Name: Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Rattenkieferknochenmark mittels Adhärenz und Durchflusszytometrie. Diese Methode liefert reine Zellen für kraniofaziale Therapien.

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Wir danken für die Unterstützung von Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People es Hospital. Die Arbeit dieses Manuskripts wird durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt, Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program und des Projekts "Chen Xing" der Shanghai Jiaotong University.

Alle tierischen Versuchsverfahren in diesem Papier wurden vom Animal Care Committee des Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, genehmigt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten für das Experiment.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle Instrumente, einschließlich Nadelhalter, Pinzette und Schere bei hoher Temperatur oder eingetaucht in 75% Ethanol für 10 min. HINWEIS: Ethanol-Eintauchen sollte nicht zu lang sein, um Zellschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Vorbereiten von Kulturmedien im Voraus, deren Zusammensetzung in Tabelle 1aufgeführt ist. Ergänzen Sie jedes Medium wie unten beschrieben.<ol>
<li>Zubereitung von α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS): Ergänzung des minimalen essentiellen Mediums Alpha (α-MEM) mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin.</li>
		<li>Zubereitung des osteogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung osteogene Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Ascorbinsäure, 1% β-Glycerophosphat und 0,01% Dexamethason.</li>
		<li>Zubereitung eines osteogenen Induktionsmediums: Mischen Sie 70% α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS) und 30% osteogene Differenzierungsmedium.</li>
		<li>Zubereitung des adipogenen Differenzierungsmediums A: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Insulin, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazon und 0,01% Dexamethason.</li>
		<li>Herstellung des adipogenen Differenzierungsmediums B: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,20% Insulin.</li>
		<li>Zubereitung des chondrogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung chondrogener Differenzierung Basalmedium mit 0,01% Dexamethason, 0,30% Ascorbinsäure, 1% ITS, 0,10% Natriumpyruvat, 0,10% Proline und 1% TGF-3. HINWEIS: Das osteogene Differenzierungsmedium muss innerhalb eines Monats nach der Konfiguration aufgebraucht sein. Die effektive Periode des konfigurierten chondrogenen Differenzierungsmediums beträgt 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung und Kultivierung von Ratten-MBMSCs
HINWEIS: Alle experimentellen Operationen sollten so weit wie möglich auf Eis durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
<ol><li>Ernte von Rattenunterkiefern<ol>
<li>Euthanisieren Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten durch CO2 Erstickung. Stellen Sie sicher, dass die Atmung des Tieres gestoppt wird, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.</li>
		<li>Spülen Sie diese Ratten in einem Becher, der 75% Ethanol für 3 min enthält.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in eine saubere Dunstabzugshaube, um Unterkiefer zu ernten. HINWEIS: Sterilisieren Sie die Dunstabzugshaube vor Gebrauch 30 min lang durch ultraviolette Lichtstrahlung.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position. Schneiden Sie die Häute und Buccinator-Muskeln von bilateralen Angulus oris in die hintere Region des Unterkiefers, die der einzige bewegliche Knochen mit niedrigerem Schneidemittel ist. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen 2 cm Schnitt auf jeder Seite des Angulus-Oris zu machen, um ein klares Operationsfeld zu erhalten.</li>
