Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen
8. Juli 2020
microRNAs sind an der Pathogenese der IgA-Nephropathie beteiligt. Wir haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Diese neue Methode wird es erleichtern, die Beteiligung von miRNAs an der IgA-Nephropathie zu überprüfen.
Mit dieser Methode kann die Veränderung von microRNAs bei der IGA-Nephropathie anhand eines Kleintiermodells leicht verifiziert werden, wodurch es möglich ist, die IGA-Nephropathie ohne eine menschliche Nierenbiopsie zu untersuchen. Das Protokoll kann neue Einblicke in die Genetik der IGA-Nephropathie liefern, die möglicherweise bei der Entdeckung neuer diagnostischer und therapeutischer Methoden für die Nierenerkrankung hilfreich sein können. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maus richtig betäubt ist, verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um einen drei bis vier Zentimeter großen Mittellinienschnitt in der Bauchdecke der Maus vorzunehmen und beide Seiten der Niere zu identifizieren.
Die Rippen und das Zwerchfell einschneiden, um das Herz freizulegen. Nach dem Einschneiden des rechten Vorhofs injizieren Sie PBS in den linken Ventrikel, bis sich die Nierenfarbe in Hellgelb ändert, was darauf hindeutet, dass der gesamte Körper der Maus mit PBS durchblutet ist. Durchtrenne die Nierenarterie, die Nierenvene und den Harnleiter und entferne dann die Niere.
Homogenisieren Sie die 30-Milligramm-Nierenproben mit einem Silikon-Homogenisator und 700 Mikrolitern Lysereagenz auf Phenol-Guanidin-Basis bei Raumtemperatur. Überführen Sie das Lysat in die Biopolymer-Zerkleinerungsspinnsäule und zentrifugieren Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 15.000 g. Fahren Sie mit der RBNA-Reinigung gemäß den Anweisungen des Manuskripts fort.
Geben Sie nach der letzten Wäsche 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Spin-Säule auf Basis von Kieselsäuremembranen und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 8.000 g, um die RNA zu eluieren. Bereiten Sie für die cDNA-Synthese einen Mastermix mit zwei Mikrolitern Nukleinsäuremix, zwei Mikrolitern Reverser Transkriptase-Mix und vier Mikrolitern Puffer in insgesamt acht Mikrolitern pro Probe vor. Geben Sie acht Mikroliter des Mastermixes in jede Vertiefung eines Acht-Well-Röhrchenstreifens.
Verdünnen Sie die Gesamt-RNA in nukleasefreiem Wasser. Geben Sie dann 12 Mikroliter der gesamten RNA-Lösung in jede Vertiefung des Streifens. Geben Sie die Proben in den Thermocycler und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, dann fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.
Um eine quantitative Echtzeit-PCR durchzuführen, bereiten Sie den Mastermix gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor und geben Sie dann 22,5 Mikroliter des Mastermixes in jede Vertiefung einer 96-Well-Reaktionsplatte. Geben Sie 2,5 Mikroliter der vorbereiteten cDNA in jede Vertiefung. Setzen Sie die Reaktionsplatte in das real-time PCR-Gerät ein.
Programmieren Sie es dann für eine erste Aktivierung bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, Glühen bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Ausdehnen bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden. Quantifizieren Sie die Genexpression mit der Delta-Delta-CT-Methode. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Expressionsniveaus von microRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen unter Verwendung der Nieren von Balb/c-Mäusen als Kontrolle zu untersuchen.
Die Expressionsniveaus von drei IGA-Nephropathie-assoziierten microRNAs wurden gemessen. Die relativen microRNA-Expressionsniveaus der beiden Gruppen wurden mit einem T-Test verglichen, wobei ein P von weniger als 0,05 statistisch signifikant ist. miR-155-5p wurde in der HIGA-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 3,3-fach höher exprimiert, und miR-21-5p wurde in 1,58-fach höheren Konzentrationen exprimiert.
