Name: Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Erfahren Sie eine chirurgische Methode zur Hemmung der Wundepidermisbildung bei der Axolotl-Gliedmaßenregeneration. Dieses effiziente Protokoll ermöglicht molekulare Analysen zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen.

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Der Autor dankt Doug für seine ständige Ermutigung und unerschütterliche Unterstützung sowie den Mitgliedern des Melton-Labors für ihr hilfreiches Feedback und ihre Kommentare zum Manuskript. Der Autor möchte auch dem Harvard Office of Animal Resources (OAR) für seine engagierte Tierpflege danken.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Protokoll #: 11-32) und AAALAC-Richtlinien an der Harvard University durchgeführt.
1. Vorbereiten von Lösungen und Setup für Anästhesie und Genesung
<ol><li>Bereiten Sie frische 0,1% ige Tricainlösung für die Anästhesie und 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung zur Wiederherstellung vor. Machen Sie die Lösungen mit Wasser für die Axolotl-Haltung37 gemäß den an der jeweiligen Forschungseinrichtung zugelassenen IACUC-Protokollen (z. B. modifizierte Holtfreter-Lösung) geeignet. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen gut gemischt sind und dass genügend Volumen vorbereitet ist, um das gesamte Axolotl einzutauchen.<ol>
<li>Um 0,1% ige Tricainlösung herzustellen, mischen Sie 1 g Tricain und 1 g Natriumbicarbonat mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden.</li>
		<li>Um 0,5% ige Sulfamerazin-Natriumsalzlösung herzustellen, mischen Sie 5 g Sulfamerazin-Natriumsalz mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden. Sulfamerazin-Lösung ist ein Antibiotikum, das eine bakterielle Infektion während der chirurgischen Genesung verhindert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie ihn mit Clidox-S oder 70% Ethanol besprühen. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (Pinzette, Sezierschere, Federschere) durch Autoklavieren. Wenn Sie mehrere Operationen durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie die chirurgischen Werkzeuge mit einem heißen Perlensterilisator zwischen den Tieren sterilisieren.</li>
	<li>Um den Erholungsbereich einzurichten, legen Sie eine 15 cm große Petrischale oder einen beliebigen Behälter, in den der Axolotl passt, auf einen mit Nasseis gefüllten Eimer. Füllen Sie die Petrischale mit einem niedrigen Gehalt von 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung, so dass der Axolotl nicht vollständig untergetaucht wird. Die Erholung auf Eis nach der Operation verlangsamt die Bewegung des Tieres, während es aus der Narkose erwacht, so dass der vernähte Bereich relativ ungestört heilen kann. HINWEIS: Dieses Setup kann von Forschern angepasst werden, je nachdem, welche Materialien sie zur Verfügung haben.</li>
</ol>2. Durchführung des vollständigen chirurgischen Eingriffs des Hautlappens
<ol><li>Anästhesieren Sie den Axolotl, indem Sie ihn in einen Behälter mit 0,1% iger Tricainlösung tauchen. Dies dauert ca. 15-20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass der Axolotl tatsächlich vollständig betäubt ist, indem Sie eine Schwanzprise durchführen. Wenn es keine Reaktion vom Axolotl gibt, fahren Sie mit der Operation fort. HINWEIS: Verwenden Sie für diese Operation ältere, größere Axolotl (mindestens 15 cm groß). Stellen Sie sicher, dass der Axolotl während der gesamten Operation gut hydratisiert bleibt, indem Sie die Haut regelmäßig mit Axolotl-Systemwasser mit einer Kunststoffpipette benetzen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Operationsstelle aseptisch vorbereiten, indem Sie den Bereich vor der Operation mit sterilem PBS bewässern. Das Tier sollte für den Eingriff auch auf einen sterilen chirurgischen Tuch gelegt werden.</li>
	<li>Eine Amputation der Gliedmaßen am distalen Ende der zeugopodialen Skelettelemente wird mit der Sezierschere durchgeführt (Abbildung 1.1).</li>
