA).
1. Mäuse studieren Standardprotokoll
<ol><li>Verwenden Sie männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse, die mindestens sechs Wochen alt sind. Ergänzen Sie sie mit sterilem Wasser mit oder ohne Cefoperazone (0,5 mg/ml).<ol>
<li>Co-Haus Mäuse in Gruppen von 5, mit jedem Käfig enthält entweder alle männlichen oder alle weiblichen Mäuse. Stellen Sie die Mäuse Standard Maus Chow und Wasser (über eine 400 ml Flasche) zu jeder Zeit.</li>
		<li>Überprüfen Sie täglich Käfige, um sicherzustellen, dass Nahrung und Wasserstände ausreichen, und um Mäuse auf Anzeichen von Not zu untersuchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ersetzen Sie das Wasser alle 48 h durch Cefoperazone, um sicherzustellen, dass frisches Antibiotikum unabhängig vom verbleibenden Wasser in den Käfig-Fütterungsflaschen zur Verfügung gestellt wird.</li>
	<li>Nach 5-u20127 Tagen Cefoperazone-Behandlung, einschläfern Mäuse über CO 2-Erstickung unter Einhaltung etablierter IACUC-Protokoll. Bestätigen Sie den Tod durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Sezieren Sie Mäuse mit autoklav-sterilisierten scharfen Enden und autoklav-sterilisierten Zangen.<ol>
<li>Nach der Euthanasie, sichern Sie das Tier an einer Sezierfläche, indem Sie alle Gliedmaßen so festsetzen, dass der Bauch freigelegt wird.</li>
		<li>Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell während der Zerlegung an Zangen, Scheren oder Darmabschnitten klebt.</li>
		<li>Verwenden Sie Zangen, um einen Teil der Haut an der Unterbasis des Bauches zu kneifen und zu heben und einen kleinen Schnitt durch die Haut und die darunter liegende Faszie mit einer Schere zu erstellen. Achten Sie bei diesem Schnitt sehr darauf, das Cecum oder die Darmwand nicht zu durchkreuzen.</li>
		<li>Erweitern Sie diesen Schnitt auf den Rippenkäfig, wodurch die Peritonealhöhle teilweise freigelegt wird. Machen Sie einen Schnitt, der an der Stelle des anfänglichen Einschnitts auf beiden Seiten beginnt, der sich nach oben und seitlich erstreckt.</li>
		<li>Ziehen Sie diese Klappen seitlich und heften Sie sich an die Sezierender Fläche, um die Peritonealhöhle vollständig freizulegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrahieren Sie den GI-Trakt mit Zangen, während mit Schere, um Schnitte besser als der Magen und an der distalen Bereich des Dickdarms zu machen, um die Sammlung der größten Menge an Darmgehalt aus jedem Abschnitt zu gewährleisten.</li>
	<li>Achten Sie beim Entfernen des GI-Trakts darauf, dass die einzelnen Komponenten nicht zerbrechen. Trennen Sie Magen, Dünndarm, Cecum und Dickdarm einzeln mit einer Schere an ihren proximalen und distalen Enden.</li>
	<li>Für die Erfassung jedes Darminhalts aus jedem Abschnitt, machen Sie einen einzigen Schnitt am distalen Ende jedes Abschnitts mit einer Schere, gefolgt von manuellen Ausstoß des Darmgehalts in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Zangen.</li>
	<li>Gutinhalt bei -80 °C für Ex-vivo-Assays lagern.</li>
</ol>2. Herstellung von Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Agarplatten
<ol><li>Zu einer 1 L Glasflasche 25 g Hefeextrakt Pepton-Dextrose-Brühepulver, 10 g Agar und Reinstwasser auf ein Endvolumen von 500 ml geben.</li>
	<li>Autoklav bei 121 °C für 30 min auf einem flüssigkeitszyklischen Zyklus, um die Medien zu sterilisieren.</li>
	<li>Unter einer laminaren Strömungshaube ca. 20 ml Agarmedien in eine sterile Petriplatte gießen. 500 ml Agarmedien sollten etwa 25 Platten ergeben.</li>
	<li>Platten bei 4 °C lagern, bis sie einsatzbereit sind.</li>
</ol>3. Ex-vivo-Vorbereitung für Hyphal-Morphogenese-Assay
<ol><li>Eine frische Kultur von C. albicans SC5314 auf eine YPD-Agarplatte geben und über Nacht bei 30 °C brüten.</li>
	<li>Wählen Sie zwei bis drei mittelgroße Einzelkolonien aus der über Nacht angebauten C. albicans SC5314 Kultur und setzen Sie in 1 ml Phosphat gepufferter Saline (PBS) wieder aus.</li>
	<li>Gefrorenen Darminhalt aus dem Gefrierschrank von -80 °C holen und bei 25 °C auftauen.</li>
