Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, zu zeigen, wie automatisierte Verfahren zur Kultivierung und Differenzierung menschlicher IPS-Zellen in neuronale Abstammungen sowie deren automatisierte Bildgebung implementiert werden können. Standardisierte automatisierte Verfahren ermöglichen geringe experimentelle Variationen bei gleichzeitighoher phätotypischer Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus kann das System für die Entwicklung neuer Protokolle angepasst werden.

Die Verfahren werden Joachim Tager und Elisangela Bressan, Post-Docs aus unserem Labor, demonstrieren. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche des automatisierten Systems auf die Prozessansicht ressourceninstrument, und wählen Sie den Ressourceninstrumentenprozess aus. Klicken Sie auf Instrumentenprozess ausführen und führen Sie die HEPA-Haube und die Nachladeprozesse aus.

Wählen Sie die zu ladenden Ressourcen aus, öffnen Sie die Tür und laden Sie die Zellkulturplatten und Einwegtipps in die entsprechenden Positionen, wie in den Popupbildern angegeben. Dann dekontaminieren Sie die Tür mit 70% Ethanol vor dem Schließen und führen Sie den Dekontaminationsprozess. Das System wird 30 Minuten lang durch UV-Strahlung sterilisiert.

Um die Platten mit Kulturmedium oder Dissoziationsreagenz zu beladen, führen Sie den HEPA Haubenschritt aus und öffnen Sie die Tür der Flüssigkeitsabfertigungsstation. Nach der Dekontamination mit 70% Ethanol die Reservoirs auf dem Deck an die zugewiesene Position legen und entdeckeln. Schließen Sie die Tür der Flüssigkeitsabfertigungsstation, und führen Sie dann den InitHepaHood-Ressourceninstrument-Prozess aus, um die HEPA-Haube herunterzufahren.

Um eine automatisierte Kulturmethode auszuführen, klicken Sie in der Kalenderansicht der grafischen Benutzeroberfläche auf Prozessschritt hinzufügen, und wählen Sie die Zellenlinie aus, die im Experiment verwendet werden soll. Verwenden Sie den Assistenten, um das Projekt auszuwählen und den zu verwendenden Stapel zu markieren. Klicken Sie auf die nach rechts gerichtete Pfeilspitze, und navigieren Sie zur nächsten Seite des Assistenten, um den auszuführenden Prozessschritt auszuwählen.

Planen Sie auf der letzten Seite des Assistenten das Experiment, und legen Sie die entsprechenden Parameterdetails fest, die zum Ausführen der Methode erforderlich sind. Klicken Sie dann auf OK. Nach dem Beladen eines 50-Milliliter-Rohrs mit der menschlichen IPS-Zellsuspension, lastbeschichteten Kulturplatten für die Aufnahme der Zellen im Regal und die Aussaat von Platten aus Rohren Verfahren. Um die Zellen im Brightfield-Bildzytometer zu zählen, bereiten Sie automatisch eine 384-Well-Zählplatte mit Zellsuspension auf dem Deck vor und übertragen Sie mit dem Roboterarm die 384-Well-Zählplatte vom Deck auf das Brightfield-Bildzytometer.

Nach dem Zählen bringt das System die Platte in ihre ursprüngliche Position zurück und überträgt eine beschichtete Kultur- oder Assayplatte vom Regal auf das Pipettierdeck. Das System sät dann die Zellen in der benutzerdefinierten Anzahl und Volumen, die für die Platte geeignet sind, und mischt durch Pipetten. Nach der Aussaat wird die Platte für 10 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute für die Zellverteilung auf den On-Deck-Shaker verschoben, bevor sie in den Kohlendioxid-Inkubator übertragen wird.

Um den automatisierten Zusammenfluss zu bewerten, führen Sie die Check Confluency-Methode aus, und wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Kulturplatte und keine Assayplatten enthält. Geben Sie im Detailbereich der Parameter iPSCf_2020 für die Bildaufnahme in die Einstellungen für die Bildanalyse ein. Das System überträgt dann die erste Platte vom Inkubator auf das Brightfield-Bildzytometer und bildet den Zellzusammenfluss ab.