	<li>Machen Sie mit der Federschere einen kleinen Schnitt (ca. 2 mm) am ventralen Teil der Haut (Abbildung 1.2).</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette vorsichtig bis etwa zur Mittellinie der zeugopodialen Skelettelemente zurück und legen Sie die darunter liegenden Gliedmaßengewebe (Muskeln, Knochen usw.) frei. (Abbildung 1.3). Achten Sie darauf, die Haut nicht zu beschädigen. Siehe Hinweis nach Schritt 2.8.</li>
	<li>Amputieren Sie das freigelegte darunter liegende Gliedmaßengewebe an der Mittellinie des Zeugopoden mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 1.4).</li>
	<li>Drücken Sie das Muskelgewebe mit der chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Dies ist notwendig, um eine verbesserte Heilung zu gewährleisten und auch den Erfolg der Operation zu erhöhen, da hervorstehender Knochen gegen den vernähten Lappen gezackt werden kann und später die Integrität eines intakten Hautlappens stört.</li>
	<li>Ziehen Sie mit der Pinzette vorsichtig die Haut mit voller Dicke über die Amputationsebene, um das freiliegende darunter liegende Gewebe und die Nähte an Ort und Stelle zu bedecken, indem Sie sie mit der ventralen Haut in voller Dicke verbinden (Abbildung 1.5).</li>
	<li>Nähen Sie die verbleibende rechte und linke Seite der Haut in die darunter liegenden ventralen Teile der intakten Haut. Dies kann erreicht werden, indem entweder die Seiten der Klappe "kreuz und quer" genäht werden (empfohlen) (Abbildung 1.6-1.9) oder einfach direkt in die Bauchhaut eingenäht wird. Verwenden Sie die Pinzette und die gebogene Federschere zum Nähen. Stellen Sie sicher, dass keine exponierten darunter liegenden Gewebe zu sehen sind und dass die Nähte fest gebunden sind (mindestens dreimal geknotet). HINWEIS: Es ist wichtig, dass die intakte Haut in den Schritten 2.4, 2.7-2.8 nicht beschädigt wird. Wir haben festgestellt, dass Schäden an der Haut in voller Dicke mit erfolglosen Operationen korreliert sind, da die Schadensbereiche immer noch eine kleine Wundepidermis bilden können. Wenn möglich, versuchen Sie, eine stumpfere Pinzette zu verwenden, wenn Sie die Hautklappe in voller Dicke handhaben.</li>
	<li>Führen Sie eine Amputation an der kontralateralen Extremität durch (optionale interne Tierkontrolle), indem Sie sie auf mittlerer Zeugopodenebene mit einer chirurgischen Schere amputieren. Drücken Sie das Muskelgewebe mit einer chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Eine interne kontralaterale Gliedmaßenkontrolle kann durchgeführt werden, um den Erfolg der Operation während Schritt 4 am selben Tier besser beurteilen zu können. Die Amputation desselben Gliedmaßes bei einem separaten Tier kann jedoch auch als Kontrolle dienen.</li>
</ol>3. Postoperative Genesung und Pflege
<ol><li>Sobald die Operation abgeschlossen ist, legen Sie ein Kimwipe oder ein steriles Papiertuch auf den Boden des Behälters oder der Petrischale, um es zu benetzen. Legen Sie das Tier in den Behälter auf nassem Eis und wickeln Sie die freiliegenden Enden des Kimwipe- oder Papiertuchs vorsichtig um die Oberseite des Tieres, um es mit Sulfamerazinlösung gut hydratisiert zu halten. Lassen Sie es 30 Minuten bis 1 Stunde auf nassem Eis stehen, um eine minimale Bewegung während der Erholung von der Narkose zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen statischen Haltungsbehälter mit 0,5% Sulfamerazinlösung. Axolotls müssen in dieser Lösung für die ersten 24 Stunden bleiben, um eine Infektion zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie den Axolotl in normales Systemwasser und überwachen Sie die Gesundheit täglich. Stellen Sie sicher, dass jeden Tag keine Nähte herausfallen, da dies dazu führen kann, dass sich eine kleine Wundepidermis bildet, die die Ergebnisse verwirren wird. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gehäusebehälter ausreichend Platz für die Bewegung des Axolotls bietet, und minimieren Sie die Wahrscheinlichkeit, dass die vernähte Extremität am Axolotl mit den Seiten des Behälters in Berührung kommt. Dies wird dazu beitragen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation.</li>
</ol>4. Beurteilung des Operationserfolgs unter dem Stereomikroskop
HINWEIS: Wir empfehlen, die Tiere mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop zu untersuchen, um die Integrität des gesamten Hautlappens und den Erfolg der Operation zu beurteilen.
