Name: Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Lernen Sie die effiziente Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenen Gliomgeweben für snRNA-seq und snATAC-seq. Diese Methode ermöglicht transkriptionale und epigenetische Studien zur Erforschung der intratumoralen Heterogenität.

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Wir danken dem Single Cell Open Lab (scOpenLab) am Deutschen Krebszentrum (DKFZ) für hilfreiche Gespräche. Diese Forschung wurde von der Deutschen Krebshilfe, Max-Eder-Programm Fördernummer 70111964 (S.T.) unterstützt.

Frische gefrorene Gliomproben wurden aus der Gewebebank des Nationalen Zentrums für Tumorerkrankungen (NCT) in Heidelberg gewonnen. Die Verwendung von Patientenmaterial wurde vom Institutional Review Board der Medizinischen Fakultät Heidelberg genehmigt und die Einwilligung aller in die Studie einbezogenen Patienten eingeholt.
1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch.</li>
	<li>Vorkühlschläuche, Geschirr, Rasierklingen, Douncer und Stößel auf 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie alle Puffer im Voraus vor. Diese Puffer sind bei Raumtemperatur stabil. Sterilfiltration wird empfohlen, insbesondere für Saccharose. Die Stoffpräparate sind modifiziert von Corces et al.19. Siehe Tabellen 1-7.</li>
	<li>Entfernen Sie Proben aus flüssigem Stickstoff oder -80 °C Gefrierfach und halten Sie sie bis Schritt 2.1 auf Trockeneis.</li>
</ol>2. Gewebedissektion und Dissoziation
<ol><li>Frische gefrorene Gewebeprobe (10-60 mg) in eine vorgekühlte Petrischale geben. Frisches gefrorenes Tuch mit einer Rasierklinge in kleine Stücke auf Eis hacken/ hacken.</li>
	<li>500 μL gekühlter Kernlysepuffer werden in ein vorgekühltes 1,5 ml Röhrchen gegeben. Legen Sie die Gewebestücke in das 1,5-ml-Röhrchen, das den Kernlysepuffer enthält, und geben Sie es in einen Douncer (Materialtabelle). HINWEIS: Es gibt zwei Dounce Homogenisatorstößel: "lose" oder "A" Stößel für die anfängliche Probenreduktion und "tight" oder "B" Stößel für die vollständige Probenhomogenisierung.</li>
	<li>Verdoppeln Sie die Gewebestücke mit dem "losen" Stößel für etwa 20 Hübe, bis die Reibung reduziert ist. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, kann die Probe durch Filtration mit einem 100-mm-Sieb vorgeräumt werden.</li>
	<li>Dounce mit dem "engen" Stößel für 20 Schläge, um eine vollständige Gewebehomogenisierung zu erreichen.</li>
	<li>Das Homogenat (ca. 500 μL) wird in ein vorgekühltes 2 mL Röhrchen überführen. Fügen Sie 1 ml gekühlten Lysepuffer hinzu. Sanft mischen und 5 min auf Eis inkubieren. Vorsichtig mit einer Breitrohrpipettenspitze mischen und während der Inkubation 1-2 mal wiederholen.</li>
	<li>Filtern Sie das gesamte Homogenat mit einem 30 μm Siebgewebe, sammeln Sie es in einem 15 mL Falcon Rohr und geben Sie es wieder in ein neues vorgekühltes 2 mL Rohr um. Ein einzelnes Sieb reicht typischerweise für das gesamte Homogenat aus.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, können Kerne erneut gefiltert werden.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C auf einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ~ 50 μL mit Pellet zurück, das die Kerne enthält. Das Pellet vorsichtig in einem weiteren 1 ml Kernlysepuffer resuspendieren und 5 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4°C. Entfernen Sie den Überstand ohne störendes Pellet, fügen Sie 500 ml 1x Homogenisierungspuffer (HB) hinzu (Tabelle 4) und inkubieren Sie für 5 min ohne Wiederaufwirbeln. Dann resuspendieren Sie die Kerne in einem weiteren 1,0 ml 1x HB.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne vorsichtig in 200 μL 1x HB in ein neues 2,0 ml Röhrchen.</li>
</ol>3. Gradientenzentrifugation
<ol><li>Fügen Sie 200 μL 50% Iodixanollösung (Tabelle 5) hinzu, um eine Endkonzentration von 25% Iodixanol zu erhalten. 10 mal mit Pipette auf 300 ml gut mischen.</li>
	<li>300 μL 29% ige Iodixanollösung (Tabelle 6) werden unter die 25% ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.</li>
	<li>300 μl 35%ige Iodixanollösung (Tabelle 7) werden unter die 29%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden. Achtung: Dieser Schritt erfordert eine schrittweise Entfernung der Pipettenspitze während des Pipettierens, um eine übermäßige Volumenverschiebung zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Proben in eine Schwenkschaufelzentrifuge, drehen Sie sie 20 min bei 3.500 x g bei 4°C mit ausgeschalteter Bremse.</li>
