Name: Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Lernen Sie die nicht-destruktive Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikro-CT für Entwicklungsbiologie und Krankheitsmodellierung. Diese Methode bewahrt die native Gewebearchitektur.

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Nichts davon wäre ohne die Unterstützung von Nasser Rusan möglich gewesen. Ich möchte H. Doug Morris, Danielle Donahue und Brenda Klaunberg von der NIH Mouse Imaging Facility und Ben Ache von Micro Photonics für das Training und die hilfreiche Diskussion danken. Ich danke auch Mansoureh Norouzi Rad von Zeiss für das Scannen von Bauchproben auf der Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith und Rachel Ng halfen auch beim Scannen. Mike Marsh von Object Research Systems leistete technischen Support bei Dragonfly. Ich bin auch dankbar für die Unterstützung des National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) und der Start Up Funds der University of Wyoming. Ich danke auch den anonymen Rezensenten für ihre hilfreichen Vorschläge und Kommentare.

1. Probenauswahl und Nagelhautvorbereitung
<ol><li>Wählen Sie den geeigneten Entwicklungszeitpunkt (Embryo, Larve, Puppe oder Erwachsener) für die Bildgebung.<ol>
<li>Für Embryonalstadien Käfigweibchen auf Traubensaft-Agarplatten mit Hefepaste beschmiert und Eier alle 30-60 Minuten sammeln. Lassen Sie diese Embryonen bei 25 °C entwickeln, bis das richtige Stadium erreicht ist.</li>
		<li>Für Larvenstadien sammeln Sie erste und zweite Instars aus zeitnahen Embryonentnahmeexperimenten. Wählen Sie direkt wandernde3. Instars von der Seite des Lebensmittelfläschchens unter nicht überlaufenden Bedingungen.</li>
		<li>Sammeln Sie für das Puppen-Timing weiße Präpuppen (invertierte Spiralen) und notieren Sie sich die Zeit, zu der die Nagelhaut zu bräunen beginnt. Die Tiere durchlaufen 15 Stadien der Puppenentwicklung zu definierten Zeitpunkten nach der Bräunung der Kutikula und können entsprechend gesammelt werden42.</li>
		<li>Sammeln Sie Erwachsene nach der Eklosion als Jungfrauen und lassen Sie sie für eine erforderliche Zeit in einer Durchstechflasche altern (z. B. 5 Tage für eine vollständige Darmentwicklung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>5-50 Tiere werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 0,5% Triton X-100 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,5% PBST) gegeben. Während Sie das Rohr regelmäßig auf der Tischplatte klopfen, inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT), um die Entfernung der hydrophoben Beschichtung zu unterstützen und die Tiere vollständig untertauchen zu lassen.<ol>
<li>Für Embryonal-, Larven- und Puppenstadien die weitere Entwicklung aufhalten, indem Sie das Röhrchen für 20 s in einen hitzeblock auf 100 °C eingestellten Wärmeblock legen, gefolgt von einer Abkühlung bei RT für 5 min. HINWEIS: Tiere können auch in flüssigem Stickstoff eingefroren werden37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixierung und Färbung
<ol><li>Entfernen Sie 0,5% PBST und fügen Sie 1 ml Bouin's Solution hinzu. Klopfrohr, um sicherzustellen, dass die Tiere vollständig untergetaucht sind. ACHTUNG: Bouin's Solution enthält Formaldehyd. Es kann akute Toxizität für Haut und Augen verursachen, wenn es verschüttet wird, und kann tödlich sein, wenn es verschluckt wird. Tragen Sie bei der Handhabung Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. HINWEIS: Zusätzliche Fixierungstechniken können ebenfalls verwendet werden, z. B. die Verwendung von Ethanol. Die Vorzüge anderer Fixiermittel sind in Referenz1,30ausführlich beschrieben.<ol>
<li>Für Embryo- und Erwachsenenproben 16-20 h bei RT auf der Tischplatte inkubieren.</li>
		<li>Für Larven- und Puppenproben die Tiere für 2 h bei RT fixieren. Bouins Lösung verwerfen und dreimal mit 1x PBS 5 min waschen. Auf eine Multi-Well-Sezierschale mit 1x PBS übertragen und mit einem kleinen Minutien-Stift, der an einem Halter befestigt ist, ein Loch in die vordere und hintere Nagelhaut stechen, wobei darauf geachtet wird, dass kein darunter liegendes Weichgewebe gestört wird.</li>
		<li>Geben Sie Larven- und Puppenproben zurück in ein Mikrofugenröhrchen und fügen Sie 1 ml frische Bouin-Lösung hinzu. Inkubieren Sie auf der Tischplatte für 24 Stunden bei RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin's Solution entfernen und die Probe 30 min lang mit 1 ml μ-CT Wash Buffer (0,1 M Na2HPO4,1,8% Saccharose) oder 1x PBS dreimal waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml der entsprechenden Färbelösung hinzu und inkubieren Sie sie 2-7 Tage lang auf der Tischplatte. HINWEIS: Die Wahl der Flecken hängt von vielen Faktoren ab, ist aber im Allgemeinen ein Gleichgewicht zwischen Penetration, Inkubationszeit und Auflösung. Im Allgemeinen bietet Phosphowolframatstiksäure (PTA) einen überlegenen Kontrast und eine bessere Auflösung des Weichgewebes, erfordert jedoch eine mechanische Störung der Nagelhaut und längere Inkubationszeiten. Die Vorzüge verschiedener Fleckentypen sind in Referenz1ausführlich beschrieben.<ol>
<li>Zur Jodfärbung verwenden Sie 1 ml 0,1 N I2KI (Lugol Solution). 2 Tage inkubieren. Eine weitere Störung der erwachsenen Nagelhaut ist nicht notwendig.</li>
		<li>Für die Phosphowolframatstiksäure (PTA)-Färbung verwenden Sie 1 ml einer 0,5% igen (w/v) Lösung, die in Wasser verdünnt ist. Stören Sie die erwachsene Nagelhaut, indem Sie entweder die Mundstücke entfernen oder Löcher in den Thorax oder die Bauchkutikula mit einem kleinen Minutienstift stoßen, der an einem Halter befestigt ist. Inkubieren Sie für 5-7 Tage oder länger, wenn die Gewebefärbung nicht homogen erscheint.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit 1 ml Reinstwasser oder 1x PBS 30 min waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt. Lagern Sie Tiere bei RT in Reinstwasser oder 1x PBS für bis zu einem Monat.</li>
	<li>Wenn Tiere gescannt werden sollen, während sie hydratisiert sind, fahren Sie direkt mit Abschnitt 4 fort. Wenn eine längere Konservierung der Probe erforderlich ist, fahren Sie mit Abschnitt 3 des Protokolls fort.</li>
</ol>3. Trocknung kritischer Punkte (optional)
<ol><li>Führen Sie eine Ethanol-Dehydratisierungsreihe (EtOH) an der Probe durch: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Fügen Sie 1 ml der EtOH-Lösung hinzu und inkubieren Sie auf der Tischplatte für 1 h für jede Konzentration in der angegebenen Reihenfolge.</li>