<ol><li>Betäuben Sie den Axolotl in 0,1% Tricain wie in Schritt 2.1. Stellen Sie sicher, dass im Behälter ausreichend Platz ist, damit sich der Axolotl bewegen kann.</li>
	<li>Wenn Sie in den ersten zwei Wochen nach der Operation inspizieren, untersuchen Sie die vernähte Extremität mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine Nähte herausgekommen sind und dass eine klare dünne Wundepidermis nirgendwo sichtbar ist. Wenn Sie in der dritten Woche nach der Operation oder später inspizieren, stellen Sie sicher, dass sich kein Blastema gebildet hat, und vergleichen Sie mit dem Verlauf der normalen amputierten Kontrollextremität (entweder von demselben Tier oder einem anderen Tier) während der Regeneration (dh ob sich ein Blastema gebildet hat).</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, bringen Sie den Axolotl auf normale Systemwasser- und Haltungsbedingungen zurück.</li>
</ol>

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<li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung von Operationen mit vollem Hautlappen in Axolotl-Gliedmaßen, um die Bildung von Wundepidermis zu hemmen. Während diese Operation im Vergleich zu anderen Methoden zur Hemmung der Wundepidermisbildung relativ einfach und technisch reproduzierbar ist, gibt es mehrere kritische Schritte, die den Erfolg der Operation beeinflussen können. Erstens, wenn Sie den intakten vollen Hautlappen über das freiliegende darunter liegende Gewebe ziehen, ist es von größter Bedeutung, dass die Haut in voller Dicke in keiner Weise beschädigt wird. Eine Schädigung des Hautlappens kann immer noch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen, die zu einem kleinen blastemartigen Auswuchs führen kann. Zweitens, stellen Sie sicher, dass während der postoperativen Versorgung keine Nähte ausfallen, da dies auch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen kann. Bis zu diesem Punkt ist es wichtig, den potenziellen Kontakt zwischen der vernähten Extremität und allen Oberflächen zu minimieren, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation. Mehrere Möglichkeiten, dies zu verhindern, bestehen darin, den Axolotl in einem ausreichend großen Behälter unterzubringen und zu betäuben, so dass der Axolotl nach der Operation viel Platz hat, um sich zu bewegen.
Diese Operation hat auch mehrere Einschränkungen. Am bemerkenswertesten ist vielleicht, dass der Erfolg von Operationen nur auf zwei Arten beurteilt werden kann: mit dem Sezierbereich während der ersten zwei Wochen der Operation, um nach dem Fehlen einer Wundepidermis zu suchen und / oder zu überprüfen, ob sich innerhalb von 3 Wochen ein Blastema bildet. Während diese Methoden effektiv sind, haben sie einen relativ geringen Durchsatz. Die Entwicklung zukünftiger transgener Reporter-Axolotls für Wundepidermis-spezifische Marker kann zu einem schnelleren Screening auf erfolgreiche und erfolglose Operationen beitragen. Darüber hinaus ist diese Operation bei jüngeren Tieren schwieriger durchzuführen, da die intakte Haut zerbrechlicher ist. Die Verwendung von subadulten oder adulten Axolotls wird daher empfohlen.
Während diese Operation ursprünglich in N. viridiscens19 entwickelt wurde, wurde sie leicht für Axolotls25,39 angepasst und kann wahrscheinlich auch auf andere Salamanderarten angewendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung dieser Technik auf zukünftige regenerative Studien zu Gliedmaßen die Forscher in die Lage versetzen wird, sowohl mehr Werkzeuge zur Behandlung der Wundepidermisbiologie zu entwickeln als auch die zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren, die ihre Funktion bei der Einleitung der Blastomabildung antreiben.