		<li>Öffnen Sie den Mund der Ratte, indem Sie die Kiefer- und Unterkieferschneideschneide schneideinn in die entgegengesetzte Richtung mit beiden Daumen drücken, um die Unterkieferzähne freizulegen, die an der Unterkiefer befestigt sind.</li>
		<li>Trennen Sie die bukkalen Muskeln und Sehnen, die an den Koracoiden befestigt sind, und die untere Grenze des Unterkiefers vollständig ab. HINWEIS: Eine erhöhte Beweglichkeit des Unterkiefers wird während dieses Schritts aufgrund des Mangels an Muskelspannung beobachtet.</li>
		<li>Drücken Sie die unterkieferförmigen hinteren Zähne und drehen Sie sich nach hinten und unten, bis die Kondylen auf beiden Seiten deutlich frei gelegt sind. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Mund der Ratte so weit wie möglich künstlich zu öffnen, um den Condyle zu verrenzieren. Der Unterkiefer ist durch bilaterale Kondylen mit dem Schädel verbunden, so dass die Exposition der Kondylen zur Trennung zwischen Schädel und Unterkiefer führt.</li>
		<li>Trennen Sie den Unterkieferkörper vom Schädel.</li>
		<li>Reinigen Sie das anhaftende Weichgewebe auf der Knochenoberfläche mit einer nassen Gaze.</li>
		<li>Legen Sie den Knochen in eine 10 cm sterile Glasschale, gefüllt mit vorgekühlten minimal α en (α-MEM) oder Phosphatpuffer-Saline (PBS) auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung und Kultivierung der mBMSCs<ol>
<li>Schneiden Sie den vorderen Knochen entlang der mesialen Kante des ersten Molaren vom Unterkieferkörper ab. Entfernen Sie den Unterkiefer-Ramus einschließlich Corakoid und Condyle entlang der distalen Kante des dritten Molaren, um die Markhöhle freizulegen.</li>
		<li>Füllen Sie eine 10 cm sterile Glasschale mit 10 ml α-MEM (mit 10% FBS).</li>
		<li>Verwenden Sie 1 ml Spritze, um α-MEM-Kulturmedium zu aspirieren. Mit der Spritzennadel, die in die Knochenmarkhöhle eingeführt wird, spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Schale. Spülen Sie die Knochenhöhle mindestens 3 Mal von beiden mesialen und distalen Seiten des Knochens, bis der Knochen weiß wurde. HINWEIS: Dies ist der kritischste Schritt, da die Knochenmarkhöhle einer Rattenunterkiefer nicht so offensichtlich ist wie bei langen Knochen und der richtige Punkt, um die Nadel einzusetzen, empirisch bestimmt werden muss. Alle oben genannten Versuchsproben sollten auf Eis gelagert werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten, so dass die Betriebszeit nicht länger als 2 h betragen darf.</li>
		<li>Übertragen Sie das Medium, das die gespülten Zellen enthält, in ein 15 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 800 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) wieder aus. Die Zellen in einer neuen 10 cm Kulturschale aufsieben und bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator brüten.</li>
		<li>Überprüfen Sie die morphologischen Veränderungen und das Wachstum dieser Zellen am 3. Tag der Kultur. Entfernen Sie das Kulturmedium mit nicht haftenden Zellen und Gewebefragmenten. Fügen Sie vorsichtig 10 ml frische α-MEM (mit 10% FBS) hinzu.</li>
		<li>Nach 7 Tagen Kultur erreichten P0-MBMSCs 70% bis 80% Zusammenfluss.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszellensortierung HINWEIS: P0-MBMSCs wurden phänotypisch identifiziert und in erster Linie durch Durchflusszellensortierung gereinigt.<ol>
<li>Das Kulturmedium ansaugen und entsorgen und dann das Gericht mit PBS waschen. Entsorgen Sie die PBS.</li>
