Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Die DC-ERG-Technik kann zur nicht-ausweichenden Bewertung der retinalen Pigmentepithelfunktion eingesetzt werden, um altersbedingte Veränderungen oder Dasentwicklung seuchen zu überwachen und pharmakologische Interventionseffekte zu bewerten. Diese Technik verbessert die DC-ERG-Reproduktionsfähigkeit und die einfache Anwendung durch die Vereinfachung der Kapillarelektrodenvorbereitung. Es kann auch mit einer Standard-Ohm-Software-Anwendung ergänzt werden, um die Analyse zu erleichtern.

Beginnen Sie mit dem vorsichtigen Schieben einer 25-Spur-Spritzennadel durch die Silikon-Gummidichtung an die Rückwand des Elektrodenhalters. Füllen Sie die Basis des Elektrodenhalters mit entgastem HBSS, während Sie die Nadel langsam zurückziehen, wobei darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen, und ersetzen Sie die Gewindekappe ohne Anziehen. Setzen Sie die Spritzennadel wieder ein, um den leeren Raum innerhalb des Spalts mit HBSS zu füllen, und halten Sie die Kapillare horizontal während der Füllung, um zu verhindern, dass die Lösung vom anderen Ende entweicht.

Greifen Sie die gefüllte Kapillare am gebogenen Ende, legen Sie langsam das andere Ende durch die gelockerte Kappe ein und ziehen Sie die Schraubkappe an Ort und Stelle. Neigen Sie die Elektrodenhalter mit den nach oben gerichteten Kapillarelektroden, damit Blasen ausfließen können, und entgasen Sie die Kapillaren in einer Vakuumkammer für fünf bis zehn Minuten. Dann lassen Sie das Vakuum langsam los und füllen Sie die Elektrodenhalter und Glaskapillaren wieder auf, wie gezeigt.

Um einen benutzerdefinierten Ständer für den Mikroelektrodenhalter zu machen, entfernen Sie die schwarzen Polyacetal-Clips von einer Seite eines T-Clips der Nummer acht und verwenden Sie einen Zylindersockel mit magnetischen Kugelverbindungen, die in der Hälfte bearbeitet werden, um die Höhe einzustellen. Befestigen Sie die modifizierten T-Clips an den magnetischen Kugelbefestigungsschrauben mit M3-Muttern und einem Schlitten in etwa einem Zoll verjüngten Holzgriff, modifiziert von einem Baumwollspitzen-Reinigungsstab, in den Ständer in einem Winkel, um den Mikroelektrodenhalter in den maßgeschneiderten T-Clip Magnetkugelgelenkständer zu befestigen. Verwenden Sie dann den Zylinderboden für Seltenerdmagnete, um den kundenspezifischen Elektrodenhalter sicher auf der Metallplatte der Bühne zu positionieren, was eine 360-Grad-Drehung auf einer 180-Grad-Achse ermöglicht.

Um einen Elektrodentest durchzuführen, senken Sie zunächst die vollständig montierten HBSS-gefüllten Kapillarmikroelektroden vorsichtig in einen kleinen Behälter mit HBSS. Legen Sie die Nadelmasseund die silberne, silberchloridzentrierte Pellet-Referenzelektrode in dieselbe HBSS, um den Schaltkreis abzuschließen, und wählen oder erstellen Sie eine geeignete Kennung, um die zu prüfende Maus zu beschreiben. Um das direkt gekoppelte Elektroretinogrammprotokoll auszuwählen, klicken Sie auf Protokolle und wählen Sie DC-ERG aus.

Klicken Sie auf Ausführen. Ein Dialogfeld mit den Patienteninformationen wird angezeigt. Wenn die Informationen korrekt sind, klicken Sie auf Ja, und fahren Sie mit Den Schritten von sechs fort.

Schließen Sie die Türen zum Faraday-Käfig, und klicken Sie auf Impedanz, um den Impedanzmodus anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass die Werte für mundbezogen, Schwanzmasse und Aufzeichnungselektroden akzeptabel sind, und klicken Sie auf Schritt, um mit Schritt vier von sechs fortzufahren, um die Ausgangsstabilität zu testen. Um mit der Anzeige der Ablaufverfolgungen zu beginnen, klicken Sie auf Vorschau.

Die Spuren sollten mit einer Spitzen-zu-Spitzen-Amplitude von weniger als 200 Mikrovolt gering sein. Um die Maus und die Elektroden für ein Experiment zu positionieren, befeuchten Sie die Hornhaut einer sedierten Maus mit einem Tropfen von 5%proparacainischer Salzsäure, bevor Sie die Hornhaut mit einem Tropfen von 2,5% Phenylephrin HCL und 5% Tropicamid erweitern. Überprüfen Sie in der ERG-Systemsoftware, ob der richtige Patient ausgewählt ist.

