Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

3D-Organoidkulturen werden proximal im distalen Lungenepithel entwickelt, das unter Verwendung dieses Protokolls entwickelt wurde. Bereitstellung eines handhabbaren Modells zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der Erhaltung des Lungengewebes oder des krankheitsbedingten Umbaus und dient als effektive Plattform für die Wirkstoffforschung und -validierung. Dieses Protokoll ist mit anderen zellulären Fraktionierungsansätzen zur Gewebedissoziation kompatibel.

Und da epitheliale Vorläuferzellen aus verschiedenen anatomischen Kompartimenten isoliert werden und in vitro ihre Positionsidentität beibehalten, können sie zur Modellierung regionaler Unterschiede in der Lungenreaktion auf exogene oder endogene Reize verwendet werden. Diese Level-Technik kann für die Isolierung verschiedener Subpopulationen von Epithelzellen verwendet werden, einschließlich regionenspezifischer Vorläuferzellen, die kultiviert werden können, um spezialisierte differenzierte Nachkommen zu erhalten, die für die Herkunftsregion repräsentativ sind. Nach Erhalt des Lungengewebes trennen Sie die proximale Luftröhre und die Bronchien vom distalen Lungenepithel, das kleine Atemwege mit einem Durchmesser von zwei Millimetern oder weniger enthält, und dem umgebenden Parenchymgewebe

Geben Sie die Proben in einzelne sterile 150 x 15 Millimeter große Petrischalen und würfeln Sie die distale Gewebeprobe in etwa einen Zentimeter große Würfel. Legen Sie die Stücke in eine saubere 50-Millimeter-Tube und waschen Sie die Taschentücher dreimal mit frisch gekühltem HBSS pro Waschgang. Nach dem letzten Waschen die Taschentücher in eine neue Petrischale geben und die Stücke mit sterilen Anti-Fusseltüchern trocken tupfen.

Verwenden Sie dann eine Zange und eine Schere, um so viel viszerale Pleura wie möglich zu entfernen, bevor Sie das Gewebe in Fragmente mit einem Durchmesser von etwa zwei Millimetern zerkleinern. Für die Verdauung von Gewebefragmenten geben Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter Liberase und 25 Mikrogramm pro Milliliter DNA in 25 Milliliter steriles HBSS in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Und geben Sie etwa zwei bis drei Gramm des gehackten Gewebes in das Röhrchen.

Legen Sie dann die Taschentücher bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln bei 900 Umdrehungen pro Minute für 40 bis 60 Minuten. Verwenden Sie nach 30 Minuten eine 10-Milliliter-Spritze, um das verdaute Gewebe zu zerreiben und die Bildung von Klumpen zu verhindern. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 16-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um das Gewebe fünfmal zu zerreiben.

Führen Sie dann die Suspension mit einer Pipette mit breiter Bohrung wie angegeben unter Vakuumdruck durch eine Reihe von Zellsieben. Nachdem Sie das letzte Sieb mit 20 Millilitern HBSS plus gewaschen haben, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, zentrifugieren Sie die Filtrate, um die isolierten Zellen zu sammeln. Nachdem Sie die Überstände verworfen haben, fügen Sie den Pellets durch vorsichtiges Pipettieren einen Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, bevor Sie die Zellen eine Minute lang mit Eis inkubieren.

Am Ende der Inkubation fügen Sie 10 bis 20 Milliliter HBSS plus Puffer hinzu, um die Lyse zu neutralisieren und die restlichen Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. CD31-positive Endothelzellen und CD45-positive Immunzellen aus dem Pool der Gesamtzellen unter Verwendung der CD31- und CD45-Mikrokügelchen, die an monoklonale antihumane CD31- und CD45-Antikörper und LS-Säulen gemäß dem Herstellerprotokoll konjugiert sind. Für die Färbung der Zelloberfläche für FACS fügen Sie die entsprechenden primären Antikörper in der erforderlichen Konzentration hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit drei Millilitern HBSS plus und markieren Sie die Zellen mit der entsprechenden Konzentration an Fluorophor-konjugiertem Sekundärantikörper für eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit drei Millilitern HBSS plus und resuspendieren Sie die Zellen in einer einmal 10 bis siebten Zellen pro Milliliter HBSS plus Konzentration, bevor Sie die Zellen durch eine Siebkappe in fünf Milliliter Polystyrolröhrchen filtrieren, um die Bildung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen. Fügen Sie dann ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzu, um die durchlässigen Zellen zu färben.

