Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

Die Isolierung von primären Osteozyten ist ein langwieriges Verfahren, das in niedrigzelligen Bereichen oft ausgelassen. Dieses Protokoll bietet effiziente Methoden zur Isolierung einer großen Anzahl primärer GFP-exprimierender Osteozyten. Dieses Protokoll reduziert die Bearbeitungszeit und ermöglicht die Gewinnung einer höheren Anzahl von Osteozyten in einem einzigen Verfahren mit minimaler Kontamination durch hämatopoetische oder mesenchymale Zellen.

Für die Isolierung von GFP-exprimierenden Osteozyten legen Sie eingeschläferte transgene Mausbabys nach der Geburt sechs bis sieben in eine unbehandelte Kulturschale und greifen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis. Machen Sie mit der Schere einen ersten Schnitt in die angehobene Haut, gefolgt von Schnitten entlang beider Seiten des Schädels vor den Ohren. Entfernen Sie die Haut, um die Schädeldecke freizulegen, und halten Sie den Kopf vom Nasenrücken fern, schneiden Sie die Schädeldecke entlang der Lamboidnaht und entlang der Ränder der Scheitelknochen zum vorderen Teil des Gewebes.

Trennen Sie die Schädeldecke vom darunter liegenden Hirngewebe und platzieren Sie die Knochen mit der konkaven Seite nach oben in PBS. Um die erste Fraktion zu erhalten, werden bis zu fünf Kalvarienberge pro 50-Milliliter-Röhrchen in fünf Millilitern frisch zubereiteter Kollagenase mit zwei Milligramm pro Milliliter gepoolt und das Gewebe 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 300 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Am Ende der Inkubation verwerfen Sie den Aufschluss aus der ersten Fraktion und waschen Sie die Schädeldecke mit fünf Millilitern PBS.

Ersetzen Sie die Wäsche durch fünf Milliliter fünfmillimolares EDTA, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin in PBS für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am Ende der Inkubation überführen Sie den Aufschluss in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Calveria mit fünf Millilitern PBS. Übertragen Sie dann die Waschlösung in den Auftragschluss.

Um die zweite Fraktion zu erhalten, wird der Aufschluss zur Zentrifugation eingelegt und der Überstand verworfen. Suspendieren Sie das Pellet in acht Millilitern essentiellem Alpha-Minimum-Medium, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) und Antibiotika enthält, und säen Sie die Zellen auf eine 10 Zentimeter große Kulturschale. Legen Sie dann die Fraktion zwei Zellen in den Zellkultur-Inkubator.

Nach dem Sammeln und Kultivieren der Fraktionen drei und vier, wie gerade gezeigt. Inkubieren Sie die Calveria in fünf Millilitern fünf-millimolarem EDTA, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin in PBS, für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am Ende der Inkubation wird die fünfte Fraktion entnommen und kultiviert, wie für die Fraktionen zwei, drei und vier gezeigt.

Sammeln Sie die Zellen unmittelbar nach der Fraktionierung für die Sortierung. Alternativ können Sie die Zellen nach 24-stündiger Kultur sammeln, indem Sie das Medium aspirieren und die Zellen zweimal vorsichtig mit 10 Millilitern PBS pro Schale und Spülgang waschen. Behandeln Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen mit fünf Millilitern 0,5 % EDTA in PBS pro Platte.

Geben Sie nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius fünf Milliliter vollständiges Alpha-Minimum Essential Medium in jede Platte und lösen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren. Um die Zellen in jeder Fraktion zu kombinieren, filtrieren Sie die Zellsuspensionen durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nachdem Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS gewaschen haben, geben Sie sie in das Röhrchen.

Filtrieren Sie die Zellen durch ein Sieb und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Sobald die Zellen pelletiert sind, suspendieren Sie das Pellet in vollständigem, minimalem essentiellem Medium auf eine Siebtelzellzahl von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter und filtrieren Sie die Zellen durch ein 35-Mikron-Nylonnetzrohr mit Deckel. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu testen, wurden die Fraktionen separat sortiert und 24 Stunden lang kultiviert, um den Prozentsatz und die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion zu bestimmen.

Die Dichte der Osteozyten in den Fraktionen zwei bis fünf war höher als in der ersten Fraktion und nahm in den Fraktionen sechs, sieben und acht bemerkenswert ab. Obwohl der Prozentsatz der Osteozyten, der zwischen allen Fraktionen erhalten wird, statistisch nicht signifikant ist, unterscheidet sich die Dichte der Osteozyten dramatisch zwischen den Fraktionen. Hier wird die Gating-Strategie zur Isolierung von GFP-positiven Osteozyten von ihren GFP-negativen Gegenstücken durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gezeigt.

Nach der Sortierung können Osteozyten auf die Expression von Osteozytenmarkern von Interesse analysiert werden. In dieser Analyse wurden die Osteozyten-Markergene in den isolierten GFP-positiven Osteozyten in höheren Konzentrationen exprimiert als in der Vorsortierungsfraktion zwei, die als hohe Osteoblastenfraktion bekannt ist. Hier kann die Morphologie eines GFP-positiven Osteozyten beobachtet werden, der nach 24-stündiger Kultivierung auf einer plastischen Kulturschale eine Sternform mit Dendriten beibehält, die sich vom Zellkörper aus erstrecken.

Achten Sie beim Absaugen der Aufschlüsse darauf, dass die Calveria zu winzigen Pellets zerkleinert wird. Denken Sie daran, einen Aspirator mit kleiner Spitze zu verwenden, um Zellverlust zu vermeiden. Osteozyten sind rätselhaft, weil sie in Knochen begraben sind.

Diese Technik hat den Weg für die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen von Osteozyten und ihrer Kontrolle über Osteoklasten und Osteoblasten geebnet.