		<li>1 ml 0,25% Trypsin mit 0,02% EDTA in die Schale geben. Verdauen Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min, dann fügen Sie 2 ml α-MEM (mit 10% FBS) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen nach der Zentrifugation in 120 l PBS (mit 10% FBS) aus.</li>
		<li>Blockieren Sie diese Zellsuspensionen mit 1 l Antikörper gegen CD16/CD32 bei 4 °C für 15 min.</li>
		<li>100 l der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, die Zellen mit Phycoerythrin (PE)-konjugiertem Antikörper gegen CD45, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte Antikörper gegen CD90 und Allophycocyanin (APC)-Antikörper gegen CD29 bei 4 °C bei 1 h im Dunkelnfärben. Die Konzentration der in diesem Experiment verwendeten Antikörper ist in Tabelle 2dargestellt. Verwenden Sie die anderen 20 L zellsuspension als ungefärbte Negativkontrolle.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 800 x g für 5 min, entsorgen Sie die Suspension und setzen Sie die Zellen in 0,5 ml PBS (mit 10% FBS) wieder auf.</li>
		<li>Fügen Sie vor der Analyse 10 l von 0,01 mg/ml DAPI für 10 min hinzu.</li>
		<li>Verwenden Sie 40 nm Filter, die auf Zentrifugenrohren platziert werden, um die Zellen zu filtern.</li>
		<li>Analysieren Sie die Zellen auf Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer. Stellen Sie die Bedienfelder wie folgt ein. Entfernen Sie zunächst abgestorbene Zellen aus der Gesamtzellenzahl, indem Sie DAPI- Zellen, dann Gate CD29+CD90+CD45- in den ausgewählten Zellen als Ziel-MBMSCs veranlassen.</li>
		<li>Sammeln Sie die sortierten CD29+CD90+CD45- Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) vorgefertigt.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 800 x g für 5 min. Entfernen Sie den Sammlungspuffer, und fügen Sie 1 ml frisches α-MEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Zellen erneut auszusetzen. Dann teller sie in einem 6 cm Kulturgericht.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fähigkeit zur Koloniebildung
HINWEIS: Dieser Schritt wurde ausgeführt, um die Divisionsfähigkeit von mBMSCs zu überprüfen. 15
<ol><li>Wählen Sie die zweite Passage mBMSCs (P2) für dieses Experiment. Wenn der Zellzusammenfluss 80% bis 90% erreichte, sät die Zellen in einem seriellen Gradienten in einer 6-Well-Platte neu, um ihre klonale Proliferationsfähigkeit zu bewerten. HINWEIS: Es wird empfohlen, den Gradienten von 1 x 102 bis 1 x 103 Zellen pro Bohrkörper einzustellen, aber die endgültigen Verdünnungen verschiedener Zelllinien menschlichen oder tierischen Ursprungs wurden empirisch bestimmt.</li>
	<li>Kultur die Zellen in α-MEM (mit 10% FBS) für etwa zwei Wochen, bis eine gute Anzahl der koloniebildenden Einheiten unter Lichtmikroskop gesehen werden konnte. Erfrischen Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.</li>
	<li>Aspirieren und entsorgen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Brunnen mit PBS zweimal für 5 min am Mal. Als nächstes 4% Paraformaldehyd-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und für mindestens 10 min fixieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Brunnen zweimal mit PBS.</li>
	<li>Die Zellen mit kristallvioletter Färbelösung färben und in 37 °C ca. 10 min inkubieren. HINWEIS: Die Färbezeit wird entsprechend eingestellt, bis der gewünschte Farbton erreicht ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Bild unter einem Stereomikroskop und zählen verstreute Zellkolonien, die aus mindestens 50 Zellen bestanden.</li>
</ol>4. Multilineage-Differenzierung von mBMSCs
HINWEIS: Die P2-MBMSCs wurden für nachfolgende Experimente verwendet, sofern nicht anders beschrieben.