Für die Anreicherung der epithelialen Vorläuferzellen des proximalen Gewebes präparieren Sie die proximalen Atemwege aus der Lunge heraus und öffnen Sie die Atemwege mit einer Schere entlang ihrer Länge, um das Lumen freizulegen. Das Gewebe wird mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Liberase für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln auf einem Mischer bedeckt. Übertragen Sie das Gewebe am Ende der Inkubation in eine sterile 150 x 15 Millimeter große Schale und kratzen Sie mit einem Skalpell vorsichtig die Oberfläche der Atemwege ab, um die luminalen Epithelzellen vollständig aus dem Gewebe zu entfernen.

Spülen Sie anschließend das Geschirr mit fünf Millilitern sterilem HBSS plus Puffer, um alle gelösten luminalen Epithelzellen zu sammeln, und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Suspension wird mit einer 10-Milliliter-Pipette fünfmal nacheinander verzerrt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Anschließend wird die Suspension durch Zentrifugation aufgefangen.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in frischem HBSS plus Puffer auf Eis. Schneiden Sie mit einer Schere das verbleibende Tracheobronchialgewebe entlang seiner Ringe ab, um kleine Gewebestreifen zu erzeugen. In einer neuen Schale zerkleinern Sie die Streifen mit einer einseitigen Rasierklinge in kleinere Stücke und geben Sie die Gewebestücke in C-Röhrchen mit zwei Millilitern Liberase pro Röhrchen.

Verwenden Sie dann das menschliche Lungenprotokoll zwei auf einem gentleMACS automatisierten Dissoziator, um das Gewebe mechanisch weiter zu dissoziieren. Am Ende der Dissoziation werden etwa zwei Gramm zerkleinertes proximales Gewebe in konische 50-Milliliter-Röhrchen übertragen, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Liberase und 25 Mikrogramm pro Milliliter DNA-Lösung enthalten. Am Ende einer 45-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln filtrieren Sie die Gewebeaufschlämmung durch eine Reihe von Sieben, wie für das distale Lungengewebe gezeigt, und fügen Sie dem Filtrat ein gleiches Volumen HBSS plus Puffer hinzu, um die Verdauung zu stoppen.

Geben Sie die isolierten luminalen proximalen Atemwegszellen in das Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Die Zellen können dann durch Mikrokügelchenisolierung angereichert und für interessante Zelloberflächenmarker gefärbt werden, wie für die distalen Lungengewebezellen gezeigt. Die proximalen Atemwege, die von einem pseudo-stratifizierten Epithel ausgekleidet sind, enthalten reichlich basale Vorläuferzellen, die immunreaktiv für das Membranprotein NGFR sind.

Im Gegensatz dazu gibt es bei Epithelzellen, die die Lungenbläschen auskleiden, eine Untergruppe, die eine apikale Membranimmunreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper HTII-280 aufweist, was auf ihre alveoläre Typ-II-Zellidentität hindeutet. Die Depletion von kontaminierenden roten Blut-, Immun- und Endothelzellen durch magnetische Beads führt zu einer signifikanten Anreicherung von Epithelzellpopulationen sowohl in distalen als auch in proximalen Gewebeproben mit entsprechender Steigerung der FACS-Effizienz. Eine weitere FACS-Depletion führt zu hochangereicherten distalen Zellpopulationen, die zusätzlich auf der Grundlage ihrer NGFR- oder HTII-280-Oberflächenfärbung fraktioniert werden können.

HTII-280-positive distale Lungenepithelzellkulturen liefern schnell expandierende Organoide mit einer durchschnittlichen Koloniebildungseffizienz von 10 %Die Immunfluoreszenzfärbung von Tag-30-Kulturen zeigt, dass die lumenhaltigen Organoide überwiegend aus HTII-280- und SPC-positiven distalen Lungenepithelzellen bestehen. Proximale Lungenepithel-Organoide, die aus NGFR-positiven Zellen kultiviert wurden, führen zur Bildung von lumenhaltigen Organoiden am Tag 30 der Kultur mit einer durchschnittlichen Koloniebildungseffizienz von 7,8 %. Die empirische Optimierung der enzymatischen Gewebeassoziation ist entscheidend für die Konservierung von Oberflächenepitopen, die Immunfluoreszenzfärbung und die Anreicherung lebensfähiger Epithelzelluntergruppen für die nachfolgende Generierung regionenspezifischer organisierter Kulturen ermöglicht. Diese Methode kann für die Identifizierung und Anreicherung von Immun-, Gefäß-, Stroma- und Epithelzelluntergruppen sowie für die Entwicklung von Co-Kulturmodellen unter Verwendung von 3D-Organoid-Chip-Plattformen angepasst werden.

Wir haben kürzlich die Verwendung von alveolären Organoiden, die mit dieser Technik erzeugt wurden, als Plattform zur Untersuchung der SARS-CoV-2-Infektion des menschlichen Lungenepithels und zur Validierung von COVID-19-Medikamenten beschrieben.