	<li>Entfernen Sie die Proben vorsichtig ohne Zuschütteln und beobachten Sie sie unter Licht. Zwischen der zweiten und dritten Schicht sollte ein klares weißes Band aus 95% reinen Kernen sichtbar sein (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Isolierung von Kernen
<ol><li>Saugen Sie die oberen Schichten an, bis sich die weißen Kerne in der Interphase von 29% -35% banden.</li>
	<li>Sammeln Sie das Kernband in einem Volumen von 200 ml, geben Sie es in ein frisches Rohr und filtern Sie es mit einem 20 μm Filter (Materialtabelle). HINWEIS: Die Kerne müssen vor der Filtration nicht wieder aufgewendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden.</li>
	<li>Zählen Sie Kerne mit Trypan-Blaufärbung auf einem Hämozytometer und aliquoten Kernen für snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. Einzelkern-RNA und ATAC seq
<ol><li>Sofortige Verarbeitung der Kerne unter Verwendung der Einzelzell-Genexpression und einzelliger ATAC-Reagenz-Kits (Materialtabelle). HINWEIS: Die Kernprobenkonzentrationen für das 10x Genomics-System betragen 1500-3000 Kerne pro μL für snRNA-seq und 3500-7000 Kerne pro m μL für snATAC-seq. Die Kerne können mit 1x PBS verdünnt werden.</li>
	<li>Sequenzieren Sie die resultierenden Bibliotheken in der Genomics Core Facility.</li>
	<li>Führen Sie eine Qualitätskontrollanalyse der Daten durch. Kerne werden für die weitere Analyse einbezogen, wenn sie Unique Molecular Identifier (UMI) >1000, die Anzahl der Gene >500 und Prozent der mitochondrialen Gene <5% enthalten und innerhalb des Mittelwerts + drei Standardabweichungen der UMIs und Gene liegen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das Gebiet der intratumoralen Heterogenität befindet sich in einem spannenden Stadium, wobei neuartige Assays und Plattformen entwickelt werden, um das vorhandene Wissen herauszufordern und zu erweitern. Intratumorale Heterogenität ist ein entscheidender Faktor, der zum Fortschreiten der Krankheit und zur Resistenz gegen die derzeitigen Behandlungsmodalitäten bei Gliomen beiträgt28. Jüngste Studien zu Hirntumoren haben sich auf diesen wichtigen Aspektkonzentriert,indem sie einzellige tr...

Diffuse niedriggrade Gliome (LGG), der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen, sind infiltrative Neoplasmen, die häufig in der Gehirnhemisphäre auftreten. LGGs weisen sowohl inter- als auch intratumorale Heterogenität auf, die nicht nur von der Tumorpopulation, sondern auch von den nicht-malignen Zellen angetriebenwird,die an der Tumorentwicklung und -progression beteiligt sind1,2,3,4,5.
In den letzten zehn Jahren gab es eine Lawine genomischer Daten, die im Bereich der Gliome gesammelt wurden. Diese Daten stammen hauptsächlich aus Massentumorsequenzierungsstudien und haben immens zur molekularen Charakterisierung und der aktuellen Klassifizierung von Hirntumoren5,6,7,8,9,10,11beigetragen . Obwohl diese Studien die breite molekulare Landschaft im Zusammenhang mit Gliomen aufzeigten, gibt es immer noch einen enttäuschenden Mangel an Fortschritten bei der therapeutischen Intervention. Eines der Hindernisse für die Behandlungsresistenz bei Hirntumoren ist die Intratumorheterogenität. Um dieses Problem anzugehen, haben sich verschiedene Studien auf die genomische, transkriptomische, proteomische und epigenetische Heterogenität konzentriert, die in einem Tumor auf Einzelzellebene vorhanden ist12,13,14,15,16,17.
Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte technologische Fortschritte im Einzelzellbereich gegeben hat, ist einer der wichtigsten einschränkenden Faktoren die Verfügbarkeit frischer Proben, die benötigt werden, um die Zellen zu isolieren und diese Experimente durchzuführen. Um diese Einschränkung zu überwinden, gab es mehrere erfolgreiche Versuche, Assays wie snRNA-seq und snATAC-seq aus gefrorenem Gewebe durchzuführen, wobei Kerne anstelle von Zellen verwendet wurden18,19. Die meisten dieser Methoden basieren entweder auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Filtrationsstrategien. Sowohl Einzelzell- als auch Einzelkernansätze haben ihre Stärken und Nachteile. Einzelzellansätze pflegen mitochondriale Transkripte, die zwar informativ sein können, aber aufgrund ihrer hohen Häufigkeit auch die Transkriptomabdeckung reduzieren können. Einzelkernisolationsansätze eliminieren einen hohen Prozentsatz der mitochondrialen Fraktion, wodurch eine tiefergehende Abdeckung der Kerntranskripte ermöglichtwird 20.