Die miR-1461-5p-Expression unterschied sich nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, eine Maske, Handschuhe und eine Kappe zu tragen und den Labortisch und die Werkzeuge sauber zu halten, um zu verhindern, dass Nukleasen in der Umgebung das Experiment beeinträchtigen. Diese experimentelle Methode wird derzeit in unserem Labor in der Praxis eingesetzt.
Ziel ist es, neue diagnostische und therapeutische Methoden für die IGA-Nephropathie zu etablieren.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt eine zuverlässige Methode zur Detektion der Mikro-RNA-Expressionslevel in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells vor. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der Beteiligung von Mikro-RNAs an der IgA-Nephropathie, ohne dass menschliche Nierenbiopsien erforderlich sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nephrologie
- Micro-RNA-Forschung
- Tiermodelle
Hintergrund
- Die IgA-Nephropathie ist eine Nierenerkrankung, die durch die Ablagerung von IgA in den Glomeruli gekennzeichnet ist.
- Micro-RNAs spielen eine bedeutende Rolle in der Pathogenese verschiedener Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen.
- Das Verständnis der Micro-RNA-Expression kann Einblicke in die Krankheitsmechanismen liefern.
- Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Micro-RNAs erfordern häufig invasive Verfahren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der Mikro-RNA-Spiegel in einem Mausmodell der IgA-Nephropathie.
- Erforschung der genetischen Aspekte der IgA-Nephropathie unterstützen.
- Mögliche diagnostische und therapeutische Ansätze für Nierenerkrankungen untersuchen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von HIGA-Mäusen als Modell für die IgA-Nephropathie.
- Verabreichung einer Anästhesie bei der Maus vor dem chirurgischen Eingriff.
- Chirurgische Techniken zum Zugang zu den Nieren, einschließlich medianer Inzision und Organentfernung.
- Perfusion der Maus mit PBS zur Vorbereitung der Nierenentnahme.
Hauptergebnisse
- Die entwickelte Methode ermöglicht eine einfache Überprüfung von Mikro-RNA-Veränderungen bei der IgA-Nephropathie.
- Erkenntnisse, die mit dieser Methode gewonnen werden, können zu neuen diagnostischen Werkzeugen führen.
- Möglichkeit, neue therapeutische Strategien zur Behandlung der IgA-Nephropathie zu entdecken.
- Entfall der Notwendigkeit menschlicher Nierenbiopsien in vorläufigen Studien.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode vertieft das Verständnis der Beteiligung von Mikro-RNAs an der IgA-Nephropathie.
- Sie eröffnet neue Forschungsansätze zur Genetik von Nierenerkrankungen.
- Der Ansatz könnte die zukünftige Entwicklung von Diagnostik und Therapie erheblich beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht Biopharma-F&E-Teams, die Mikro-RNA-Expression in einem validierten Mausmodell der IgA-Nephropathie zu charakterisieren und unterstützt so die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in Programmen zu Nierenerkrankungen. Durch die Bereitstellung einer reproduzierbaren Methode zum Nachweis veränderter miRNA-Spiegel ohne menschliche Biopsien erleichtert es die frühe Entdeckung von Biomarkern und therapeutischen Zielstrukturen mit verbesserter Vorhersagesicherheit. Der Ansatz entspricht den Bemühungen im Entdeckungsstadium, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und Kandidaten für die präklinische Entwicklung zu priorisieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung von krankheitsassoziierten Änderungen der miRNA-Expression in HIGA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen.
- Operativer Wert: Bietet einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur funktionellen Zielvalidierung mittels qRT-PCR zur Messung der Spiegel von miR-155-5p, miR-21-5p und miR-146a-5p.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er miRNAs identifiziert, die statistisch signifikante Faltungsänderungen aufweisen (z. B. 3,3-fache Erhöhung für miR-155-5p), und diese als potenzielle Biomarker oder Zielstrukturen vorschlägt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare miRNA-Expressionsdaten, die für die Assay-Standardisierung in Entdeckungs-Screening-Kampagnen geeignet sind.