	<li>Nach dem letzten 100% EtOH Einweichen durch frisches 100% EtOH ersetzen und die Probe über Nacht auf dem Tisch inkubieren lassen.</li>
	<li>Führen Sie die Trocknung von Proben an kritischen Stellen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. HINWEIS: Elektronenmikroskopische Einrichtungen verfügen in der Regel über eine Trocknungsmaschine für kritische Punkte (siehe Materialtabelle),die die Trocknung der Probe nach etOH-Dehydratisierung durchführt.</li>
</ol>4. Probenmontage
<ol><li>Für kritisch punktgetrocknete Proben Heißleimproben auf einen Insektenstift oder einen anderen Halter, der so konzipiert ist, dass er in das Futter der rotierenden Stufe passt, oder legen Sie ihn in ein Kapillarrohr aus Kunststoff oder Glas (~ 1,0-1,25 mm Innendurchmesser).</li>
	<li>Für hydratisierte Proben füllen Sie eine P10-Pipettenspitze mit Wasser und sichern Sie das schmale Ende entweder durch Heißsiegelung oder Paraffinfilm, um ein Auslaufen zu verhindern. ACHTUNG: Achten Sie darauf, alle Verbindungen fest einzuwickeln, damit kein Wasser in den Scanner austritt und Schäden verursacht.<ol>
<li>Übertragen Sie eine einzelne Probe mit einer Zette auf die Pipettenspitze. Drücken Sie die Probe vorsichtig mit einem langen, schlanken Gegenstand, z. B. einer abgestumpften 20-G-Nadel oder einer anderen Pipettenspitze, die Spitze hinunter, bis sie nur noch die Wand der Pipettenspitze kontaktiert, um sie an Ort und Stelle zu halten.</li>
		<li>Decken Sie die Öffnung der Pipettenspitze mit Paraffinfilm ab, um die Verdunstung von Wasser bei langen Scans zu verhindern.</li>
		<li>Montieren Sie die P10-Pipette mit einer Halterung, die in das Futter der Drehstufe passt (Abbildung 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Scannen
<ol><li>Führen Sie alle erforderlichen Kalibrierungen der Maschine durch, bevor Sie für den Tag abbilden. HINWEIS: Diese variieren je nach Hersteller und es wird empfohlen, sich mit einem Anwendungsspezialisten in Verbindung zu setzt, um die richtigen Schritte zu bestimmen. Spezifische Informationen zum Setup und zur Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Im Allgemeinen bieten Kalibrierungen wie eine Ausrichtung der Bühnenachse, um jegliches "Wackeln" zu entfernen, das mit dem Spannfutter verbunden ist, das relativ zur rotierenden Stufe außerhalb der Achse liegt, und die Durchführung von Flachfeldkorrekturen, um einheitliche Hintergrundpixeldicken auf der Kamera sicherzustellen, optimale Bildbedingungen für die beste Auflösung und Datensätze, die über mehrere Scans hinweg vergleichbar sind.</li>
	<li>Öffnen Sie die Scannertür, um Zugang zum rotierenden Bühnenfutter zu erhalten, indem Sie auf das Symbol "Tür öffnen" in der oberen linken Ecke der Software klicken. Befestigen Sie die Probe, indem Sie den Kragen um die Basis des Probenhalters festziehen. HINWEIS: Verwenden Sie sanften Druck, wenn Sie die Probe am rotierenden Futter befestigen, um die Ausrichtung des Scanners aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Scanparameter in der Software ein, die den Scanner steuert, um eine optimale Auflösung und einen optimalen Kontrast zu erreichen. HINWEIS: Diese müssen empirisch bestimmt werden, da die Röntgenquelle, die Kamera/der Detektor und die Geometrie jedes Scanners je nach Hersteller variieren. Weitere Informationen zur Auswahl der besten Parameter finden Sie auch hier43, sowie beim Anwendungsspezialisten des Herstellers.<ol>
<li>Öffnen Sie die Stromsteuerung der Röntgenquelle (Optionen | Röntgenquelle). Verwenden Sie die Schieberegler, um die Röntgenspannung auf 30-40 kV und den Strom auf 100-110 μA einzustellen, um einen Röntgenstrahl mit 3-4W Leistung und einer kleinen Spotgröße für eine verbesserte Auflösung zu erzeugen.</li>
		<li>Verwenden Sie das Dialogfeld "Erfassungsmodi" (Optionen | Aufnahmemodi), um die Belichtungszeit der Kamera auf 500-800 ms einzustellen.</li>
		<li>Verwenden Sie den Schieberegler neben dem Lupensymbol am unteren Rand der Software, um die gewünschte Bildpixelgröße (~ 700 nm bis 4 μm) abhängig von den Kameraeinstellungen und der Position einzustellen. Dies bestimmt die Anzahl der Projektionsbilder, die während des Scans aufgenommen werden, wobei mehr Projektionen zu einer verbesserten Auflösung, aber längeren Scanzeiten führen (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Klicken und ziehen Sie den Schieberegler neben dem drehbaren Pfeil am unteren Rand der Software, um die Probe entlang ihres 360°-Drehpfads zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Probe innerhalb des Sichtfelds bleibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie oben in der Software auf das Symbol "Erfassung starten" (blaues Kreispfeilsymbol). Ein Dialogfeld wird angezeigt, in dem zusätzliche Scanparameter festgelegt werden können, und die Datei und der Ausgabeordner, in dem der Scan gespeichert wird, werden benannt.<ol>
<li>Stellen Sie die zufällige Bewegung auf 10 und durchschnittlich 4-6 Frames ein. Der Drehschritt wird in Abhängigkeit von den verwendeten Kameraeinstellungen automatisch berechnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beginnen Sie den Scan, indem Sie im Dialogfeld Erfassung auf 'OK' klicken. Ein zweites Fortschrittsbalkendialogfeld wird angezeigt, das die Scanzeit anzeigt. Der Scanner erfasst nun eine Reihe von Projektionsbildern (Abbildung 1D) der Probe entlang des Rotationspfades und muss nicht überwacht werden.</li>
</ol>6. Wiederaufbau
<ol><li>Um die Tomogramme zu generieren, führen Sie eine Bildrekonstruktion mit den Projektionsbildern durch. HINWEIS: Während fast alle Rekonstruktionen von Bildern von Kegelstrahlgeometriescannern auf dem Feldkamp-Algorithmus16basieren, variieren die einzelnen Parameter je nach Softwareimplementierung und sollten empirisch bestimmt werden. Die folgenden Einstellungen, die für eine handelsübliche Software spezifisch sind (siehe Materialtabelle),können als Leitfaden verwendet werden. Parameter wie Fehlausrichtungskompensation, Ringartefaktreduktion und Strahlhärtungskorrektur (0% für die meisten Fliegenproben) werden iterativ durchgeführt, um die besten Werte für die endgültige Rekonstruktion auszuwählen. Für fortgeschrittene Benutzer, die mehr Kontrolle über den Rekonstruktionsprozess wünschen, siehe die MATLAB-Schnittstelle hier44.</li>
	<li>Führen Sie eine anfängliche Bildausrichtung durch, indem Sie einen Shift-Korrektur-Algorithmus basierend auf Referenzscansverwenden 45 (Actions | X/Y-Ausrichtung mit einem Referenzscan).