Es gibt verschiedene kommerziell verfügbare Plattformen, die in den letzten Jahren verwendet wurden, um Einzelzellgenomikdaten zu untersuchen, einschließlich RNA-seq und ATAC-seq. Eine der bekanntesten Plattformen ist die 10x Genomics Chromium-Plattform für einzellige Genexpression und Einzelzell-ATAC-Profiling. Da die Plattform mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern arbeitet, können Ablagerungen oder Aggregate das System verstopfen, was zum Verlust von Daten, Reagenzien und wertvollen klinischen Proben führt. Daher hängt der Erfolg von Einzelzellstudien weitgehend von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.
Das Protokoll, das wir hier demonstrieren werden, ist eine leicht modifizierte Kombination der Protokolle DroNc-seq und Omni-ATAC-seq und verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, die snRNA-seq verwenden, um neurologische Störungen und neuronale Zelltypen im menschlichen Gehirn zu verstehen18,19,21,22,23,24. Das Protokoll verwendet eine Kombination aus enzymatischer /mechanischer Dissoziation gefrorener Proben, gefolgt von Filtration und Gradientenzentrifugation und ermöglicht eine schnelle und genaue Isolierung einzelner Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus dem gleichen Kernpräparat aus Hirntumorproben zu generieren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td>Aktives Motiv</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (aka Optiprep)</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td>Sigma</td><td>63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Zellkern-Isolationskit: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidungsfilter (20 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Safe Lock Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Safe Lock Röhrchen 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Einzelzell ATAC</td><td>10x Genomik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einzelzell-Genexpression</td><td>10x Genomik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (1000 & Mikro; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (200 & Mikro; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

kernisolierung aus frischen gefrorenen hirntumoren für einzelkern-rna-seq und atac-seq

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adulte diffuse Gliome weisen Inter- und Intratumorheterogenität auf. Bis vor kurzem konzentrierte sich die Mehrheit der groß angelegten molekularen Profiling-Bemühungen auf Massenansätze, die zur molekularen Klassifizierung von Hirntumoren führten. In den letzten fünf Jahren haben Einzelzellsequenzierungsansätze mehrere wichtige Merkmale von Gliomen hervorgehoben. Die meisten dieser Studien haben frische Hirntumorproben verwendet, um einzelne Zellen mit Durchflusszytometrie oder Antikörper-basierten Trennmethoden zu isolieren. In Zukunft wird die Verwendung von frisch gefrorenen Gewebeproben aus Biobanken eine größere Flexibilität für Einzelzellanwendungen bieten. Darüber hinaus wird die nächste Herausforderung mit dem Fortschreiten des Einzelzellfeldes darin bestehen, Multi-Omics-Daten entweder aus einer einzelnen Zelle oder derselben Probenvorbereitung zu generieren, um die Tumorkomplexität besser zu entschlüsseln. Daher werden einfache und flexible Protokolle, die die Datengenerierung für verschiedene Methoden wie Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und Single-Nucleus-Assay für Transposase-Accessible Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (snATAC-seq) ermöglichen, für das Feld wichtig sein.
Jüngste Fortschritte im Einzelzellbereich in Verbindung mit zugänglichen mikrofluidischen Instrumenten wie der 10-fachen Genomik-Plattform haben Einzelzellanwendungen in Forschungslabors erleichtert. Um die Heterogenität von Hirntumoren zu untersuchen, haben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung einzelner Kerne aus frischen gefrorenen Gliomen entwickelt. Dieses Protokoll führt bestehende Einzelzellprotokolle zusammen und kombiniert einen Homogenisierungsschritt, gefolgt von Filtration und puffervermittelter Gradientenzentrifugation. Die resultierenden Proben sind reine Einzelkernsuspensionen, die verwendet werden können, um Einzelkern-Genexpression und Chromatin-Zugänglichkeitsdaten aus derselben Kernpräparation zu generieren.