	<li>Wiegen Sie etwa 150 mg Darminhalt in ein neues 1,5 ml Rohr.</li>
	<li>Unterbrechen Sie den Darminhalt mit 150 l PBS (Darmgehalt und PBS bei einem Gewichts-Volumen-Volumen-Verhältnis von 1:1).</li>
	<li>Wirbel mit hoher Geschwindigkeit für 30 s, um den Darminhalt zu homogenisieren und bei Raumtemperatur für etwa eine Minute sitzen zu lassen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1000 x g für 3 min.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8, um alle Trümmer im Überstand zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 L des C. albicans SC5314 inoculum oben zu diesem Überstand vorbereitet</li>
	<li>Gut mischen und bei 37 °C für 4 bis 5 h inkubieren.</li>
</ol>4. Exogene Zugabe von Metaboliten zu den Darmhomogenat-Extrakten für den Hyphal-Morphogenese-Assay
<ol><li>Erhalten Sie gefrorenen Darminhalt aus dem -80 °C Gefrierschrank und wieder in PBS im Verhältnis 1:1 (Gewicht: Volumen).</li>
	<li>Fügen Sie die gewünschte Konzentration von Darmmetaboliten zum Darmgehalt und PBS-Mischung hinzu.</li>
	<li>Wirbel mit hoher Geschwindigkeit für 30 s, um den Darminhalt mit Metaboliten zu homogenisieren und bei Raumtemperatur für ca. 10 min sitzen zu lassen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1000 x g für 3 min.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5, um alle Trümmer im Überstand zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie diesem Überstand 10 L des C. albicans SC5314 inoculum hinzu. Gut mischen und bei 37 °C für 4 bis 5 h inkubieren.</li>
</ol>5. C. Albicans Morphogenese-Assay (Immunostaining und Imaging)
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 x g für 2 min und entsorgen Sie den Überstand über Pipettierung.</li>
	<li>Fixieren Sie die Proben in 100 l mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1000 x g für 2 min und entsorgen Überstand über Pipettierung.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 ml PBS. Um Proben zu waschen, setzen Sie das Pellet in PBS wieder auf, indem Sie sanft pfeifen. Wirbeln Sie die Probe nicht, da dies Hyphenstrukturen beschädigen kann. Nach wiederaufhängung bei 1000 x g für 2 min zentrieren und den Überstand über Pipettierung entsorgen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur in 100 l PBS, die polyklonale C. Albican-Antikörper (1:100 Verdünnung) für 30 min enthalten.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben dreimal mit 1 ml PBS. HINWEIS: Bei Verwendung eines fluoreszierenden Antikörpers wird empfohlen, alle Verdünnungs- und Waschschritte bei leichtem Licht durchzuführen, um Photobleichungen zu vermeiden und die Lebensdauer der Probe zu verbessern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 min in 100 l PBS, die Anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 Antikörper bei 1:500 Verdünnung enthalten. Führen Sie eine Inkubation in einer dunklen Schublade oder einem Raum durch, um Fotobleichen zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben dreimal mit 1 ml PBS.</li>
	<li>Setzen Sie die Proben in 100 l PBS wieder auf und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf eine 96-Well-Platte. HINWEIS: Wenn nicht abgebildet, wird empfohlen, dass die 96-Well-Platte in Aluminiumfolie eingewickelt werden, um Fotobleichungen zu vermeiden.</li>
	<li>Bildpilzzellen mit 20x- und 40x-Objektivlinsen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsmikroskop. Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Protein-Filter (GFP) (Erregungswellenlänge 470/40 und Emissionswellenlänge 525/50), um Fluoreszenz zu erkennen.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Die hier beschriebene Methode stellt eine neue Methode dar, um die Wirkung von antibiotika-, diätetischen, xenobiotischen und therapeutischen Auswirkungen auf die Hypahypomorphese von C. albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Da die Mehrheit der systemischen Infektionen aus dem GI-Traktstammen 21,22,23,24,25,26,</...