<ol><li>Osteogene Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Digest die mBMSCs wie oben beschrieben. Samenzellen mit einer Dichte von 2,5 x 105/cm2 in einer 12-Well-Platte, ergänzt durch 1 ml α-MEM (mit 10% FBS).</li>
		<li>Wenn der Zellzusammenfluss 60-70% erreichte, ändern Sie das Medium in 30% osteogene Induktionsmedien. Kultur die Zellen mit α-MEM (mit 10% FBS) als negative Kontrolle und ändern Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Nachdem während der Osteogenese eine große Anzahl von Kalziumknötchen auftreten, wird empfohlen, das mittlere Austauschmuster alle 2 Tage auf einen mittleren Volumenaustausch umzutauschen, um zu verhindern, dass Osteoblasten schwimmen.</li>
		<li>Nach der Kultivierung für sieben Tage, bewerten Sie die Verkalkung dieser Zellen durch alkalische Phosphatase Färbung16,17.</li>
		<li>Entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Brunnen für 3 min zweimal.</li>
		<li>Dann färben Sie die Zellen mit alkalischer Phosphatase-Färbungslösung und inkubieren bei 37 °C für 10-30 min. HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die gewünschte Farbe zu erhalten.</li>
		<li>Waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Fotografieren Sie unter Lichtmikroskop. Rot pigmentierte sulfierte Granulate stellen die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) dar.</li>
		<li>Nach der Kultivierung der verbleibenden Zellen für weitere 7 Tage, führen Sie Alizarin rote Färbung, um die Mineralisierungskapazität der Zellen zu bewerten.</li>
		<li>Färben Sie die Zellen mit 0,5% Alizarin rote Färbung Lösung nach Zellfixierung für 10 min16,18. Beenden Sie die chromogene Reaktion mit destilliertem Wasser nach 3-5 min. HINWEIS: Die Reaktionszeit kann je nach entwickelter Farbe verlängert werden.</li>
		<li>Schließlich legen Sie die Kulturplatte unter das Lichtmikroskop, um die Wirkung der osteogenen Färbung zu beobachten; rote Knötchen weisen auf Kalziumablagerungen dieser Zellen hin.</li>
	</ol></li>
	<li>Adipogene Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Seed P2 mBMSCs in einer 12 WellPlatte, wie oben beschrieben.</li>
		<li>Nach dem Brunnen zu 90% konfluent werden, Kultur die Zellen mit adipogene Differenzierung Medium A. Verwenden Sie Zellen kultiviert in α-MEM Kulturmedium (mit 10% FBS) als negative Kontrolle.</li>
		<li>Nach 2 Tagen Induktion das Medium A aus dem Brunnen ansaugen und in jedem Brunnen 1 ml adipogene Differenzierungsmedium B hinzufügen.</li>
		<li>Nach einem Tag entfernen Sie Medium B und starten Sie den Zyklus wieder mit Medium A wieder in den Brunnen hinzugefügt. Kultur der Zellen abwechselnd mit Medium A und B.</li>
		<li>Tragen Sie das Differenzierungsmedium A und B abwechselnd für drei Zyklen auf und detektieren Sie die Adipogenese dieser Zellen durch ölrote O-Färbung16,18. HINWEIS: Viele runde und große Lipidtröpfchen können beobachtet werden, indem diese Zellen mit Differenzierungsmedium B für weitere 2 bis 3 Tage kultiviert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit PBS aus.</li>
		<li>Die Zellen mit ölroter O-Färbungslösung beflecken und ca. 3 min bei 37 °C brüten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser.</li>
		<li>Beobachten Sie die Adipogenese unter Lichtmikroskop.</li>
	</ol></li>
	<li>Chondrogenese-Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Seed P2 mBMSCs in 15 ml Zentrifugenrohr mit einer Dichte von 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend ieren die Zellen mit 0,5 ml chondrogene Differenzierung Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.</li>
		<li>Lösen Sie die Kappe des Zentrifugenrohrs und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Erneuern Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Zellen beginnen nach 24 h mit dem Pelletieren. Es wird empfohlen, das Zentrifugenrohr nicht für 48 h zu bewegen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu aspirieren, wenn Sie das Medium wechseln.</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellpellets nach 21 Tagen Induktion mit 4% Paraformaldehyd, gefolgt von Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnitt.</li>
		<li>Nach Derparaffinierung und Hydratation die Dias in alcian blauer Lösung für mindestens 15 min18,19,20,21färben und dann mit destilliertem Wasser waschen, um die Reaktion zu stoppen. Erfassen Sie die Fotos unter Lichtmikroskop.</li>