Seit Lazzaro Spallanzani es 17681 gemeldet hat, ist die Regeneration der Salamandergliedmaßen eines der am besten untersuchten natürlichen regenerativen Phänomene, das Biologen seit Jahrhunderten verliebt. Eine erfolgreiche Regeneration der Gliedmaßen hängt von der Bildung, dem Auswachsen und der anschließenden Musterung einer undifferenzierten Zellstruktur ab, die als Blastema bekannt ist. Forscher haben bedeutende Fortschritte beim Verständnis der zellulären Zusammensetzung des Blastomas gemacht und welche unterstützenden Gewebe und Zelltypen für seine Bildung notwendig sind2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Die koordinierten Signalmechanismen zwischen verschiedenen Geweben und Zelltypen, die zur Initiierung der Blastembildung führen, sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.
Eine Schlüsselvoraussetzung für eine erfolgreiche Blastomenbildung und Regeneration ist die Wundepidermis, ein vorübergehendes und spezialisiertes Epithel, das die Amputationsebene innerhalb von 12 Stunden nach der Amputation abdeckt10. Nach der Amputation wandern Epithelzellen von der intakten Haut proximal zur Verletzung schnell über die Amputationsebene und bilden ein dünnes Wundepithel14. Wenn sich das Blastema in den folgenden Wochen bildet, entwickelt sich die frühe Wundepidermis zu einer dickeren epithelialen Signalstruktur, der apikalen Epithelkappe (AEC)15. Während normale Haut in voller Dicke sowohl eine Epithel- als auch eine Hautschicht enthält, die durch eine Basallamina getrennt sind, besteht die Wundepidermis/AEC nur aus einer Epithelschicht und es fehlt eine Basallamina16,17. Das Fehlen der Basallamina und der Dermis ermöglicht einen direkten Kontakt zwischen den Wundepithelzellen und den darunter liegenden Geweben, was eine bidirektionale Signalübertragung zwischen den beiden Kompartimenten erleichtert, die sowohl für die Blastembildung als auch für die Aufrechterhaltung von Blastemen entscheidend ist17,18.
Klassische experimentelle Studien entwickelten verschiedene innovative chirurgische Methoden, um die Funktion und Notwendigkeit der Wundepidermis / AEC durch Hemmung ihrer Bildung zu untersuchen. Diese Methoden umfassten das Nähen19 oder das Pfropfen der Haut in voller Dicke20,21 über die Amputationsebene, das sofortige Einnähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle22 und die kontinuierliche tägliche Entfernung oder Bestrahlung der frühen Wundepidermis und AEC23,24. Insgesamt stellten diese Experimente nicht nur die Bedeutung der Wundepidermis/AEC fest, sondern bestimmten auch ihre Rolle bei der frühen Gewebehistolyse sowie bei der Aufrechterhaltung der Progenzellproliferation und des blastemalen Auswachsens13 während der gesamten Regeneration.
Diese früheren Studien beschränkten sich jedoch weitgehend auf histologische Färbungen sowie tritiierte Thymidinimpulse, um die Zellproliferation zu verfolgen. Tatsächlich wurde die Überprüfung dieser klassischen Experimente mit modernen Sequenzierungstechnologien und Funktionstechniken bei Salamandern erst kürzlich durchgeführt und hat zur Entdeckung zusätzlicher Rollen für die Wundepidermis bei der Modulation von Entzündungen und ECM-Abbau / -Ablagerung in frühen Stadien der Regeneration geführt25. Mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenom- und Transkriptomsequenzen26,27,28,29,30,31,32,33,34, sowie der wachsenden Anzahl von funktionellen Methoden, die in Salamanderarten verfügbar sind11,35,36,37,38 sind die Forscher nun gut positioniert, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Bildung, Funktion und AEC-Entwicklung der Wundepidermis antreiben.
