Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Dieses Protokoll ermöglicht die zerstörungsfreie Bildgebung mit einer Auflösung von intakten oder weichen Labormikrometern. Es kann verwendet werden, um Mechanismen der Physiologie, Anatomie und Entwicklung von Tieren zu verstehen. Da die Fliegen in einem intakten Zustand abgebildet werden, ohne dass eine Gewebedissektion erforderlich ist, bleibt die räumliche Architektur von Gewebe und Organen in ihrem ursprünglichen Zustand erhalten und kann leicht beobachtet werden.

Die Mikro-CT ist ein ideales Werkzeug für Studien, die darauf abzielen, menschliche Krankheiten bei Fliegen zu modellieren oder Entwicklungsstörungen zu verstehen, die die Lebensqualität beeinträchtigen. Es hat sich auch in anderen Disziplinen wie Ingenieurwissenschaften, Physik, Materialwissenschaften, Geologie und Anthropologie als nützlich erwiesen. Nachdem Sie den für die Bildgebung interessierenden Entwicklungszeitpunkt ausgewählt haben, werden 5 bis 20 Tiere in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einen Milliliter PBST überführt und das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit regelmäßigem Klopfen inkubiert, um die Entfernung der hydrophoben Beschichtung zu unterstützen und den Tieren ein vollständiges Eintauchen zu ermöglichen.

Ersetzen Sie am Ende der Inkubation den PBST durch einen Milliliter Bouin-Lösung und klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Fliegen vollständig einzutauchen. Bei Larven- und Puppenproben werden die Tiere nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur dreimal für fünf Minuten und ein Milliliter frisches PBS pro Waschgang gewaschen. Übertragen Sie die Proben nach dem letzten Waschen in eine Multi-Well-Präparierschale mit frischem PBS pro Vertiefung unter einem Präpariermikroskop und stechen Sie mit einem kleinen winzigen Stift, der an einem Halter befestigt ist, ein Loch in die vordere und hintere Nagelhaut jeder Probe, wobei Sie darauf achten, dass das darunter liegende Weichgewebe nicht beschädigt wird.

Nach dem Eindringen in die Nagelhaut inkubieren Sie die Proben 24 Stunden lang in einem Milliliter frischer Bouin-Lösung in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur, bevor Sie die Probe dreimal 30 Minuten lang und einen Milliliter eines Mikro-CT-Waschpuffers pro Waschgang waschen. Geben Sie nach der letzten Wäsche einen Milliliter der entsprechenden Färbelösung in das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben zwei bis sieben Tage lang bei Raumtemperatur. Wenn eine längere Bildkonservierung erforderlich ist, dehydrieren Sie die Proben innerhalb der aufsteigenden Ethanolreihe wie angegeben eine Stunde lang in einem Milliliter Ethanol pro Konzentration, um die Proben für die Trocknung an kritischen Punkten vorzubereiten.

Um an kritischen Punkten getrocknete Proben zu montieren, legen Sie die Proben in Kunststoff- oder Glaskapillarröhrchen, bevor Sie die Röhrchen auf den rotierenden Tischhalter montieren. Füllen Sie für die Aufnahme hydratisierter Proben eine P10-Pipettenspitze mit Wasser und befestigen Sie das schmale Ende mit Paraffinfilm. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine einzelne Probe auf die Pipettenspitze zu übertragen, und schieben Sie die Probe mit einem langen, schlanken Gegenstand vorsichtig nach unten in die Spitze, bis sie gerade noch die Wand der Spitze berührt, um die Probe an Ort und Stelle zu halten.

Nachdem Sie das offene Ende der Pipette abgedeckt haben, montieren Sie die P10-Pipette auf eine Halterung, die so konzipiert ist, dass sie in den Unterlegkeil des rotierenden Tisches passt. Klicken Sie zum Scannen in der Scannersoftware auf das Symbol "Tür öffnen", um Zugang zum rotierenden Tischkeil zu erhalten, und ziehen Sie den Kragen um die Basis des Probenhalters fest, um die Probe zu befestigen. Stellen Sie die Scanparameter in der Software auf optimale Auflösung und Kontrast ein und klicken Sie auf Optionen und Röntgenquelle, um die Leistungssteuerung der Röntgenquelle zu öffnen.

Stellen Sie mit den Schiebereglern die Röntgenspannung auf 30 bis 40 Kilovolt und den Strom auf 100 bis 110 Mikroampere ein, um einen Röntgenstrahl mit drei bis vier Watt Leistung und kleiner Punktgröße zu erzeugen. Um die Anzahl der Projektionsbilder festzulegen, die während der Scans aufgenommen werden sollen, wählen Sie Optionen und Aufnahmemodi, um die Belichtungszeit der Kamera auf 500 bis 800 Millisekunden einzustellen, und verwenden Sie den Schieberegler, um die gewünschte Bildpixelgröße entsprechend den Kameraeinstellungen und der Kameraposition einzustellen. Klicken und ziehen Sie den Schieberegler, um das Sample entlang seines 360-Grad-Drehpfads zu verschieben und das Sample innerhalb des Sichtfelds zu halten.