Candida albicans ist ein opportunistischer, polymorpher Pilzerreger, der normalerweise commensal ist, aber eine morphologische Veränderung in eine virulente Form durchmachen kann, die lebensbedrohliche Infektionen bei immungeschwächten Individuen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13verursachen kann. C. albicans ist eine der Hauptursachen für systemische nosokomiale Infektionen, mit einer Sterblichkeitsrate von 40-u201260% auch bei antimykogaler Behandlung2,14,15. Obwohl C. albicans in verschiedenen Wirtsnischen einschließlich des weiblichen Fortpflanzungssystems16,17, die Mundhöhle von gesunden Personen18 und der Magen-Darm-Trakt19,20, die Mehrheit der systemischen Infektionen stammen aus dem GI-Trakt und darüber hinaus, die Quelle der systemischen Infektion wird oft bestätigt, um die GI-Trakt21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. Albicans Pathogenität im GI-Trakt wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst; Ein wesentliches Merkmal, das für die Virulenz notwendig ist, ist jedoch der Übergang von einer Hefezellmorphologie zu einer virulenten Hypothekzellmorphologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. Albicans Anhaftung und Verbreitung aus dem GI-Trakt während der Infektion ist stark mit seiner Fähigkeit verbunden, von einer kommensalen Hefe in virulenten Hyphen zu übergehen, so dass die Pilze invasive Krankheitverursachen 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Eine Vielzahl von Faktoren im Darm, einschließlich n-Acetylglucosamin, regulieren Hyphalbildung durch C. albicans. Daher ist es entscheidend, die Wissenslücke über die Hyphalmorphogenese dieses Pilzerregers im GI-Trakt54,55,56zu verringern. Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass verschiedene Darmmetaboliten die Hyphalmorphogenese von C. albicans in vitro57,58,59,60differenziell steuern. Jedoch, technische Zwänge stellen Probleme bei dem Versuch, C. albicans Hyphen Bildung in in vivo Darmproben zu studieren, insbesondere Färbung Hefe und Hyphenzellen und quantitative Analyse der Hyphal-Entwicklung. Um die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt zu verstehen, wurde eine Ex-vivo-Methode entwickelt, bei der lösliche Extrakte mit homogenisiertem Darmgehalt von Mäusen verwendet wurden, um die Wirkung von Metaboliten auf die Pilzhyptohypomorphogenese zu untersuchen. Mit Hilfe von Darmproben von Mäusen, die resistent und anfällig für C. albicans GI-Infektion sind, wird diese Methode helfen, die Wirkung von Metaboliten, Antibiotika und Xenobiotika auf Pilzhyptohypomorphogenese im GI-Trakt zu identifizieren und zu studieren.

<table><tbody><tr><td>1 - 10 &Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>100 - 1000 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-400</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>20 - 200 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-451</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>2-Methylbuttersäure</td><td>Sigma</td><td>193070-25G</td><td>hyphal-inhibitorische Verbindung</td></tr><tr><td>488 Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>A11008</td><td>IF Färbung sekundär ab</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>YPD-Agar-Komponente</td></tr><tr><td>Automatisiertes bildgebendes Mikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZX700</td><td></td></tr><tr><td>Candida Albicans Antikörper</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>PA1-27158</td><td>IF Färbung primär ab</td></tr><tr><td>Cefoperazon</td><td>Cayman</td><td>16113</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Desoxycholsäure</td><td>Sigma</td><td>30960</td><td>hyphalhemmende Verbindung</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-500</td><td>Hyphen-fördernde</td></tr><tr><td>Verbindung Pinzette</td><td>Fisher</td><td>08-885</td><td></td></tr><tr><td>Milchsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAAL13242-06</td><td>Hyphenhemmung</td></tr><tr><td>Lithocholsäure</td><td>Sigma</td><td>L6250-10G</td><td>Hyphenhemmung</td></tr><tr><td>Palmitinsäure</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>Hyphenhemmung Verbindung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>IF Färbefixiermittel</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62692</td><td>PBS-Komponente</td></tr><tr><td>p-Tolylessigsäure</td><td>SCBT</td><td>sc-257959</td><td>hyphenhemmende Verbindung</td></tr><tr><td>Sebacinsäure</td><td>Sigma</td><td>283258-250G</td><td>hyphalhemmende Verbindung</td></tr> mit <tr><td>scharfem Ende</td><td>Schere Fisher</td><td>28301</td><td></td></tr><tr><td>steriles Milli-Q Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Misc</td></tr><tr><td>YPD Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>242810</td><td>YPD-Agar-Komponente</td></tr></tbody></table>