Leider sind einige dieser klassischen Methoden, die zur Hemmung der Wundepidermisbildung verwendet werden, technisch anspruchsvoll und stellen im selben Experiment Schwierigkeiten für die Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten dar. Zum Beispiel kann die Aufrechterhaltung von Hauttransplantaten eine Herausforderung sein, da Transplantate schließlich von der Wirtsextremität fallen können und die Entfernung der Wundepidermis / AEC täglich schwierig ist, ohne das darunter liegende Gewebe zu schädigen. Darüber hinaus ist das Nähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle eine Herausforderung und erfordert zusätzliche Verletzungen an der Insertionsstelle. Auf der anderen Seite ist das Nähen von Haut in voller Dicke unmittelbar über der Amputationsebene relativ einfach, technisch reproduzierbar und führt zu minimalen Gewebeschäden. Diese Vollhautlappen-Operationsmethode (FSF) wurde bereits 1976 von Anthony Mescher bei erwachsenen Molchen (Notophthalmus viridiscens) entwickelt. Er zeigte, dass die FSF-Operation die Bildung und Funktion der Wundepidermis hemmte, indem sie sowohl die Migration von Epithelzellen über die Amputationsebene als auch den direkten Kontakt zwischen Epithelzellen und den darunter liegenden Geweben verbot.
Hier wird dieser chirurgische Eingriff Schritt für Schritt mit dem Axolotlglied gezeigt. In Verbindung mit modernen Molekular- und Sequenzierungstechnologien kann sich diese Technik für Forscher als sehr hilfreich erweisen, um unser Verständnis der Bildung und Funktion von Wundepidermis / AEC während der Regeneration der Gliedmaßen zu vertiefen.

<table><tbody><tr><td>Gebogene Federschere</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Benötigt zwei Paare</td></tr><tr><td>Nylon monofile Nähte (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

hemmung der wundepidermisbildung durch vollständige hautlappenchirurgie während der regeneration der axolotl-gliedmaßen

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Klassische Experimente in der regenerativen Biologie des Salamanders im letzten Jahrhundert haben seit langem gezeigt, dass die Wundepidermis eine entscheidende Signalstruktur ist, die sich nach der Amputation schnell bildet und für die Regeneration der Gliedmaßen erforderlich ist. Die Methoden zur Untersuchung seiner genauen Funktion auf molekularer Ebene in den letzten Jahrzehnten waren jedoch aufgrund eines Mangels an präzisen funktionellen Techniken und genomischen Informationen, die in Salamander-Modellsystemen verfügbar sind, begrenzt. Aufregenderweise ermöglicht es die jüngste Fülle von Sequenzierungstechnologien, gepaart mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenome und dem Aufkommen funktioneller genetischer Testmethoden, einschließlich CRISPR, diese grundlegenden Experimente mit beispielloser molekularer Auflösung erneut zu besuchen. Hier beschreibe ich, wie man die klassisch entwickelte Vollhautlappenoperation (FSF) bei erwachsenen Axolotls durchführt, um die Bildung der Wundepidermis unmittelbar nach der Amputation zu hemmen. Die Wundepidermis bildet sich normalerweise durch distale Migration von Epithelzellen in der Haut proximal zur Amputationsebene, um die Wunde von der äußeren Umgebung abzudichten. Die Operation beinhaltet das sofortige Nähen der Haut in voller Dicke (die sowohl epidermale als auch dermale Schichten umfasst) über der Amputationsebene, um die Migration von Epithelzellen und den Kontakt mit dem darunter liegenden beschädigten mesenchymalen Gewebe zu behindern. Erfolgreiche Operationen führen zur Hemmung der Blastembildung und der Regeneration der Gliedmaßen. Durch die Kombination dieser chirurgischen Methode mit zeitgenössischen nachgelagerten molekularen und funktionellen Analysen können Forscher beginnen, die molekularen Grundlagen der Funktion und Biologie der Wundepidermis während der Regeneration der Gliedmaßen aufzudecken.