Klicken Sie auf Protokolle. Wählen Sie unter Protokollbeschreibung DC-ERG aus, und klicken Sie auf Ausführen. Klicken Sie auf Ja, um zu überprüfen, ob der richtige Test durchgeführt wird.

Verwenden Sie Schritt eins von sechs, um ein dim rotes Licht in der Kuppel einzuschalten und die Maus auf einen beheizten Aufnahmetisch zu legen. Verwenden Sie Zange, um die Haut des hinteren Beins vorsichtig zu zelten. Und mit einer Hand, um die Nadelelektrode fest zu halten, verwenden Sie die andere Hand, um die Elektrode subkutan in das hintere Bein einzufügen, um die Elektrode an Ort und Stelle zu befestigen.

Legen Sie die Referenzsilber, Silberchloridelektrode in den Mund des Tieres, so dass das zentrierte Pellet entlang der hinteren Wange ruht und hinter den Zähnen gehalten wird. Bevor Sie die Kapillarelektroden auf das Auge legen, positionieren Sie den Elektrodenhalter mit den vertikal ausgerichteten Glaskapillaren und streichen Sie den Elektrodenhalter mit einem Zeigefinger, um eventuelle Blasen zu entfernen. Verwenden Sie eine 25-Spur-Nadel, um die Kapillarspitzen mit HBSS zu füllen und die Kapillaren zu inspizieren, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in den Spitzen gefangen sind.

Positionieren Sie den Elektrodenhaltersoals so, dass die offenen Spitzen der HBSS-gefüllten Kapillaren in schonendem Kontakt mit der Hornhaut stehen. Und achten Sie darauf, blasen zu vermeiden, invertieren Sie den Schmierauge-Gelspender, um die ersten Tropfen zu entsorgen. Legen Sie dann einen Tropfen Schmiermittel-Augengel auf jedes Auge, um die Leitfähigkeit aufrechtzuerhalten und die Austrocknung während der Aufnahme zu verhindern.

Um die DC-ERGs aufzuzeichnen, klicken Sie auf Schritt fünf, um Schritt fünf von sechs auszuwählen, und klicken Sie auf Impedanz, um den Bildschirm zur Impedanzüberprüfung zu verwenden, um die Widerstände der linken und rechten Augen zu untersuchen. Die Impedanzwerte für die Aufnahmeelektroden an jedem Auge sollten ähnlich sein. Und die Impedanzwerte für die Boden- und Referenzelektroden sollten weniger als 10 Kilohm sein.

Klicken Sie auf Vorschau, um die Spuren für die linke und rechte Augen anzuzeigen, und warten Sie bis zu 10 Minuten, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Klicken Sie dann auf Beenden, um die Ablaufverfolgungsvorschau zu beenden, und klicken Sie auf Ausführen, um die Aufzeichnung zu starten. Hier wird ein Beispiel-Dataset von bedingten Knockout- und Wildtyp-Mäusen gezeigt.

Bei dieser Analyse litt die Spur unter winzigen Blasen in der Elektrode. Es erhöhte den Spitzenlärm in der Spur. In einer separaten Analyse wurden die Blasen mit hilfe der Vakuumkammer eliminiert, bevor die Mikroelektroden im Elektrodenhalterständer montiert wurden.

Die am besten passenden Linien zu den ersten 25 Sekunden können berechnet werden, so dass die driftkorrigierten Antworten nachgezeichnet und die Amplituden der DC-ERG-Komponenten identifiziert werden können. Wie erwartet dämft eine reduzierte Expression von Kur7.1 Kaliumkanälen im RPE die c-Welle und die schnelle Schwingung stark, was auf eine signifikante Beeinträchtigung der elektrischen Eigenschaften des retinalen Pigmentepithels hindeutet. Hier werden die relativen Amplituden der DC-ERG-Komponenten gezeigt, die auf Wildtyp normalisiert und gegen die relativ en beiden größten lichtevokierten A-Wellen-Amplituden geplottet werden.

Diese Form der Analyse kann bestimmen, ob die reduzierten elektrischen Reaktionen des RPE allein durch die Verringerung der Photorezeptoraktivität berücksichtigt werden können. Oder wenn ein zugrunde liegender Defekt aus dem RPE stammt. Denken Sie daran, eine stabile Ausgangsbasis zu erreichen, bevor Sie zur Mausaufnahme übergehen, und die Elektroden regelmäßig auf Blasen überprüfen, die möglicherweise eingeführt wurden.

Dunkel angepasste ERGs können vor dem DC-ERG aufgezeichnet werden, um die kegelgesteuerte Netzhautfunktion zu messen. Lichtangepasste ERGs können auch nach dem DC-ERG durchgeführt werden, um die kegelgesteuerten Netzhautreaktionen zu bewerten.