ein ex-vivo-assay zur untersuchung von candida albicans hyphal morphogenese im magen-darm-trakt

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt (GI) wird durch verschiedene Umweltsignale streng kontrolliert und spielt eine wichtige Rolle bei der Verbreitung und Pathogenese dieses opportunistischen Pilzerregers. Allerdings sind Methoden zur Visualisierung von Pilzhyphen im GI-Trakt in vivo eine Herausforderung, die das Verständnis von Umweltsignalen bei der Steuerung dieses Morphogenese-Prozesses einschränkt. Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine neuartige ex vivo Methode zur Visualisierung der Hyphalmorphogenese in Darmhomogenatextrakten. Anhand eines Ex-vivo-Assays zeigt diese Studie, dass cecal-Gehalte von antibiotikabehandelten Mäusen, aber nicht von unbehandelten Kontrollmäusen, C. albicans Hyphalmorphogenese im Darmgehalt fördern. Darüber hinaus reguliert das Hinzufügen spezifischer Gruppen von Darmmetaboliten zu den Cecal-Inhalten von antibiotikabehandelten Mäusen die Hyphenmorphogenese ex vivo. Zusammengenommen stellt dieses Protokoll eine neuartige Methode dar, um die Umweltsignale zu identifizieren und zu untersuchen, die die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt steuern.

Diese Ergebnisse zusammen mit früheren Erkenntnissen aus dem Thangamani-Labor60 deuten darauf hin, dass, wenn C. albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, C. albicans in der Regel mit einer Hefemorphologie entwickelt (Abbildung 1B). Wenn jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut, erfährt C. albicans lei...

Der in dieser Studie beschriebene Ex-vivo-Assay mit Darmhomogenat-Extrakten und Immunfluoreszenzfärbung stellt eine neuartige Methode dar, um die Hypahypomorphogenese von Candida albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Umweltsignale zu untersuchen, die den morphogenetischen Übergang im Darm regulieren.

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Das in diesem Video gezeigte Protokoll ermöglicht es uns, die Rolle von Darmmetaboliten bei der Pilzhyphypomorphogenese zu verstehen. Diese ex vivo Technik mehr oder weniger die nächste Annäherung des Darms für die Untersuchung der Pilzhyphypomorphogenese in einer Weise, die keine In-vitro-Studie replizieren kann. Diese Methode kann angewendet werden, um die Rolle von Darmmetaboliten auf andere enterische Krankheitserreger zu untersuchen.Sezieren Sie Mäuse mit autoklavierten sterilisierten scharfsinder Schere und Zange. Nach der Euthanasie, sichern Sie das Tier an einer Sezierfläche, indem Sie alle Gliedmaßen anheften, um den Bauch zu entblößen. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell an Zangen, Scheren oder Darmabschnitten klebt.Verwenden Sie Zangen, um einen Teil der Haut an der Basis des Bauches zu kneifen und zu heben und einen kleinen Schnitt durch die Haut und die zugrunde liegende Faszie zu erstellen, wobei darauf geachtet wird, dass das Cecum oder die Darmwand nicht durchbrochen wird. Erweitern Sie diesen Schnitt auf den Rippenkorb, der die Peritonealhöhle teilweise freilegt, und machen Sie dann einen Schnitt, der an der Stelle des anfänglichen Schnitts auf beiden Seiten beginnt und sich nach oben und seitlich erstreckt. Ziehen Sie diese Klappen seitlich und heften Sie sie an die Sezierender Oberfläche, um die Peritonealhöhle vollständig freizulegen.Extrahieren Sie den GI-Trakt mit Zange, während Sie eine Schere verwenden, um Schnitte zu machen, die dem Magen und der distalen Region des Dickdarms überlegen sind, um die Sammlung der größten Menge an Darmgehalt zu gewährleisten. Achten Sie beim Entfernen des GI-Trakts darauf, dass die einzelnen Komponenten nicht zerbrechen. Trennen Sie den Magen, Dünndarm, Cecum, und Dickdarm an ihren proximalen und distalen