</li>
	<li>Feinabstimmung der einzelnen Rekonstruktionsparameter (Start | Feinabstimmung). Dadurch wird ein Dialogfeld "Parameterfeinabstimmung" aktiviert.<ol>
<li>Passen Sie die Ausrichtung an, indem Sie auf 'Weiter' bis 'Nachausrichtung' klicken. Legen Sie die Anzahl der Iterationen auf fünf und den Parameterschritt auf 1.0 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine Reihe von Vorschauen zu generieren. Wählen Sie das Bild aus, das richtig ausgerichtet ist. HINWEIS: Ein richtig ausgerichtetes Bild ist nicht verschwommen oder zeigt "scherende" Artefakte an, bei denen eine ansonsten kontinuierliche Struktur (z. B. die Nagelhaut) geteilt erscheint.</li>
		<li>Passen Sie die Reduzierung des Ringartefakts an, indem Sie daneben klicken. Legen Sie die Anzahl der Iterationen auf fünf und den Parameterschritt auf 1.0 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine Reihe von Vorschauen zu generieren. Wählen Sie das Bild aus, das die geringste Anzahl von Ringen enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die oben genannten Parameter optimiert wurden, um das beste Bild zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Werte auf der Registerkarte Einstellungen ( Einstellungen ) richtig dargestelltwerden.
</li>
	<li>Passen Sie alle endgültigen Helligkeits- und Kontrastwerte mithilfe des Histogramms an, dateien Sie Parameter wie Bittiefe und -typ und verwenden Sie einen Bereich von Interesse (ROI), der nur die strukturen von Interesse umfasst (z. B. nur ganze Fliege oder Kopf), um die Rechenzeit zu reduzieren(Ausgabe).</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Rekonstruktion (Start | Start). Wenn mehrere Rekonstruktionen erforderlich sind, fügen Sie das aktuelle Image dem Batch-Manager hinzu (Start | Zum Stapel hinzufügen) und wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.5 für die verbleibenden Bilder.</li>
</ol>7. Bildanalyse
<ol><li>Visualisieren Sie Tomogramme in zwei und drei Dimensionen und führen Sie weitere morphometrische Analysen mit Freeware oder kommerzieller Software durch. HINWEIS: Details zur in diesem Protokoll verwendeten Software finden Sie in der Materialtabelle. Andere Softwarepakete, die in der Lage sind, μ-CT-Datensätze auszuwerten, umfassen Freeware-Optionen wie FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47und ITK-SNAP48sowie kommerzielle Software (z. B. AMIRA). Andere Anwendungen, die auf maschinellem Lernen basierende Algorithmen zur Halbautomatisierung des Segmentierungsprozesses verwenden, können dazu beitragen, Arbeitsabläufe zu beschleunigen und menschliche Vorurteile zu reduzieren (z. B. Biomedisa49).</li>
	<li>Importieren Sie die Tomogrammdatei in die Software (Datei | Bilddateien importieren). Die mit der Datei verknüpften Metadaten sollten automatisch in das Fenster geladen werden, können aber auch manuell so eingestellt werden, dass sie den Bildeigenschaften entsprechen.</li>
	<li>Um eine interessante Struktur zu segmentieren, klicken Sie auf die Registerkarte Segment auf der linken Seite des Bildschirms. Erstellen einer neuen Region of Interest (ROI) (Basic | Neu),geben Sie ihm einen Namen und wählen Sie eine geeignete Farbe aus.</li>
	<li>Definieren Sie den Schwellenwertbereich, der die Struktur von Interesse umfasst (Bereich | Bereich definieren) mit dem Schieberegler.</li>
	<li>Wählen Sie einen geeigneten 2D- oder 3D-ROI-Painter-Tool-Modus(ROI Painter | Pinseloption).
</li>
	<li>Um einen bereich zu malen, der durch den Schwellenwert definiert ist; Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Um einen Bereich zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. HINWEIS: Um die Größe des kreisförmigen oder quadratischen Pinsels zu ändern, scrollen Sie einfach mit dem Mausrad, während Sie entweder die Strg- oder die Umschalttaste gedrückt halten.</li>
	<li>Malen Sie weiterhin die Struktur von Interesse über das gesamte Z-Volumen.</li>
	<li>Konvertieren Sie den ROI in ein Netz (Export | Zu einem Netz | Normal).
</li>
	<li>Markieren Sie die Netzüberlagerung, indem Sie im Bedienfeld "Dateneigenschaften und -einstellungen" in der oberen rechten Ecke darauf klicken.</li>
	<li>Glätten des Netzes mit einer geeigneten Anzahl von Iterationen(Smooth Mesh | Iterationen). HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zu vergleichenden Bilder denselben Iterationswert für die Netzglättung.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Messungen des Netz-ROI (Oberfläche, Volumen und Feretdurchmesser) im Informationsfenster auf der rechten Seite des Bildschirms für grundlegende morphometrische Analysen angezeigt werden. Zusätzliche Analysen können mit dem Modul Objektanalysedurchgeführt werden.</li>
	<li>Rendern Sie das Netzobjekt und das gesamte Tomogrammbild und visualisieren Sie es in 3D. Verwenden Sie den integrierten Movie Maker, um ein Video des Objekts zu generieren(rechter Mausklick | Movie Maker anzeigen) mit einzelnen Frames aus dem Viewer(Add Key). HINWEIS: Mehrere visuelle Verbesserungen können auch auf den Film angewendet werden, indem Sie die Registerkarte "Visuelle Effekte" im rechten Bereich verwenden, um bestimmte Funktionen usw. hervorzuheben.</li>
	<li>Exportieren Sie das Video zur Anzeige mit der Schaltfläche Animation exportieren im Movie Maker.</li>
</ol>

Der Autor erklärt keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.

Die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in allen Entwicklungsstadien ist eine Herausforderung geblieben, vor allem aufgrund der Inkompatibilität der Lichtmikroskopie mit der dicken, pigmentierten Nagelhaut dieses Tieres. Während andere Bildgebungsverfahren für ganze Tiere, wie Magnetresonanztomographie (MRT), Optische Kohärenztomographie (OCT) und Ultraschall in Verbindung mit Gewebereinigung, erfolgreich bei Fliegen50,51,52,53,54, μ-CT eine Reihe von Vorteilen bietet, die es ideal für die Bildgebung von ganzen Tieren dieses Organismus machen13,15,30 . Röntgenstrahlen dringen leicht in die pigmentierte Nagelhaut ein und ihre kleine Wellenlänge ermöglicht eine Submikranz-Bildgebung. Die Etikettierung erfordert minimale Investitionen in weit verbreitete Chemikalien und keine speziellen Bankkenntnisse13. μ-CT-Scanner sind ebenfalls im Handel erhältlich, und die Kosten sind vergleichbar mit Lichtmikroskopie-Plattformen, sind aber auch für ein breiteres Spektrum von Disziplinen (Geologie, Paläontologie, Ingenieurwesen usw.) attraktiver, die auch von ihrer Verfügbarkeit an einer Institution profitieren können. Synchrotron-Röntgenquellen können auch für hochauflösende μ-CT-Bildgebung von festen und lebenden Insekten31,55,56verwendet werden, sind jedoch weniger zugänglich als kommerzielle Tischscanner.
Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, μ-CT-Bilder von Erwachsenen, Puppen, Larven und zellularisierten Embryonen zu erhalten. Beachten Sie, dass für viele der oben beschriebenen Schritte auch alternative Methoden angewendet werden können, um Proben für die Bildgebung vorzubereiten. Andere Studien haben einen detaillierten Vergleich der verschiedenen Fixierungs-, Markierungs- und Trocknungsschritte für die Verwendung bei Insekten geliefert, und diejenigen, die an der Anwendung dieser Technik interessiert sind, werden ermutigt, die Vorzüge jedes Ansatzes1,4,13,29,30,57zu bewerten . Während dieses Protokoll relativ einfach ist, werden einige hilfreiche Vorschläge vorgestellt.
Erstens sollte bei der Störung der Nagelhaut intakter Proben darauf geachtet werden, dass darunter liegende Weichteile nicht signifikant gestört werden. Es ist wichtig, Larven- und frühe Puppenstadien für 2 Stunden in Bouins Lösung fixieren zu lassen, bevor Sie stochern. Dies versteift das Gewebe und begrenzt die Menge an Hämolymphe, die aus den Nagelhautlöchern austritt, was die Organarchitektur verändern kann. Einzelne Körpersegmente (Kopf, Thorax und Bauch) des Erwachsenen können getrennt werden, wenn sich die interessierenden Strukturen dort befinden. Es wird empfohlen, diese Segmente mit einem Skalpell sauber zu durchschneiden, anstatt sie mit einer Zinnen auseinanderzuziehen, was beispielsweise die 3D-Architektur des Darms oder des zentralen Nervensystems stören könnte. Was das Timing betrifft, benötigen Erwachsene in der Regel nur 16 Stunden. für eine vollständige Fixierung, während Larven- und Puppenstadien 24 Stunden benötigen. Wenn die Jod- oder PTA-Färbung ungleichmäßig erscheint, kann die Probe wieder in Lösung gelegt werden, um länger zu inkubieren, bis eine gleichmäßige Färbung erreicht ist. Schließlich sollten hydratisierte Proben nicht bei 4 °C platziert werden, da dies nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur die Bildung von Luftblasen in der Körperhöhle zu induzieren scheint.
Zweitens variiert die Probenmontage je nach Instrument, Bühnentyp und ob die Probe hydratisiert bleiben muss oder an kritischen Stellen getrocknet wurde. Wenn Sie hydratisiert sind, stellen Sie sicher, dass die Probe nicht ausläuft und möglicherweise den Scanner zerstört. Wenn Sie die Probe in einer Pipettenspitze montieren, achten Sie darauf, vorsichtig mit einem abgestumpften Gegenstand zu drücken, bis die Proben auf leichten Widerstand stoßen und sich nicht bewegen können. Zu hartes Drücken kann zu Nagelhautverformungen und zugrunde liegenden strukturellen Defekten führen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Probe im Halter so nah wie möglich an der Drehachse ausgerichtet ist. Jedes Wackeln erhöht die Scanzeiten aufgrund des größeren Sichtfelds und reduziert die Auflösung des endgültigen Tomogramms nach der Rekonstruktion.
Drittens variieren die Scannereinstellungen für die Aufnahme von Projektionsbildern ebenfalls je nach Instrument. Um die Auflösungsfähigkeit des Scanners zu maximieren, sollte die Größe des Röntgenstrahlflecks so klein wie möglich sein (5-10 μm). Dies kann erreicht werden, indem Röntgenspannungs- und Stromeinstellungen so ausgeglichen werden, dass die Gesamtleistung 3-4 W beträgt. Mit diesen Einstellungen und der entsprechenden Belichtungszeit an der Kamera kann eine korrekte Röntgenstrahldämpfung durch die Probe und ein optimaler Bildkontrast erreicht werden. Die Verwendung von Aluminium- oder Kupferfiltern zwischen dem Objekt und der Röntgenquelle kann verwendet werden, um die optimalen Röntgenenergieeinstellungen für den besten Bildkontrast zu verfeinern oder den Strahl ausreichend zu dämpfen, damit Quellen mit höherer Leistung verwendet werden können. Was die Bildauflösung betrifft, hängt dies von vielen verschiedenen Variablen ab, einschließlich Fleckentyp, Anzahl der Projektionsbilder, Bildpixelgröße, Kameraposition, Probenbewegung, Scannervibrationen und Rekonstruktionsparametern. Ein Balkenmusterphantom (QRM GmbH) mit bekannten Größenmarkierungen kann helfen, die räumliche Auflösung für eine bestimmte Scanner- und Kameraeinstellung zu bewerten.
Es lohnt sich auch, die Vorzüge der Bildgebung von getrockneten oder hydratisierten Proben mit kritischem Punkt zu bewerten. Sombke et al. führten eine vergleichende Bewertung der beiden Methoden durch und fanden die Trocknung kritischer Punkte für μ-CT-Anwendungen mit Arthropoden überlegen30. Die Vorteile von hydratisierten Proben bestehen jedoch darin, dass Tiere weniger chemischen und mechanischen Expositionen ausgesetzt sind, die sowohl zu quantitativen als auch zu morphologischen Artefakten führen können. Dies neigt auch dazu, empfindliches Gewebe besser zu erhalten als CPD. Hydratisierte Proben haben jedoch eine viel kürzere Haltbarkeit und sollten spätestens einen Monat nach der Fixierung abgebildet werden, da an dieser Stelle Gewebeabbau und verminderte Bildqualität offensichtlich werden. Außerdem ist die Auflösung von hydratisierten Proben etwas geringer als eine getrocknete Probe an kritischem Punkt, da Röntgenstrahlen auch durch eine Kunststoffpipettenspitze und die umgebende Flüssigkeit (Wasser oder Puffer) eindringen müssen. Critical Point Getrocknete Proben können für viel längere Zeit konserviert werden, insbesondere wenn sie auf Drierite aufbewahrt werden. Sie können auch direkt in den Röntgenstrahlweg gelegt werden, indem die Flügel oder Beine einfach an einen Insektenstift geklebt und in das Bühnenfutter gelegt werden, was den Montagevorgang vereinfacht. Die umfangreiche Ethanoldehydratisierung dieser Proben kann jedoch zu Gewebeschrumpfung und Verlust empfindlicher Gewebearchitektur führen, weshalb es wichtig ist, eine Reihe von steigenden EtOH-Konzentrationen durchzuführen, um diese Effekte zu minimieren. Dennoch ist zu beachten, dass alle Formen der chemischen Behandlung, einschließlich Paraformaldehydfixierung und sogar Jodfärbung, Gewebeschrumpfung verursachen können58,59. Während keine der beiden Methoden Messungen der "tatsächlichen Organgröße" in einer lebenden Fliege liefert, sind morphometrische Messungen beim Vergleich von Mutierten- und Wildtyptieren immer noch gültig, solange die Fixierungs-, Färbe- und Trocknungsschritte für beide Probensätze identisch durchgeführt werden - vorzugsweise parallel.
Zusammenfassend bietet μ-CT ein nützliches Bildbildwerkzeug für Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Viele andere Studien haben die Leistungsfähigkeit dieser Technologie für das Verständnis verschiedener Aspekte der Insektentaxonomie, Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Anatomie gezeigt, die dazu beitragen können, zukünftige Studien in Fliegen1,28,30,31,32,55,56,57 zu informieren . In Kombination mit den genetischen und lichtmikroskopisch in diesem Organismus bereits weit verbreiteten Werkzeugen kann sich μ-CT innerhalb einer experimentellen Pipeline positionieren, die ein tieferes Verständnis zwischen Genotyp und Phänotyp ermöglicht.

