Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Studien haben gezeigt, dass die BMSCs, die aus dem kranialen Gesichtsknochen gewonnen werden, überlegene Fähigkeiten aufweisen als die aus Axial- und Appendikularknochen. Daher gelten Unterkiefer-BMSCs als die bevorzugte Ressource für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika für kraniofaziale Erkrankungen. Dieses Protokoll kombiniert die Vorteile der Adhärenz des gesamten Knochenmarks und der Sortierung fluoreszierender Zellen, um in kurzer Zeit eine signifikante Anzahl von gereinigten Unterkiefer-BMSCs zu erhalten.

Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal ausprobieren, ist es meiner Meinung nach sehr wichtig, die anatomische Struktur und die funktionelle Bewegung des Rattenunterkiefers zu verstehen, was durch das Anschauen dieses Videos oder das Lesen verwandter Literatur erreicht werden kann. Nachdem Sie die Ratte eingeschläfert haben, legen Sie sie in Rückenlage in einen sauberen Abzug. Die Haut und die Buccinatormuskeln vom beidseitigen Angulus oris bis zum hinteren Bereich des Unterkiefers einschneiden.

Öffnen Sie das Maul der Ratte, indem Sie die Schneidezähne des Oberkiefers und des Unterkiefers mit beiden Daumen in die entgegengesetzte Richtung schieben, um die Unterkieferzähne freizulegen, die am Unterkiefer befestigt sind. Trennen Sie die Wangenmuskulatur und die Sehnen, die an den Coracoiden und dem unteren Rand des Unterkiefers befestigt sind, vollständig. Drücken Sie dann auf die Unterkiefer-Seitenzähne und drehen Sie sie hin und her, bis die Kondylen auf beiden Seiten deutlich freiliegen.

Trennen Sie den Unterkieferkörper vom Schädel und reinigen Sie das adhäsive Weichgewebe auf der Knochenoberfläche mit einer feuchten Gaze. Legen Sie den Knochen in eine 10 Zentimeter große sterile Glasschale, die mit vorgekühltem Minimum an essentiellem Medium Alpha (PBS auf Eis) gefüllt ist, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Schneiden Sie den vorderen Knochen entlang des mesialen Randes des ersten Molaren vom Unterkieferkörper ab, entfernen Sie dann den Unterkieferast einschließlich Coracoid und Kondylus entlang des distalen Randes des dritten Molaren, um die Markhöhle freizulegen.

Füllen Sie eine 10 Zentimeter große sterile Glasschale mit 10 Millilitern alpha-MEM mit 10%FBS. Aspirieren Sie das Medium mit einer 10-Milliliter-Spritze, führen Sie dann die Nadel in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Schale. Spülen Sie die Knochenhöhle mindestens dreimal sowohl von der mesialen als auch von der distalen Seite des Knochens, bis der Knochen weiß wird.

Übertragen Sie das Medium mit den gespülten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 800 U/min und fünf Minuten lang. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit drei Millilitern Alpha-MEM mit 10 % FBS. Legen Sie die Zellen in eine neue 10-Zentimeter-Kulturschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Aspirieren Sie das Kulturmedium und spülen Sie das Geschirr mit PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,25 % Trypsin mit 0,02 % EDTA in die Schale und verdauen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Milliliter Alpha-MEM mit 10% FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 800 U/min. Resuspendieren Sie die Zellen in 120 Mikrolitern PBS mit 10% FBS nach der Zentrifugation. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Blockieren Sie die Zellsuspensionen mit einem Mikroliter Antikörper gegen CD16 bis CD32 bei vier Grad Celsius für 15 Minuten und färben Sie die Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen CD45, FITC-konjugierten Antikörpern gegen CD90 und APC-Antikörpern gegen CD29 bei vier Grad Celsius für eine Stunde im Dunkeln. Die anderen 20 Mikroliter Zellsuspension als ungefärbte Negativkontrolle verwenden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 U/min.

Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern PBS mit 10 % FBS. Fügen Sie 10 Minuten vor der Analyse 10 Mikroliter 0,01 Milligramm pro Milliliter DAPI hinzu. Verwenden Sie 40-Nanometer-Filter, die auf Zentrifugenröhrchen platziert sind, um die Zellen zu filtern, und analysieren Sie die Zellen dann auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer.

Zuerst werden tote Zellen aus der Gesamtzellzahl entfernt, indem DAPI-negative Zellen gating werden, und dann CD29-positive, CD90-positive und CD45-negative Zellen in den ausgewählten Zellen als Ziel-mBMSCs aufgenommen. Sammeln Sie die sortierten mBMSCs in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit fünf Millilitern alpha-MEM mit 10 % FBS. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 U/min und entfernen Sie den Auffangpuffer.

Fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und geben Sie sie dann in eine sechs Zentimeter große Kulturschale. Bei diesem Protokoll klebte ein großer Teil der Zellen am dritten Tag nach der ersten Kultur an der Platte. Nach weiteren drei bis vier Tagen der Kultivierung erreichte die Zellkonfluenz 70 bis 80 %. Die Fluoreszenzzellsortierung wurde verwendet, um mBMSCs zu reinigen, die in den P0-Zellen etwa 81,1 % ausmachten.

Nach einer einwöchigen Kultivierung von P2-mBMSCs in einer Sechs-Well-Platte wurde eine signifikante Menge an koloniebildenden Einheiten beobachtet. Um die Fähigkeit der mBMSCs zur Differenzierung mehrerer Linien zu beurteilen, wurden sie in Osteo-Chondro- und Adipo-Linien induziert. Eine erhöhte Aktivität von ALP, rote Kalkknötchen unter Alizarinrotfärbung und eine erhöhte Expression der osteogenen spezifischen Gene Runx2, Alp, Bsp und Ocn deuteten auf eine osteogene Induktion hin.

Die Öl-Rot-O-Färbung wurde verwendet, um die Adipogenese zu identifizieren. Zahlreiche lipidreiche Vakuolen waren nach neun Tagen Induktion nachweisbar. Darüber hinaus wurde die Expression der adipogenen spezifischen Gene Ppar-gamma-1 und Cebpa erhöht.

Die Proben zeigten eine positive Färbung für Alcianblau während der mikroskopischen Beobachtung der chondrogenen Differenzierung. Darüber hinaus zeigte die Immunfärbung mit Anti-Typ-II-Kollagen-Antikörpern eine verstärkte Akkumulation der Knorpelmatrix. Die Sicherstellung der Lebensfähigkeit von mBMSCs ist in diesem Protokoll sehr wichtig.

Dieser Zweck kann durch die Auswahl des richtigen Versuchstieres, die Operation auf dem Eis und die Verkürzung der Versuchszeit erreicht werden. Unter Verwendung dieses In-vitro-Modells kann man eine hohe Anzahl von proliferativen Unterkiefer-BMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, die anschließende Reaktion auf die Mikroumgebung und andere Anwendungen von Unterkiefer-BMSCs erleichtern kann.