		<li>Führen Sie für die immunfluoreszierende Färbung von Kollagen Typ II die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Die Dias nach dem Deparaffinierungs- und Hydratationsschritt mit 5 g/ml Proteinase K für 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Dias im Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C.</li>
			<li>1 L KollagenTyp II Antikörper in 200 l Sperrpuffer auf die Dias auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
			<li>Am nächsten Tag die Dias zweimal mit PBS waschen und bei 37 °C für 1 h mit Sekundärantikörpern bebrüten.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Scheiben mit 40,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fotografieren Sie jedes Diaunter unter Fluoreszenzmikroskopie.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Echtzeit-PCR
<ol><li>Extrahieren Sie die gesamte RNA aus mBMSCs mit einem Guanidium isothiocyanat, das auf kommerziell erhältlichem Reagenz basiert.</li>
	<li>Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in komplementäre DNA mit einem handelsüblichen Kit durch. Die Reaktionsbedingungen der Umgekehrten Transkription waren wie folgt: 65 °C für 5 min, 37 °C für 15 min, 85 °C für 15 s.</li>
	<li>Führen Sie Echtzeit-PCR durch, um Osteogenese und Adipogenese-spezifische Gene mithilfe von Primern zu erkennen, die in Tabelle 3 aufgeführt sind. Das PCR-Verstärkungsverfahren war wie folgt: 95 °C für 5 min. 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s für 40 Zyklen.</li>
</ol>

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<li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal%28mesenchymal%29+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Proceedings+Online%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3(2019).</li>
</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um BMSCs von Rattenunterkiefern in vitro zu isolieren, indem ganze Knochenmarkhaftung und fluoreszierende Zellsortierung kombiniert werden, was eine einfache und zuverlässige Möglichkeit ist, proliferative mBMSCs mit starker Differenzierungsfähigkeit zu erhalten. Diese Methode könnte mBMSCs vorläufig durch Durchflusszellensortierung reinigen, aber wenn höhere Anforderungen an die Zellhomogenität bestehen, können präzisere Reinigungsmethoden erforderlich sein.
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Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind nicht-hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark abgeleitet, die starke Proliferationsfähigkeit und Multi-Lineage Differenzierungspotenzialmanifestieren 1,2,3,4. Tatsächlich gelten BMSCs seit ihrer Entdeckung als idealer Kandidat für Knochengewebetechnik und -regeneration. Seit Jahren sind der Iliaskamm oder lange Knochen wie Tibia und Oberschenkelknochen die häufigste Quelle von BMSCs für die craniofacial Regeneration. Orofaziale BMSCs, wie z. B. Unterkiefer-BMSCs (mBMSCs), weisen jedoch einige Unterschiede zu langknochenförmigen BMSCs auf, z. B. unterschiedlicheembryonale Herkunft und Entwicklungsmuster. Unterkiefer entstehen aus neuralen Kammzellen der Neuroektoderm-Keimschicht und durchlaufen eine intramembranöse Verknöcherung, während axiale und anhängliche Skelette aus dem Mesoderm stammen und endochondraler Verknöcherung unterzogen werden. Darüber hinaus haben klinische Beobachtungen und experimentelle Tierstudien immer wieder gezeigt, dass es funktionelle Unterschiede zwischen orofazialen und iliac enkchenen BMSCs5,6,7,8gibt. Berichte haben gezeigt, dass BMSCs, die aus craniofacial Knochen wie Unterkiefer, Kieferknochen und Alveolarknochen abgeleitet wurden, eine überlegene Proliferations-, Lebensdauer- und Differenzierungsfähigkeit aufwiesen als solche von axialen und anhänglichen Knochen9. mBMSCs gelten daher als bevorzugte Ressourcen für zukünftige therapeutische Anwendungen von craniofacial Erkrankungen wie Kerubism, Kiefertumor, Osteoporose des Kieferknochens und Parodontalgewebedefekt10,11,12. Um das Behandlungspotenzial in präklinischen Experimenten zu verstehen, ist es wichtig, eine Methode zur schnellen Isolierung und Kultivierung von mBMSCs in vitro zu etablieren.