Bildgebende Verfahren, die eine detaillierte Untersuchung der inneren Strukturen eines Objekts ermöglichen, ohne seine gesamte 3D-Architektur zu zerstören, haben sich für eine Reihe verschiedener Disziplinen als sehr vorteilhaft erwiesen, darunter Physik, Ingenieurwesen, Materialwissenschaften, Archäologie, Paläontologie, Geologie und Biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Unter diesen zerstörungsfreien Bildgebungsmethoden sind röntgenbasierte Plattformen besonders nützlich, da hochenergetische Röntgenstrahlen im Vergleich zu sichtbaren Lichtwellen viele verschiedene Probentypen und Materialien mit minimaler Streuung durchdringen können. Computertomographie (CT), Mikrocomputed Tomography (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) und Synchrotron-Mikrotomographie haben sich daher als die primären Technologien für die röntgenbasierte Bildgebung von Proben von Metern bis Mikrometern mit Auflösungsfähigkeiten von Millimetern bis Submikromin10,11,12,13,14herausgestellt.
Während sich diese Plattformen in ihrem Design, ihrer Röntgengeometrie und ihren Komponenten unterscheiden, um Probengröße und Auflösung auszugleichen, basieren sie alle auf dem gleichen Grundprinzip für die Bilderfassung: eine Quelle von Röntgenstrahlen, die durch das Objekt wandern und von einem Detektor erfasst werden. Die differentielle Dämpfung des Röntgenstrahls beim Durchlaufen unterschiedlicher Dichten innerhalb des Objekts erzeugt einen Bildkontrast. 3D-Daten werden erhalten, indem entweder die Probe oder der Detektor gedreht wird, wobei eine Reihe von 2D-Projektionsbildern gesammelt wird, die dann mithilfe von Algorithmen zu Tomogrammen rekonstruiert werden, die 3D-Informationen enthalten, deren Auflösung in x, y, z15isotrop ist. Für viele Benchtop-μ-CT-Scanner, die eine Kegelstrahl-Röntgengeometrie verwenden, um Röntgenstrahlen auf das abgebildete Objekt zu projizieren, wird der Feldkamp-Algorithmus verwendet, um das Objekt mit minimalen Fehlern genau zu rekonstruieren16.
Die Auflösung einer gegebenen Plattform wird in erster Linie durch Systemparameter wie die Größe des Röntgenstrahls (Spotgröße), die Scannergeometrie (Entfernung vom Objekt zur Röntgenquelle), die Größe der Pixel auf dem Detektor und den verwendeten Rekonstruktionsalgorithmus bestimmt. Zusätzliche Faktoren wie Scannerschwingungen, Röntgenstrahlschwankungen, Probenbewegung und Materialtyp oder chemischer Fleck, der zur Visualisierung des Objekts verwendet wird, können die räumliche Auflösung unter realen Bildgebungsbedingungen ebenfalls erheblich beeinflussen15.
Für biomedizinische Anwendungen haben CT und μ-CT eine Schlüsselrolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses von Anatomie, Physiologie, Entwicklung und Krankheitsmechanismen gespielt und dienen sowohl als Werkzeug für die Diagnose menschlicher Patienten als auch als präklinische Bildgebungsplattform für Modellorganismen17,18. Zum Beispiel nutzt das Mouse International Phenotyping Consortium, dessen Ziel es ist, die Funktion jedes Gens im Mausgenom zu identifizieren, μ-CT als Teil ihrer Phänotypisierungspipeline19. Ihre Ergebnisse waren entscheidend für das Verständnis von Genen, die an Entwicklungs- und Krankheitsprozessen beteiligt sind, und dienten gleichzeitig als Atlas für die Anatomie und Entwicklung vonMäusen 20. Andere Modellorganismen, wie Zebrafische und Ratten, haben die Verwendung von μ-CT zur Durchführung der Phänotypisierung ganzer Tiere einer Reihe von Genmutanten17,21,22,23 ebenfallsvollständig angenommen.
Der Vorteil der Kombination von Ganztierbildgebung mit Modellorganismen besteht darin, dass ein mechanistisches Verständnis der Genfunktion für einen bestimmten biologischen Prozess vollständig erforscht werden kann. Dies ist möglich aufgrund der gut charakterisierten Genome und vieler genetischer Werkzeuge, die in Modellorganismen verfügbar sind, die eine präzise Manipulation der Genfunktion zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten, spezifischen Geweben, einzelnen Zellen und sogar subzellulären Organellen ermöglichen. Dazu gehören binäre Expressionssysteme wie das UAS/GAL4-System (und seine vielen Derivate), CRISPR/Cas9 und RNAi24,25,26. Wenn diese genetischen Werkzeuge in Verbindung mit einer leistungsfähigen Bildgebungspipeline verwendet werden, die aus Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie (fluoreszierend und nicht fluoreszierend) und ganzer Tierbildgebung wie μ-CT besteht, kann eine gründliche Bewertung von Molekülen, Zellen, Geweben, Organen und dem gesamten Organismus erreicht werden, was ein viel tieferes Verständnis der Genfunktion ermöglicht.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von μ-CT im Nicht-Säugetier-Modellorganismus Drosophila melanogaster, dessen unzählige genetische Werkzeuge dazu beigetragen haben, zahlreiche molekulare Mechanismen aufklärtzuhaben 26,27. Es wurde von früheren Protokollen bei Nicht-Modellinsekten1,28,29,30,31,32übernommen und baut auf früheren μ-CT-Studien in Drosophila auf, um ein standardisiertes Protokoll für seine Verwendung bei diesem Tier zu erstellen33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Die Schritte zur erfolgreichen Probenvorbereitung, Bildgebung und Analyse von Fliegen-μ-CT-Datensätzen mit handelsüblichen Scannern werden skizziert. Mit diesem Protokoll können alle Entwicklungsstadien der Fliege in hoher Auflösung sowohl für deskriptive als auch für hypothesentestende Studien visualisiert werden, einschließlich Taxonomie, Anatomie, Entwicklung, Physiologie und Krankheit27. Dieses Protokoll wird auch für die Abbildung praktisch aller Insekten und sogar nicht lebender Materialien nützlich sein, die eine chemische Färbung für den Bildkontrast erfordern, um die Visualisierung durch μ-CT zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Für die Trocknung an kritischen Punkten</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>Für die Tierfixierung</td></tr><tr><td>Kritischer Punkttrockner</td><td></td><td></td><td>Trocknet Proben mit der Kritischpunktmethode; mehrere Optionen verfügbar (Balzers CPD 020 oder Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>Zur Visualisierung und Segmentierung von Mikro-CT-Datensätzen; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Für Mikrofugenröhrchen</td></tr><tr><td>Bildanalyse-Workstation</td><td></td><td></td><td>Sollte ausreichend RAM und eine hochwertige Grafikkarte für das 3D-Rendering enthalten</td></tr><tr><td>Jodlösung (I2KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>Zum Färben</td></tr><tr><td>von Mikrocomputertomographie-Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Kegelstrahl-Röntgengeometrie; Detektor ist eine Hamamatsu 10 MP Kamera mit 11,54 & Mikro; m Pixelgröße.