- Operativer Wert: Etabliert ein standardisiertes Protokoll zur RNA-Reinigung und cDNA-Synthese, das mit Hochdurchsatz-qRT-PCR-Plattformen kompatibel ist.
- Assay-Einsatzbereitschaft: Erzeugt normalisierte CT-Werte unter Verwendung der Delta-Delta-CT-Methode, wodurch der Vergleich zwischen Proben und die Bestätigung von Hits ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Nutzen: Verwendet ein krankheitsrelevantes HIGA-Mausmodell, um Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung von miRNA-vermittelten Wegen zu verbinden.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Beurteilung von Veränderungen der miRNA-Expression, die mit der Ablagerung von IgA assoziiert sind, und verringert so die Uneindeutigkeit hinsichtlich des Zielmechanismus vor der Identifizierung eines Leitmoleküls.
- Präklinische Kohärenz: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem konsistente, quantifizierbare Messgrößen aus Nierengewebe über alle Studiengruppen hinweg bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt Hypothesentests bei der Target-Validierung und erzeugt quantitative Ausgaben für Screening- und Analyseworkflows, die Entscheidungen zur Identifizierung von Leitstrukturen informieren.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Aufklärung von Signalwegen durch die Messung von miRNA-Expressionsänderungen, die mit der Pathogenese der IgA-Nephropathie in einem genetischen Mausmodell assoziiert sind.
- Screening: Erzeugt standardisierte, quantitative miRNA-Daten, die zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf Ziel-Signalwege in nachgeschalteten Assays geeignet sind.
- Analytik: Erstellt Delta-Delta-CT-Werte und Faltungsänderungs-Metriken, die es Teams ermöglichen, Bedingungen zu vergleichen und die statistische Signifikanz mithilfe von T-Tests zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet in der Entdeckungsphase gewonnene miRNA-Befunde mit der präklinischen Kontinuität durch die Verwendung eines validierten IgA-Nephropathie-Modells mit phänotypischer Relevanz.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Legt einen wiederverwendbaren Protokollablauf für die RNA-Extraktion und die qRT-PCR fest, der auf mehrere miRNA-Ziele in verschiedenen Nierenerkrankungsprojekten anwendbar ist.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unschärfen durch direkte Messung der miRNA-Dysregulation in einem Krankheitsmodell verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Standardisierung sicher durch definierte Parameter für RNA-Reinigung, cDNA-Synthese und qRT-PCR (z. B. Zentrifugation mit 8.000 G, Inkubation bei 37 °C).
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch statistisch signifikante Expressionsdaten (p<0,05), um Ziele mit starker Krankheitsassoziation zu priorisieren.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von auf miRNA basierenden Biomarkern oder therapeutischen Zielstrukturen basierend auf der Höhe der Faltungsänderung und der Reproduzierbarkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Chirurgie an Nagetieren, im Umgang mit RNA sowie in der qRT-PCR, um einen Nuklease-abhängigen Abbau zu verhindern und die Probenechtheit sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu Homogenisierungsausrüstung, Zentrifuge, Thermocycler und Echtzeit-PCR-Gerät mit Fluoreszenznachweis ab.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich des RNA-Einsatzes (30 mg Niere), der Reagenzvolumina (700 μL Lysepuffer) und der Zyklenbedingungen (Aktivierung bei 95 °C, 40 Zyklen).
- Erfordert die Anpassung der Primer-Sets für spezifische miRNA-Ziele, wobei gleichbleibende Annealing-(55 °C)- und Elongations-(70 °C)-Temperaturen beibehalten werden müssen.
- Auf die Endpunkt-RNA-Analyse beschränkt; liefert ohne zusätzliche Methoden keine räumliche oder Einzelzellauflösung im Nierengewebe.