Klicken Sie auf das Symbol "Akquise starten". Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie zusätzliche Scanparameter einstellen können. Benennen Sie die Datei und den Ausgabeordner, in dem der Scan gespeichert werden soll.

Stellen Sie die zufällige Bewegung auf 10 und den Durchschnitt auf vier bis sechs Bilder ein. Der Rotationsschritt wird automatisch in Abhängigkeit von den verwendeten Kameraeinstellungen berechnet, und klicken Sie dann auf OK, um die Aufnahme zu starten. Ein Dialogfeld mit dem Fortschrittsbalken mit der Scanzeit wird angezeigt, und der Scanner beginnt mit der Aufnahme einer Reihe von Projektionsbildern der Probe entlang des Rotationspfads.

Um die Tomogramme zu erzeugen, öffnen Sie die Projektionsbilder in der Rekonstruktionssoftware und wählen Sie den Verschiebungskorrekturalgorithmus aus, um eine erste Bildausrichtung durchzuführen. Wählen Sie den besten Wert aus, mit dem die Projektionsbilder richtig ausgerichtet werden, und klicken Sie auf Feinabstimmung, um die einzelnen Rekonstruktionsparameter fein abzustimmen. Es wird eine Reihe von Vorschaubildern generiert, mit denen die richtigen Werte ausgewählt werden können.

Vergewissern Sie sich, dass die optimalen Parameterwerte auf der Registerkarte Einstellungen angezeigt werden, und passen Sie auf der Registerkarte Ausgabe die Dateiparameter wie Bittiefe, Dateiname und Ordner an, in dem die Daten gespeichert werden. Ein Interessenbereich kann verwendet werden, um nur die interessierenden Strukturen zu rekonstruieren. Wenn mehrere Rekonstruktionen erforderlich sind, klicken Sie auf Start und Zum Stapel hinzufügen, um das aktuelle Bild zum Stapelmanager hinzuzufügen und die Rekonstruktion für die verbleibenden Bilder zu wiederholen.

Für die morphometrische Analyse der rekonstruierten Bilder klicken Sie auf der Registerkarte Segment in einem geeigneten Softwareprogramm für die morphometrische Analyse auf Einfach und Neu, geben Sie dem Bild einen neuen Namen, und wählen Sie eine geeignete Farbe aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich definieren und passen Sie den Schieberegler an, um den Schwellenwertbereich anzupassen, der die gewünschte Struktur umfasst. Um einen durch den Schwellenwert definierten Bereich zu malen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten.

Um einen Bereich zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Stellen Sie sicher, dass die Messungen des interessierenden Netzbereichs im Informationsbereich für die grundlegende morphometrische Analyse angezeigt werden. Rendern Sie das Mesh-Objekt und das gesamte Tomogrammbild, visualisieren Sie das resultierende Bild in 3D, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um Movie Maker anzeigen auszuwählen, um ein Video des Objekts mit einzelnen Bildern aus dem Viewer zu generieren.

Auf diesen Bildern sind ein Embryo, eine Larve im dritten Stadium, eine Puppe im Ferratenstadium und eine erwachsene weibliche Fliege zu sehen, die mit Jod gefärbt und mit einem handelsüblichen Tischscanner in Wasser abgebildet wurden. Eine hervorragende Konservierung und gleichmäßige Färbung des empfindlichen Gewebes ist offensichtlich, so dass alle wichtigen Organe leicht identifiziert werden können. Hier wird ein Vergleich des gleichen Fliegenkopfgehäuses für Erwachsene gezeigt, das sowohl im langsamen als auch im schnellen Projektionsmodus aufgenommen wurde.

Wichtig ist, dass, obwohl die Auflösung in den langsamen Bildern höher ist, die morphometrische Analyse nicht zwischen den langsamen und schnellen Scans unterscheidet. Mit der Rendering-Software kann jedes Gewebe- oder Organsystem von Interesse segmentiert und für die morphometrische Analyse und 3D-Visualisierung verwendet werden. Auf diesen Bildern ist ein mit Phosphotungstinsäure gefärbter Fliegenbauch zu sehen, der mit Wasser hydratisiert oder nach einer Trocknung des kritischen Punktes am Röntgenmikroskop abgebildet wurde.

Mit Hilfe von Phosphowolframsäure lassen sich einzelne Epithelzellen des Mitteldarms und Spermienbündel innerhalb der Hoden leicht auflösen. Während die Bilder der Trocknung an kritischen Punkten im Vergleich zur hydratisierten Probe eine geringfügig höhere Auflösung aufweisen, wird mit hydratisierten Proben, wie z. B. den Fettzellen in der Nähe der Kutikula, eine bessere Erhaltung der Ultrastruktur empfindlicher Gewebe erreicht. Begrenzen Sie für die beste Auflösung Probenbewegungen und übermäßige Vibrationen.

Die Sicherung der Probe auf dem Tisch ist dafür von entscheidender Bedeutung, obwohl Kreativität und Einfallsreichtum erforderlich sein können, um dies zu erreichen. Zusätzliche bildgebende Verfahren wie Licht- und Elektronenmikroskopie können als Teil eines bildgebenden Workflows eingesetzt werden, um eine gegebene Genmutation von der Nanoskala auf den gesamten Organismus zu verstehen.