</td></tr><tr><td>Mikrocomputertomographie-Scanner-Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Zur Steuerung des Scanners selbst (z. B. Durchführung von Flat-Field-Korrekturen, Leistung der Röntgenröhre, Kameraauslaufzeiten, Erfassung, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>Zum Einstechen von Löchern in die Nagelhaut</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Wird verwendet, um Querschnittsbilder aus 2D-Projektionsbildern zu rekonstruieren, die mit Cone-Beam-Röntgengeometrie aufgenommen wurden</td></tr><tr><td>P10 Pipettenspitzen</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Probenaufnahme</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Forschung Produkte International</td><td>P32060-4000.0</td> Vor <td>Gebrauch 1X mit Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>Zum Färben</td></tr><tr><td>von Pin-Haltern</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>Zum Entfernen von wachsartigem Belag von erwachsenen Fliegen (als 0,5% PBST)</td></tr><tr><td>Röntgenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-Beam-Röntgengeometrie mit Fresnel-Zonenplatten-Objektiven für Resoluton at a Distance (RaaD&trade;)</td></tr></tbody></table>

ganztierbildgebung von drosophila melanogaster mittels mikrocomputed tomographie

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedizinische Bildgebungswerkzeuge ermöglichen die Untersuchung molekularer Mechanismen über räumliche Skalen hinweg, von Genen bis hin zu Organismen. Drosophila melanogaster, ein gut charakterisierter Modellorganismus, hat von der Verwendung von Licht- und Elektronenmikroskopie profitiert, um die Genfunktion auf der Ebene von Zellen und Geweben zu verstehen. Die Anwendung von Bildgebungsplattformen, die ein Verständnis der Genfunktion auf der Ebene des gesamten intakten Organismus ermöglichen, würde unser Wissen über genetische Mechanismen weiter verbessern. Hier wird eine ganze Tierbildgebungsmethode vorgestellt, die die Schritte beschreibt, die erforderlich sind, um Drosophila in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie (μ-CT) zu visualisieren. Zu den Vorteilen μ-CT gehören kommerziell erhältliche Instrumente und minimale praktische Zeit, um genaue 3D-Informationen mit Einer Auflösung auf Mikrometerebene zu erzeugen, ohne dass Gewebedissektions- oder Clearingmethoden erforderlich sind. In Kombination mit Software, die die Bildanalyse und das 3D-Rendering beschleunigt, kann eine detaillierte morphometrische Analyse jedes Gewebe- oder Organsystems durchgeführt werden, um entwicklungs-, physiologie- und anatomiemechanismen sowohl für beschreibende als auch für Hypothesenteststudien besser zu verstehen. Durch die Verwendung eines bildgebungstechnischen Workflows, der den Einsatz von Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie und μ-CT umfasst, kann eine gründliche Bewertung der Genfunktion durchgeführt werden, wodurch die Nützlichkeit dieses leistungsstarken Modellorganismus weiter unterstützt wird.

Abbildung 2 zeigt Bilder eines Embryos,3. Instar-Larven, Puppen im pharaten Erwachsenenstadium (P7) und einer erwachsenen weiblichen Fliege, die mit Jod gefärbt und mit einem kommerziellen Tischscanner in Wasser hydratisiert abgebildet wurde. Eine hervorragende Konservierung und sogar Färbung von empfindlichem Gewebe ist offensichtlich, so dass alle wichtigen Organe leicht identifiziert und für morphometrische Analysen und 3D-Visualisierung verwendet werden können.
In der Regel bieten Scans, die weniger Projektionsbilder der Probe erfassen, eine niedrigere Auflösung als Scans, die mehr Projektionsbilder erfassen, wobei der Kompromiss die Zeit ist, die für das Scannen aufgewendet wird. Obwohl die Scanzeiten je nach Instrument und anderen Scanparametern variieren, dauern Scans, die einige hundert Projektionen (~ 3 μm Bildpixelgröße) erfassen, etwa 30 Minuten pro Probe, während Scans, die aus Tausenden von Projektionsbildern (700 nm-1,25 μm Bildpixelgröße) bestehen, 8-16 Stunden dauern können. Ein Vergleich desselben erwachsenen Fliegenkopfgehäuses, das sowohl im Scanmodus "langsam" (Tausende von Projektionen) als auch im "schnellen" (Hunderte von Projektionen) Scanmodus aufgenommen wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt. Wichtig ist, dass morphometrische Analysen nicht zwischen "langsamen" und "schnellen" Scans unterscheiden (Abbildung 3C)40. Unsere Bildgebungspipeline verwendet daher schnelle Scans, um eine ausreichend große Stichprobengröße für morphometrische Analysen zu generieren, und langsame Scans, um morphologische oder anatomische Defekte mit höherer Auflösung zu visualisieren. Mit der Software (Schritt 7) kann jedes Gewebe- oder Organsystem von Interesse segmentiert und für morphometrische Analysen verwendet und mit dem Movie Maker in 3D visualisiert werden (Film 1).
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für den mit PTA gefärbten und abgebildeten hydratisierten (Wasser) oder nach critical point drying (CPD) auf einem Röntgenmikroskop (Table of Materials). Die Details, die eine Kombination aus PTA und den Fähigkeiten dieser Plattform bietet, sind in diesen Bildern leicht ersichtlich, so dass einzelne Epithelzellen des Mitteldarms und Spermienbündel innerhalb der Hoden leicht aufgelöst werden können. Während das CPD-Bild im Vergleich zur hydratisierten Probe eine geringfügig erhöhte Auflösung zeigt, wird mit hydratisierten Proben eine bessere Erhaltung der Ultrastruktur empfindlicher Gewebe (wie der Fettzellen in der Nähe der Nagelhaut) erreicht (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über Scannerdesign und Probenmontage für μ-CT. (A) Ein handelsübliches μ-CT-Scanner. (B) Blick ins Innere des Scanners. Die Röntgenquelle (rechts) sendet Röntgenstrahlen aus, die die Probe auf einer rotierenden Stufe (gelber Pfeil) passieren. Die Dämpfung dieser Röntgenstrahlen erzeugt einen Bildkontrast, wenn sie durch die Probe und auf den Detektor gelangen, der aus einem Szintillationsbildschirm, der Röntgenstrahlen in Photonen umwandelt, und einer Standard-CCD-Kamera (links) besteht. (C) Montage einer erwachsenen Fruchtfliege für hydratisierte Bildgebung in Wasser. Die Verbindungspunkte zwischen der Pipettenspitze und dem Messinghalter sind mit Paraffinfolie umwickelt, um Leckagen und mögliche Schäden am Scanner zu vermeiden. Das Bühnenfutter ist ebenfalls hervorgehoben. Beachten Sie, dass die Pipettenspitze leicht außerhalb der Achse positioniert war, was zu einer längeren Scanzeit und einer reduzierten Auflösung bei der endgültigen Rekonstruktion führte. (D) Ein einzelnes 2D-Projektionsbild einer erwachsenen weiblichen Fliege; Hunderte bis Tausende dieser Projektionen werden während eines Scans entlang der Rotationsachse aufgenommen und zur Rekonstruktion verwendet, um Tomogramme mit isotroper Auflösung und genauen 3D-Informationen zu erzeugen. Skalenbalken (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Diese Zahl wurde von Schoborg et al.40modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Abbildung 2: Alle Lebenszyklusphasen von Drosophila melanogaster, abgebildet durch μ-CT. Proben, die mit Jod gefärbt und in Wasser hydratisiert dargestellt wurden. Gezeigt wird ein einzelnes 2D-Segment. (A) Ein Embryo, der die frühen Stadien der Gastrulation abgeschlossen hat (Sternchen). (B) Eine dritte Instar-Larve. (C) Ein P7 Pharat Erwachsener während der Metamorphose. (D) Eine erwachsene Frau. Verschiedene Organe werden hervorgehoben: BWM, Körperwandmuskulatur; Br, Gehirn; Cd, Cardia; Cr, Ernte; DLMs, dorsale Längsmuskulatur; DVM, dorsale ventrale Muskeln; E-AD, Augen-Antennenscheibe; Em, Embryo; FB, fette Körper; FBCs, Fettkörperzellen; H, Herz; Hg, Hinterdarm; La, Lamina; L, Bein; Mg, Mitteldarm; OL, Gehirnoptiklappen; Ov, Ovipositor; PC, Puppenkutikula; SG, Speicheldrüsen; VNC, ventrale Nervenschnur; W, Flügel; WD, Flügelscheibe. Scale Bars (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, Links. Scanparameter: Abstand Quelle zu Probe (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamera-Pixelgröße (μm): (A-D) 11.6. Bildpixelgröße (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Abbildung 3: Scanparameter und Bildauflösung verändern morphometrische Analysen nicht. Ein erwachsener Kopf, der sowohl mit (A, A') "schnellen" Scannereinstellungen (Hunderte von Projektionen) als auch (B, B') "langsamen" Scannereinstellungen (Tausende von Projektionen) gescannt wurde. Das Gehirn ist gelb umrandet. (C) Gehirnvolumenmessungen durch langsame und schnelle Scans. Hervorgehobene Strukturen: AL; Antennenlappen; CB, zentrales Gehirn; FB, fächerförmiger Körper; FCs, Fettzellen; La, Lamina; Lo, lobula; LoP, Lobula-Platte; Ich, medulla; Re, Netzhaut. n = 5, Welchs t-Test. ns = nicht signifikant. Maßstabsbalken = 100 μm. Scanparameter: Quelle-Zu-Probe-Abstand (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Abstand Quelle zur Kamera (mm): (A) 348 (B) 350. Kamera-Pixelgröße (μm): (A-B) 11.6. Bildpixelgröße (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Diese Zahl wurde von Schoborg et al.40modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Abbildung 4: Drosophila melanogaster Abdomen, röntgenmikroskopisch dargestellt. Die Abdomen wurden mit 0,5% PTA gefärbt und hydratisiert (Wasser) oder nach der Trocknung kritischer Punkte (CPD) abgebildet. (A) Kritischer Punkt Getrockneter Bauch, dargestellt aus der YZ-Perspektive und (A') XZ-Perspektive. (B) Hydratisierter Bauch, dargestellt aus der YZ-Perspektive und (B') XZ-Perspektive. Verschiedene Organe werden hervorgehoben: FC, Fettzellen; Hg, Hinterdarm; Mg, Mitteldarm; SP, Spermienpumpe; Te, Hoden. Skalenbalken (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, Links. Scanparameter: Abstand quelle zu Probe (mm): (A) 6,7, (B) 7. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objektiv: (A-B) 4X. Bildpixelgröße (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Film 1: Eine dritte Instar-Larve, die mit dem Movie Maker in Dragonfly in 3D gerendert wurde. Zu den hervorgehobenen Organen gehören das Gehirn (gelb), die Augen-Antennen-Imaginalscheiben (rot), der Fettkörper (blau) und die Körperwandmuskulatur (grün). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 2: Vergleich von Proben, die in Wasser abgebildet wurden, oder nach der Trocknung kritischer Punkte. Abdomen, die mit 0,5% PTA gefärbt sind, werden gezeigt. Beide Abdomen wurden mit identischen Bildpixelgrößeneinstellungen (0,65 μm) gescannt. Eine Reihe von 2D-Scheiben wird in einem "Z-Stack" -Format (YZ) gezeigt, das an der dorsalen Oberfläche beginnt und an der ventralen Oberfläche des Abdomens endet. Hervorgehobene Organe: FC, Fettzellen; Mg, Mitteldarm; SP, Spermienpumpe; Te, Hoden. Scanparameter: Abstand quelle zu Probe (mm): (A) 6,7, (B) 7. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objektiv: (A-B) 4X. Bildpixelgröße (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dieses Protokoll ermöglicht die zerstörungsfreie Bildgebung mit einer Auflösung von intakten oder weichen Labormikrometern. Es kann verwendet werden, um Mechanismen der Physiologie, Anatomie und Entwicklung von Tieren zu verstehen. Da die Fliegen in einem intakten Zustand abgebildet werden, ohne dass eine Gewebedissektion erforderlich ist, bleibt die räumliche Architektur von Gewebe und Organen in ihrem ursprünglichen Zustand erhalten und kann leicht beobachtet werden.Die Mikro-CT ist ein ideales Werkzeug für Studien, die darauf abzielen, menschliche Krankheiten bei Fliegen zu modellieren oder Entwicklungsstörungen zu verstehen, die die Lebensqualität beeinträchtigen. Es hat sich auch in anderen Disziplinen wie Ingenieurwissenschaften, Physik, Materialwissenschaften, Geologie und Anthropologie als nützlich erwiesen. Nachdem Sie den für die Bildgebung interessierenden Entwicklungszeitpunkt ausgewählt haben, werden 5 bis 20 Tiere in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einen Milliliter PBST überführt und das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit regelmäßigem Klopfen inkubiert, um die Entfernung der hydrophoben Beschichtung zu unterstützen und den Tieren ein vollständiges Eintauchen zu ermöglichen.Ersetzen Sie am Ende der Inkubation den PBST durch einen Milliliter Bouin-Lösung und klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Fliegen vollständig einzutauchen. Bei Larven- und Puppenproben werden die Tiere nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur dreimal für fünf Minuten und ein Milliliter frisches PBS pro Waschgang gewaschen. Übertragen Sie die Proben nach dem letzten Waschen in eine Multi-Well-Präparierschale mit frischem PBS pro Vertiefung unter einem Präpariermikroskop und stechen Sie mit einem kleinen winzigen Stift, der an einem Halter befestigt ist, ein Loch in die vordere und hintere Nagelhaut jeder Probe, wobei Sie darauf achten, dass das darunter liegende Weichgewebe nicht beschädigt wird.Nach dem Eindringen in die Nagelhaut inkubieren Sie die Proben 24 Stunden lang in einem Milliliter frischer Bouin-Lösung in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur, bevor Sie die Probe dreimal 30 Minuten lang und einen Milliliter eines Mikro-CT-Waschpuffers pro Waschgang waschen. Geben Sie nach der letzten Wäsche einen Milliliter der entsprechenden Färbelösung in das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben zwei bis sieben Tage lang bei Raumtemperatur. Wenn eine längere Bildkonservierung erforderlich ist, dehydrieren Sie die Proben innerhalb der aufsteigenden Ethanolreihe wie angegeben eine Stunde lang in einem Milliliter Ethanol pro Konzentration, um die Proben für die Trocknung an kritischen Punkten vorzubereiten.Um an kritischen Punkten getrocknete Proben zu montieren, legen Sie die Proben in Kunststoff- oder Glaskapillarröhrchen, bevor Sie die Röhrchen auf den rotierenden Tischhalter montieren. Füllen Sie für die Aufnahme hydratisierter Proben eine P10-Pipettenspitze mit Wasser und befestigen Sie das schmale Ende mit Paraffinfilm. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine einzelne Probe auf die Pipettenspitze zu übertragen, und schieben Sie die Probe mit einem langen, schlanken Gegenstand vorsichtig nach unten in die Spitze, bis sie gerade noch die Wand der Spitze berührt, um die Probe an Ort und Stelle zu halten.Nachdem Sie das offene Ende der Pipette abgedeckt haben, montieren Sie die P10-Pipette auf eine Halterung, die so konzipiert ist, dass sie in den Unterlegkeil des rotierenden Tisches passt. Klicken Sie zum Scannen in der Scannersoftware auf das Symbol "Tür öffnen", um Zugang zum rotierenden Tischkeil zu erhalten, und ziehen Sie den Kragen um die Basis des Probenhalters fest, um die Probe zu befestigen. Stellen Sie die Scanparameter in der Software auf optimale Auflösung und Kontrast ein und klicken Sie auf Optionen und Röntgenquelle, um die Leistungssteuerung der Röntgenquelle zu öffnen.Stellen Sie mit den Schiebereglern die Röntgenspannung auf 30 bis 40 Kilovolt und den Strom auf 100 bis 110 Mikroampere ein, um einen Röntgenstrahl mit drei bis vier Watt Leistung und kleiner Punktgröße zu erzeugen. Um die Anzahl der Projektionsbilder festzulegen, die während der Scans aufgenommen werden sollen, wählen Sie Optionen und Aufnahmemodi, um die Belichtungszeit der Kamera auf 500 bis 800 Millisekunden einzustellen, und verwenden Sie den Schieberegler, um die gewünschte Bildpixelgröße entsprechend den Kameraeinstellungen und der Kameraposition einzustellen. Klicken und ziehen Sie den Schieberegler, um das Sample entlang seines 360-Grad-Drehpfads zu verschieben und das Sample innerhalb des Sichtfelds zu halten.Klicken Sie auf das Symbol "Akquise starten". Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie zusätzliche Scanparameter einstellen können. Benennen Sie die Datei und den Ausgabeordner, in dem der Scan gespeichert werden soll.Stellen Sie die zufällige Bewegung auf 10 und den Durchschnitt auf vier bis sechs Bilder ein. Der Rotationsschritt wird automatisch in Abhängigkeit von den verwendeten Kameraeinstellungen berechnet, und klicken Sie dann auf OK, um die Aufnahme zu starten. Ein Dialogfeld mit dem Fortschrittsbalken mit der Scanzeit wird angezeigt, und der Scanner beginnt mit der Aufnahme einer Reihe von Projektionsbildern der Probe entlang des Rotationspfads.Um die Tomogramme zu erzeugen, öffnen Sie die Projektionsbilder in der Rekonstruktionssoftware und wählen Sie den Verschiebungskorrekturalgorithmus aus, um eine erste Bildausrichtung durchzuführen. Wählen Sie den besten Wert aus, mit dem die Projektionsbilder richtig ausgerichtet werden, und klicken Sie auf Feinabstimmung, um die einzelnen Rekonstruktionsparameter fein abzustimmen. Es wird eine Reihe von Vorschaubildern generiert, mit denen die richtigen Werte ausgewählt werden können.Vergewissern Sie sich, dass die optimalen Parameterwerte auf der Registerkarte Einstellungen angezeigt werden, und passen Sie auf der Registerkarte Ausgabe die Dateiparameter wie Bittiefe, Dateiname und Ordner an, in dem die Daten gespeichert werden. Ein Interessenbereich kann verwendet werden, um nur die interessierenden Strukturen zu rekonstruieren. Wenn mehrere Rekonstruktionen erforderlich sind, klicken Sie auf Start und Zum Stapel hinzufügen, um das aktuelle Bild zum Stapelmanager hinzuzufügen und die Rekonstruktion für die verbleibenden Bilder zu wiederholen.Für die morphometrische Analyse der rekonstruierten Bilder klicken Sie auf der Registerkarte Segment in einem geeigneten Softwareprogramm für die morphometrische Analyse auf Einfach und Neu, geben Sie dem Bild einen neuen Namen, und wählen Sie eine geeignete Farbe aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich definieren und passen Sie den Schieberegler an, um den Schwellenwertbereich anzupassen, der die gewünschte Struktur umfasst. Um einen durch den Schwellenwert definierten Bereich zu malen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten.Um einen Bereich zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Stellen Sie sicher, dass die Messungen des interessierenden Netzbereichs im Informationsbereich für die grundlegende morphometrische Analyse angezeigt werden. Rendern Sie das Mesh-Objekt und das gesamte Tomogrammbild, visualisieren Sie das resultierende Bild in 3D, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um Movie Maker anzeigen auszuwählen, um ein Video des Objekts mit einzelnen Bildern aus dem Viewer zu generieren.Auf diesen Bildern sind ein Embryo, eine Larve im dritten Stadium, eine Puppe im Ferratenstadium und eine erwachsene weibliche Fliege zu sehen, die mit Jod gefärbt und mit einem handelsüblichen Tischscanner in Wasser abgebildet wurden. Eine hervorragende Konservierung und gleichmäßige Färbung des empfindlichen Gewebes ist offensichtlich, so dass alle wichtigen Organe leicht identifiziert werden können. Hier wird ein Vergleich des gleichen Fliegenkopfgehäuses für Erwachsene gezeigt, das sowohl im langsamen als auch im schnellen Projektionsmodus aufgenommen wurde.Wichtig ist, dass, obwohl die Auflösung in den langsamen Bildern höher ist, die morphometrische Analyse nicht zwischen den langsamen und schnellen Scans unterscheidet. Mit der Rendering-Software kann jedes Gewebe- oder Organsystem von Interesse segmentiert und für die morphometrische Analyse und 3D-Visualisierung verwendet werden. Auf diesen Bildern ist ein mit Phosphotungstinsäure gefärbter Fliegenbauch zu sehen, der mit Wasser hydratisiert oder nach einer Trocknung des kritischen Punktes am Röntgenmikroskop abgebildet wurde.Mit Hilfe von Phosphowolframsäure lassen sich einzelne Epithelzellen des Mitteldarms und Spermienbündel innerhalb der Hoden leicht auflösen. Während die Bilder der Trocknung an kritischen Punkten im Vergleich zur hydratisierten Probe eine geringfügig höhere Auflösung aufweisen, wird mit hydratisierten Proben, wie z. B. den Fettzellen in der Nähe der Kutikula, eine bessere Erhaltung der Ultrastruktur empfindlicher Gewebe erreicht. Begrenzen Sie für die beste Auflösung Probenbewegungen und übermäßige Vibrationen.Die Sicherung der Probe auf dem Tisch ist dafür von entscheidender Bedeutung, obwohl Kreativität und Einfallsreichtum erforderlich sein können, um dies zu erreichen. Zusätzliche bildgebende Verfahren wie Licht- und Elektronenmikroskopie können als Teil eines bildgebenden Workflows eingesetzt werden, um eine gegebene Genmutation von der Nanoskala auf den gesamten Organismus zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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