Enden.Für die Sammlung von Darminhalten aus jedem Abschnitt, machen Sie einen einzigen Schnitt am distalen Ende, dann manuell den Darminhalt in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Zangen zu vertreiben. Bewahren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius für Ex-vivo-Assays auf. Streifen Sie eine frische Kultur von C.albicans SC5314 auf eine YPD AgarPlatte und bebrüten sie über Nacht bei 30 Grad Celsius.Am nächsten Tag zwei oder drei mittelgroße Einzelkolonien pflücken und in einem Milliliter PBS wieder aussetzen. Holen Sie gefrorenen Darminhalt aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie bei 25 Grad Celsius auf. Etwa 150 Milligramm Darminhalt in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr geben und mit 150 Mikroliter PBS wieder aufhängen.Wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit an, um den Darminhalt zu homogenisieren und sie etwa eine Minute bei Raumtemperatur sitzen zu lassen. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1.000 mal G für drei Minuten, dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr, wobei darauf geachtet wird, keine Trümmer zu übertragen. Nach der Wiederholung der Zentrifugation 10 Mikroliter des C.albicans inoculum inoculum zum Überstand geben, gut mischen und die Probe vier bis fünf Stunden bei 37 Grad Celsius bebrüten.Um die Wirkung von exogenen Metaboliten auf C.albicans zu testen, fügen Sie die gewünschte Konzentration von Metaboliten in den Darmgehalt und das PBS-Gemisch ein, wirbeln Sie die Probe dann 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit aus, lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen und zentrifugieren und impfen, wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie die Pilzzellkultur bei 1.000 mal G für zwei Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fixieren Sie die Proben in 100 Mikroliter von 2%PFA für 15 Minuten, dann wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie die Proben zweimal mit einem Milliliter PBS nach Manuskriptanweisungen, dann inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter PBS mit polyklonenem C.albicans Antikörper für 30 Minuten. Nach der Inkubation, waschen Sie die Probe drei weitere Male mit PBS, arbeiten in dim Licht, um Photobleicharbeiten zu vermeiden. In einem dunklen Raum die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten in 100 Mikroliter PBS mit Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Antikörper bei einer verdünnungsgemäßen ein bis 500.Nachdem Sie die Probe dreimal mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, setzen Sie sie in 100 Mikroliter PBS wieder auf und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf eine 96-Well-Platte. Stellen Sie die Pilzzellen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsmikroskop mit 20X- und 40X-Objektivlinsen und einem grünen Fluoreszenzproteinfilter ab. Wenn C.albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, entwickelt es sich in der Regel mit einer Hefemorphologie.Wenn C.albicans jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, erfährt es leicht einer Morphogenese, die zu Hefe- und Hyphenformen führt. Dies deutet darauf hin, dass die Behandlung von Antibiotika Veränderungen in der zekalen Umgebung verursacht, die eine Hyphalmorphogenese von C.Albicans induzieren. Die exogene Zugabe von Glukose zum Cecal-Homogenat von antibiotikabehandelten Mäusen zeigte eine massive Hyphalentwicklung ex vivo.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zugabe von Darmmetaboliten zurück zum Cecal-Homogenat der antibiotikabehandelten Mäuse die Morphogenese von C.albicans differenziell reguliert. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Optimierung der Verdünnung des Darmgehalts eine ausreichende Sammlung von Darmmetaboliten ohne Sammlung von Schmutz sicherstellt. Überschreiten Sie nicht eine Verdünnung des Medien-zu-Darm-Inhalts von zwei zu eins und zielen Sie nach Möglichkeit auf eine geringere Verdünnung ab.Diese Technik wird jetzt verwendet, um zu erforschen, wie spezifische Metaboliten in der Darm-Wirkung Hyphal-Entwicklung, so dass Forscher besser verstehen, die Rolle der Darmmetaboliten auf Pilz pathogenese.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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