Um die Zellkultur oder die Assayplattenmedien zu ändern, führen Sie die Methode des Medienwechsels von Kulturplatten aus, und wählen Sie einen Stapel aus, der nur Kulturplatten enthält. Das System überträgt die Platten auf das Deck und neigt die Platten, um die Aspiration des Überstandes zu ermöglichen. Der Überstand wird in das Abfallsammelmodul entsorgt und entsorgt die Spitzen und 12 Milliliter frisches Medium werden zu jeder Platte hinzugefügt.

Das System wird dann die Platten neu deckeln und die Platten an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Alternativ, um Medium der Assay-Platten zu ändern, führen Medienwechsel der Assay-Platten-Methode. Um die Zellen zu subkultivieren, führen Sie die Subkultivierung der anhaftenden Zellen Methode und wählen Sie die Charge mit den Kulturplatten, die Subkultivierung benötigen.

Nach dem Wegwerfen des Mediums wird das System die Zellen einmal mit acht Millilitern PBS pro Platte waschen, bevor es den Zellen acht Milliliter 0,5 Millimolar EDTA hinzufügt. Nach acht Minuten auf dem Deck mit Kippmöglichkeit wird die EDTA durch 12 Milliliter frisches Medium pro Platte ersetzt. Das System wird die Platten mit 2.000 Umdrehungen pro Minute für eine Minute schütteln, um die Kolonien zu vertreiben, bevor die Zellen mit fünf Zyklen der Pipetten, um die Kolonien in 50 bis 80 Mikron Klumpen aufzubrechen trituieren.

Die Zellen werden dann in ein 50-Milliliter-Rohr auf dem Deck übertragen, bevor sie in einem Ein-zu-Sieben-Split-Verhältnis gesät werden. Für automatisierte hochgehaltige Zellabbildungen mit hohem Durchsatz führen Sie die Bildgebungsmethode aus und wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Assayplatte und keine Kulturplatten enthält. Das System überträgt dann eine Assayplatte zur Bildgebung an das automatisierte konfokale Mikroskop.

Achten Sie darauf, die richtigen Chargen- und Platten-IDs auszuwählen, während Sie die erforderlichen Prozessschritte ausführen. Die HiPSC-Kulturen sollten täglich auf Wachstum überwacht und auf ihren Anteil an der Konfluenz im Brightfield-Bildzytometer analysiert werden. Nach Passaging und manueller oder automatisierter Systemkultur weisen die Zellen eine typische Stammzell- und Pluripotenzmarkerexpression auf.

Neuronen, die im automatisierten Kultursystem differenziert sind, zeigen eine ähnliche Morphologie und neuronale Netzwerkorganisation wie Neuronen, die manuell kultiviert werden. Nach sechs Tagen Der Differenzierung sind automatisch differenzierte kortikale Neuronen positiv für die neuronspezifische Beta-Tubulin- und oberen kortikalen Schichtmarker-Expression der Klasse III. Nach acht Tagen exprimierten die Zellen auch mikrotubuli-assoziiertes Protein 2, das Nervenzelladhäsionsmolekül, und Synapsin I, sowie kortikale Neuronenmarker.

Sehr niedrige oder gar keine Expression dieser Marker wird in hiPSC beobachtet. Dieses System kann auch verwendet werden, um einen automatisierten Neuriten-Auswuchs-Assay für lebende Zellen zu etablieren, der es ermöglicht, Neuritenlängen über 11 Tage der Differenzierung ohne manuelle Simperat zu messen. Die Verwendung des automatisierten Kultursystems, um mittlere Veränderungen über einen 65-tägigen Kulturzeitraum durchzuführen, erleichtert die hiPSC-Differenzierung in dopaminerge Neuronen mit der erwarteten zellulären Organisation und Morphologie.

Zusätzlich zum Neuritenwachstum können mit diesem hochdurchsatzhohen, hochgehaltigen Format weitere automatisierte phänotypische Assays untersucht werden, die für die Untersuchung der Neurodegeneration relevant sind, z. B. TDP-43-Translokations-RNA-Foci und Alpha-Synuclein-Fibrillenaufnahme.