Dieses chirurgische Protokoll ermöglicht die vollständige Hemmung der Wundepidermisbildung (Abbildung 1) und letztendlich die Regeneration der Gliedmaßen. Eine erfolgreiche Operation führt in etwa 2-3 Wochen zu keiner Blastembildung, abhängig von der Größe des Tieres, während Kontrollregenerationsgliedmaßen normalerweise ein Blastema bilden sollten.
Forscher sollten das vernähte Glied alle 2-3 Tage mit bloßem Auge untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte nicht herausgesprungen sind und sich kein Blastema bildet. Wenn eine oder mehrere der Nähte herausspringen, kann sich immer noch eine Wundepidermis bilden, die entweder zu einem kleinen oder großen Blastema und einer erfolglosen Operation führt (Abbildung 2). Darüber hinaus sollten Forscher die vernähte Extremität mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass eine dünne Wundepidermis nirgendwo auf der Amputationsoberfläche sichtbar ist. Zum Vergleich sollten die Forscher auch die regenerierende Extremität untersuchen, die eine Wundepidermis über der Amputationsebene haben und über 2-3 Wochen ein Blastema bilden sollte. Die Wundepidermis erscheint dünn und klar, während die normale Haut bei Leuzismus-, Albino- oder Wildtyp-Axolotlen undurchsichtiger und blassrosa (fast weiß), hellgelb oder dunkelgrün erscheint.
Wenn Forscher Gewebe vor den Blastomenbildungsstadien nach 2-3 Wochen sammeln möchten, sollten sie die vernähten Gliedmaßen vor der Probenentnahme untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben und sich keine kleine Wundepidermis bildet. Darüber hinaus können durch eine sagitale Schnittung durch das vernähte Gliedmaßengewebe und die Durchführung histologischer Analysen zu einem beliebigen Zeitpunkt auch das Vorhandensein der Dermis aus dem gesamten Hautlappen, der die gesamte Amputationsebene umgibt, und das Fehlen einer Wundepidermis überprüft werden (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte der vollständigen Hautlappenoperation. Die Schritte des Protokolls sind hier nummeriert und dargestellt. Die gepunkteten Linien bezeichnen die Amputationsebenen in den Schritten 1 und 3 des Protokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Operationen mit vollem Hautlappen. Repräsentatives Hellfeldbild einer Gliedmaße, die 25 Tage nach der Amputation (dpa) einer erfolgreichen Operation (links), einer erfolglosen Operation (rechts) und einer Kontrollregenerationsextremität (keine Operation) unterzogen wurde. Die erfolgreiche Operation hat eine flache Amputationsebene, auf der der volle Hautlappen vernäht wurde, während sich bei der erfolglosen Operation ein kleines Blastema entwickelt. Pfeilspitzen bezeichnen die Amputationsebene und weiß gepunktete Linien dienen dazu, das Fehlen eines Blastems bei der erfolgreichen Operation und das Vorhandensein von Blastemen bei der erfolglosen Operation zu visualisieren und die regenerierenden Gliedmaßen zu kontrollieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Abbildung 3: Histologische Färbung normaler regenerierender und FSF-vernähter Gliedmaßen. (A-B') Repräsentative Hellfeldbilder von picro-mallory gefärbten Schnitten aus regenerierenden (A-A') und vernähten Axolotlgliedmaßen (B-B') bei 7 dpa. Einsätze in A und B werden in A' bzw. B' dargestellt. Die kollagenschwere Hautschicht kleidet und bedeckt die gesamte Amputationsebene in vernähten Gliedmaßen. Die Amputationsebene wird in A-B durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstabsstäbe repräsentieren 500 μm. Diese Figur wurde von Tsai et al.25 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Die Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen erfordert eine spezialisierte Wundepidermis. Diese Operation hemmt die Bildung der Wundepidermis und kann mit molekularen und funktionellen Techniken kombiniert werden, um die Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es effizient und technisch reproduzierbar ist.Diese chirurgische Methode bietet den Forschern ein Werkzeug, um die Funktion der Wundepidermis zu untersuchen und unser Verständnis dafür zu verbessern, warum diese Struktur für die Regeneration entscheidend ist. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Axolotl vollständig anästhesiert ist, führen Sie die Amputation der Gliedmaßen am distalen Ende der zeugopodialen Skelettelemente mit der Präparierschere durch. Machen Sie dann mit einer Federschere einen kleinen Schnitt im ventralen Teil der Haut.Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette vorsichtig bis etwa zur Mittellinie der zeugopodialen Skelettelemente zurück und legen Sie das darunter liegende Gliedmaßengewebe frei, wobei Sie darauf achten, dass die Haut nicht beschädigt wird. Wenn möglich, verwenden Sie eine stumpfere Pinzette, wenn Sie den Hautlappen in voller Dicke anfassen, um Schäden zu vermeiden. Amputieren Sie das freiliegende darunter liegende Gliedmaßengewebe an der Mittellinie des Zeugopoden mit der chirurgischen Schere, schieben Sie dann das Muskelgewebe mit der chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab.Ziehen Sie die überschüssige Haut in voller Dicke vorsichtig über die Amputationsebene, um das freiliegende darunter liegende Gewebe zu bedecken, und stellen Sie sicher, dass der Hautlappen seine strukturelle Integrität beibehält. Nähen Sie es mit der ventralen Haut in voller Dicke. Mit der Pinzette und der gebogenen Federschere die verbleibende rechte und linke Seite des Hautlappens kreuz und quer in die darunter liegenden ventralen Anteile der intakten Haut einnähen.Wenn Sie fertig sind, stellen Sie sicher, dass kein freiliegendes Gewebe zu sehen ist und dass die Nähte mindestens dreimal fest gebunden und verknotet sind. Als optionale interne Kontrolle führen Sie eine Amputation an der kontralateralen Extremität durch, indem Sie sie auf Höhe des mittleren Zeugopoden mit einer chirurgischen Schere amputieren, dann das Muskelgewebe mit einer chirurgischen Schere zurückschieben und den freiliegenden Knochen kürzen. Legen Sie das Feinfühltuch auf den Boden eines Behälters mit Sulfamerazinlösung auf Eis.Lege dann den Axolotl in den Behälter und wickle die freiliegenden Enden des Tuchs vorsichtig um die Oberseite des Tieres, um es gut mit Feuchtigkeit zu versorgen. Lassen Sie es 30 Minuten bis eine Stunde lang auf Eis, um eine minimale Bewegung während der Genesung von der Narkose zu gewährleisten, und legen Sie es dann in einen statischen Gehäusebehälter mit 0,5 % Sulfamerazinlösung. Axolotl müssen in den ersten 24 Stunden nach der Operation in dieser Lösung verbleiben, um eine Infektion zu verhindern.Dieses chirurgische Protokoll ermöglicht die vollständige Hemmung der Bildung der Wundepidermis und letztendlich die Regeneration der Gliedmaßen. Es ist wichtig, die vernähte Gliedmaße täglich zu inspizieren. Wenn eine oder mehrere der Nähte herausspringen, kann sich eine Wundepidermis bilden, die entweder ein kleines oder großes Blastem und eine erfolglose Operation zur Folge hat.Das sagittale Durchtrennen des genähten Gliedmaßengewebes und die Durchführung histologischer Analysen zu jedem Zeitpunkt können auch das Vorhandensein der Dermis aus dem vollen Hautlappen und die Umrundung der gesamten Amputationsebene in Abwesenheit einer Wundepidermis bestätigen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass der Hautlappen seine strukturelle Integrität behält und die Amputationsebene bedeckt. Das feste Verknoten der Nähte und die Sicherstellung, dass der Lappen sicher ist, ist ebenfalls entscheidend für den Erfolg des Protokolls.Diese Methode kann mit nachgelagerten Analysen, einschließlich RNA-Sequenzierung oder funktionellen Techniken wie ektopischer genetischer Überexpression, kombiniert werden, um neue molekulare Regulatoren der Funktion der Wundepidermis und der Regeneration der Gliedmaßen zu identifizieren.

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

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