In dieser Studie bestand das Ziel darin, gereinigte mBMSCs durch vollständige Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierung zu erhalten. Die anatomische Morphologie der Rattenunterkiefer, die durch Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und histologische Abschnitte deutlich beobachtet wurde, zeigte, dass der trabekuläre Knochen des Unterkiefers zwischen dem Schneidemittel- und dem Alveolarknochen lag. Das Knochenmark aus trabekulären Knochen wurde gespült, um Unterkiefermarkzellen zu erhalten, aber die auf diese Weise kultivierten Zellen waren keine reinen mBMSCs und waren wahrscheinlich aus mehreren Arten von Zellen mit unsicheren Potenzen und verschiedenen Linien wie Zellen aus Knochen, Fett und Endothelzellen13,14bestehen. Der nächste Schritt der Zellreinigung war besonders wichtig. Durchflusszytometrie filtert Zellen durch Erkennung einer Kombination von Zell-Oberflächen-Proteinen und wurde weithin in der Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen angenommen. Die Zellhomogenität ist der Hauptvorteil der Durchflusszytometrie, aber der Prozess bestimmt nicht die Zelllebensfähigkeit und kann zu einer begrenzten Zellausbeute führen. In dieser Studie wurden die P0-MBMSCs, die aus der gesamten Knochenmarkhaftung gewonnen wurden, nach Durchflusszytometrie sortiert, um mBMSCs mit hoher Reinheit und starker Proliferationsfähigkeit zu erhalten.
Diese Studie führt ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für Isolierung, Kultur und Differenzierung von munterdibulären BMSCs von Ratten ein, das eine Kombination aus ganzer Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierte verwendet. Es ist eine zuverlässige und bequeme Methode für Forscher in verwandten Bereichen zu verwenden.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA(1X)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kulturschale</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acutenaculum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adipogenes Differenzierungsmedium</td><td>Cyagen biosciences inc.</td><td>MUBMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Beyotime Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Minimum essentielles Medium</td><td>GE Healthcare HyClone Zellkultur</td><td>SH30265.01B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CollagenII Kaninchen pAb</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen CD16/CD32</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifade Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>APC Anti-Maus/Ratte CD29 Antikörper</td><td>biolegend inc</td><td>102215</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Esco</td><td>AC2-4S8-CN</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoklonaler Antikörper (OX1), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0461-82</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoklonaler Antikörper (HIS51), FITC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>11-0900-85</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>cence</td><td>L500</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenese Differenzierungsmedium</td><td>Cyagen Biosciences Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett-Färbelösung</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE Healthcare HyClone Zellkultur</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Esco</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Magzol-Reagenz (Trizol-Reagenz)</td><td></td>Magen-Mikropipette <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteogenes Differenzierungsmedium</td><td>Cyagen Biosciences Inc.</td><td>MUBMX-90021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Kit</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>QuickBlock Blocking-Puffer</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR1 Premix</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Beyotime Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von mandibularknochenmark mesenchymal stammzellen bei ratten

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Hier präsentieren wir eine effiziente Methode zur Isolierung und Kultivierung von mandibulären Knochenmarkmesenchymalstammzellen (mBMSCs) in vitro, um schnell zahlreiche hochwertige Zellen für experimentelle Anforderungen zu erhalten. mBMSCs könnten in Zukunft aufgrund der hervorragenden Selbsterneuerungsfähigkeit und des Differenzierungspotenzials mit mehreren Linien in therapeutischen Anwendungen als gewebetechnische Zellen bei craniofacial-Erkrankungen und der cranio-maxillofacial Regeneration weit verbreitet sein. Daher ist es wichtig, mBMSCs in großer Zahl zu erhalten.
In dieser Studie wurde das Knochenmark aus dem Unterkiefer gespült und primäre mBMSCs wurden durch den Anbau an ganze Knochenmark-Anhänger isoliert. Darüber hinaus wurden CD29+CD90+CD45mBMSCs durch fluoreszierende Zellsortierung gereinigt. Die zweite Generation von gereinigten mBMSCs wurde für weitere Studien verwendet und zeigte Potenzial in der Unterscheidung in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Mit diesem In-vitro-Modell kann man eine hohe Anzahl von proliferativen mBMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, der nachfolgenden Reaktion auf die Mikroumgebung und anderer Anwendungen von mBMSCs erleichtern kann.

Mit diesem Protokoll haftete ein großer Teil der Zellen am dritten Tag nach der Anfangskultur an der Platte. In der Regel erreichte der Zellzusammenfluss nach zusätzlichen 3-4 Tagen Kultur 70 bis 80 %(Abbildung 1B). Mit fluoreszierender Zellsortierung wurden DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCs18,22, die etwa 81,1% in den P0-Zellen ausmachten (Abbildung 1C) gereinigt.</...

Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Studien haben gezeigt, dass die BMSCs, die aus dem kranialen Gesichtsknochen gewonnen werden, überlegene Fähigkeiten aufweisen als die aus Axial- und Appendikularknochen. Daher gelten Unterkiefer-BMSCs als die bevorzugte Ressource für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika für kraniofaziale Erkrankungen. Dieses Protokoll kombiniert die Vorteile der Adhärenz des gesamten Knochenmarks und der Sortierung fluoreszierender Zellen, um in kurzer Zeit eine signifikante Anzahl von gereinigten Unterkiefer-BMSCs zu erhalten.Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal ausprobieren, ist es meiner Meinung nach sehr wichtig, die anatomische Struktur und die funktionelle Bewegung des Rattenunterkiefers zu verstehen, was durch das Anschauen dieses Videos oder das Lesen verwandter Literatur erreicht werden kann. Nachdem Sie die Ratte eingeschläfert haben, legen Sie sie in Rückenlage in einen sauberen Abzug. Die Haut und die Buccinatormuskeln vom beidseitigen Angulus oris bis zum hinteren Bereich des Unterkiefers einschneiden.Öffnen Sie das Maul der Ratte, indem Sie die Schneidezähne des Oberkiefers und des Unterkiefers mit beiden Daumen in die entgegengesetzte Richtung schieben, um die Unterkieferzähne freizulegen, die am Unterkiefer befestigt sind. Trennen Sie die Wangenmuskulatur und die Sehnen, die an den Coracoiden und dem unteren Rand des Unterkiefers befestigt sind, vollständig. Drücken Sie dann auf die Unterkiefer-Seitenzähne und drehen Sie sie hin und her, bis die Kondylen auf beiden Seiten deutlich freiliegen.Trennen Sie den Unterkieferkörper vom Schädel und reinigen Sie das adhäsive Weichgewebe auf der Knochenoberfläche mit einer feuchten Gaze. Legen Sie den Knochen in eine 10 Zentimeter große sterile Glasschale, die mit vorgekühltem Minimum an essentiellem Medium Alpha (PBS auf Eis) gefüllt ist, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Schneiden Sie den vorderen Knochen entlang des mesialen Randes des ersten Molaren vom Unterkieferkörper ab, entfernen Sie dann den Unterkieferast einschließlich Coracoid und Kondylus entlang des distalen Randes des dritten Molaren, um die Markhöhle freizulegen.Füllen Sie eine 10 Zentimeter große sterile Glasschale mit 10 Millilitern alpha-MEM mit 10%FBS. Aspirieren Sie das Medium mit einer 10-Milliliter-Spritze, führen Sie dann die Nadel in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Schale. Spülen Sie die Knochenhöhle mindestens dreimal sowohl von der mesialen als auch von der distalen Seite des Knochens, bis der Knochen weiß wird.Übertragen Sie das Medium mit den gespülten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 800 U/min und fünf Minuten lang. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit drei Millilitern Alpha-MEM mit 10 % FBS. Legen Sie die Zellen in eine neue 10-Zentimeter-Kulturschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.Aspirieren Sie das Kulturmedium und spülen Sie das Geschirr mit PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,25 % Trypsin mit 0,02 % EDTA in die Schale und verdauen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Milliliter Alpha-MEM mit 10% FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 800 U/min. Resuspendieren Sie die Zellen in 120 Mikrolitern PBS mit 10% FBS nach der Zentrifugation. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.Blockieren Sie die Zellsuspensionen mit einem Mikroliter Antikörper gegen CD16 bis CD32 bei vier Grad Celsius für 15 Minuten und färben Sie die Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen CD45, FITC-konjugierten Antikörpern gegen CD90 und APC-Antikörpern gegen CD29 bei vier Grad Celsius für eine Stunde im Dunkeln. Die anderen 20 Mikroliter Zellsuspension als ungefärbte Negativkontrolle verwenden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 U/min.Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern PBS mit 10 % FBS. Fügen Sie 10 Minuten vor der Analyse 10 Mikroliter 0,01 Milligramm pro Milliliter DAPI hinzu. Verwenden Sie 40-Nanometer-Filter, die auf Zentrifugenröhrchen platziert sind, um die Zellen zu filtern, und analysieren Sie die Zellen dann auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer.Zuerst werden tote Zellen aus der Gesamtzellzahl entfernt, indem DAPI-negative Zellen gating werden, und dann CD29-positive, CD90-positive und CD45-negative Zellen in den ausgewählten Zellen als Ziel-mBMSCs aufgenommen. Sammeln Sie die sortierten mBMSCs in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit fünf Millilitern alpha-MEM mit 10 % FBS. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 800 U/min und entfernen Sie den Auffangpuffer.Fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und geben Sie sie dann in eine sechs Zentimeter große Kulturschale. Bei diesem Protokoll klebte ein großer Teil der Zellen am dritten Tag nach der ersten Kultur an der Platte. Nach weiteren drei bis vier Tagen der Kultivierung erreichte die Zellkonfluenz 70 bis 80 %. Die Fluoreszenzzellsortierung wurde verwendet, um mBMSCs zu reinigen, die in den P0-Zellen etwa 81,1 % ausmachten.Nach einer einwöchigen Kultivierung von P2-mBMSCs in einer Sechs-Well-Platte wurde eine signifikante Menge an koloniebildenden Einheiten beobachtet. Um die Fähigkeit der mBMSCs zur Differenzierung mehrerer Linien zu beurteilen, wurden sie in Osteo-Chondro- und Adipo-Linien induziert. Eine erhöhte Aktivität von ALP, rote Kalkknötchen unter Alizarinrotfärbung und eine erhöhte Expression der osteogenen spezifischen Gene Runx2, Alp, Bsp und Ocn deuteten auf eine osteogene Induktion hin.Die Öl-Rot-O-Färbung wurde verwendet, um die Adipogenese zu identifizieren. Zahlreiche lipidreiche Vakuolen waren nach neun Tagen Induktion nachweisbar. Darüber hinaus wurde die Expression der adipogenen spezifischen Gene Ppar-gamma-1 und Cebpa erhöht.Die Proben zeigten eine positive Färbung für Alcianblau während der mikroskopischen Beobachtung der chondrogenen Differenzierung. Darüber hinaus zeigte die Immunfärbung mit Anti-Typ-II-Kollagen-Antikörpern eine verstärkte Akkumulation der Knorpelmatrix. Die Sicherstellung der Lebensfähigkeit von mBMSCs ist in diesem Protokoll sehr wichtig.Dieser Zweck kann durch die Auswahl des richtigen Versuchstieres, die Operation auf dem Eis und die Verkürzung der Versuchszeit erreicht werden. Unter Verwendung dieses In-vitro-Modells kann man eine hohe Anzahl von proliferativen Unterkiefer-BMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, die anschließende Reaktion auf die Mikroumgebung und andere Anwendungen von Unterkiefer-BMSCs erleichtern kann.

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird.<br...

Isolierung von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen aus Rattenknochen mittels sekundärer Adhärenzmethode

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

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Mesenchymale Stammzellen aus dem Kieferknochenmark haben wichtige Funktionen bei der vielfältigen Differenzierung, Selbsterneuerung und Immunmodulation. Sie haben sich als wichtiges Reservoir für Vorläuferzellen in der Gentherapie, im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin erwiesen. Hier stellen wir eine einzigartige Methode zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Kieferknochenmarks bei Ratten vor.

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Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

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Pankreaskrebs-Stammzellen (CSCs) können in vitro mit der Verankerungsunabhängigen Kugelkulturtechnik vermehrt werden, die ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der CSC-Biologie darstellt und als erster Schritt zur Entwicklung neuartiger CSC-Targeting-Therapien dienen kann. Hier wird die Methodik für die Erweiterung, Analyse und das Targeting von Pankreas-CSCs bereitgestellt.

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