Die Einzelkerngenomik ist ein sich entwickelndes Feld mit begrenzten Daten und Protokollen. Ein kritischer Faktor, der das Ergebnis von Einzelkernassays beeinflusst, ist die Isolierung reiner und intakter Kerne. Wir haben zwei veröffentlichte Protokolle (DroNc-seq- und Omni-ATAC-seq-Protokolle) kombiniert, um in relativ kurzer Zeit hochwertige und reine Kerne aus frischen gefrorenen Gliomgewebeblöcken zu isolieren und so die Stabilität der Transkripte zu erhalten (Abbildung 1).
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Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Das Ziel unserer Methode ist es, Zellkerne aus frisch gefrorenen Tumoren zu isolieren, und das gleiche Zellkernpräparat kann für transkriptionelle und epigenetische Studien verwendet werden. Daher können wir mehrere Schlüsselfragen stellen, wie zum Beispiel: Wie entwickeln sich Tumore während der Progression und wie beeinflussen Therapien die Tumorzusammensetzung? Der größte Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie einfach ist, die Verarbeitungszeit verkürzt und vor allem qualitativ hochwertige Kerne liefert.Durch den Wegfall eines Sortierschritts wird die Belastung der Zellkerne reduziert. Und der andere Vorteil ist seine Fähigkeit, bei archivierten gefrorenen Tumoren eingesetzt zu werden. Ashwin Narayanan, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.Beginnen Sie damit, 10 bis 60 Milligramm frische, gefrorene Gewebeprobe in eine vorgekühlte Petrischalen zu geben. Das frische gefrorene Taschentuch mit einer Rasierklinge auf Eis in kleine Stücke hacken oder hacken. Geben Sie 500 Mikroliter gekühlten Kernlysepuffer auf das Gewebe in der Petrischale.Übertragen Sie dann die Mischung in einen Auswerfer. Die Gewebestücke mit dem losen Stößel ca. 20 Züge lang ausdünsten, bis die Reibung reduziert ist. Dann mit dem festen Stößel 20 Hübe lang aussprechen, um eine vollständige Gewebehomogenisierung zu erreichen.Füllen Sie das Homogenat in ein vorgekühltes Zwei-Milliliter-Röhrchen und geben Sie einen Milliliter gekühlten Lysepuffer in den Douncer, spülen Sie ihn aus und geben Sie ihn in das Röhrchen. Mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis, wobei Sie es während der Inkubation ein- bis zweimal mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung mischen. Filtrieren Sie das gesamte Homogenat mit einem 30-Mikroliter-Siebgewebe und sammeln Sie es in einem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen.Füllen Sie es dann zurück in eine neue, vorgekühlte Zwei-Milliliter-Tube. In der Regel reicht ein einziges Sieb für das gesamte Homogenat aus. Überprüfen Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Trümmer und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen.Kerne müssen nicht rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt sein. Wenn Schmutz vorhanden ist, wiederholen Sie die Filtration. Zentrifugieren Sie anschließend die Kerne fünf Minuten lang auf einer Tischzentrifuge.Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie etwa 50 Mikroliter des kernhaltigen Pellets zurück. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem weiteren Milliliter Kernlysepuffer und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie dann den Überstand, ohne das Pellet zu stören.Fügen Sie 500 Milliliter HB hinzu und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang, ohne sie erneut zu suspendieren. Dann resuspendieren Sie die Kerne in einem weiteren Milliliter HB. Weitere fünf Minuten zentrifugieren, dann den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellkerne in 200 Mikrolitern HB und überführen Sie die Suspension in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie 200 Mikroliter 50%ige Iodixanollösung in die Zellkerne, um eine Endkonzentration von 25%Iodixanol zu erreichen, und mischen Sie 10 Mal, wobei die Pipette auf 300 Mikroliter eingestellt ist. Geben Sie dann 300 Mikroliter 29%ige Iodixanollösung mit einer feinen P1000-Spitze unter die 25%ige Mischung, um ein Vermischen der Schichten zu vermeiden. Geben Sie 300 Mikroliter 35%ige Iodixanollösung mit einer feinen P1000-Spitze unter die 29%ige Mischung und entfernen Sie sie dann langsam.Geben Sie die Proben in eine schwingende Eimerzentrifuge und schleudern Sie sie 20 Minuten lang bei 3.500 G bei vier Grad Celsius, wobei der Bruch abgebrochen wird. Entnehmen Sie die Proben vorsichtig und ohne Schütteln und betrachten Sie sie unter Licht. Zwischen der zweiten und dritten Schicht sollte eine klare weiße Bande aus 95% reinen Kernen sichtbar sein.Um die Kerne zu isolieren, aspirieren Sie die oberen Schichten, um das weiße Kernband an der Grenzfläche freizulegen. Sammeln Sie die Zellbande in einem Volumen von 200 Millilitern und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen. Filtern Sie es dann mit einem 20-Mikrometer-Filter.Überprüfen Sie die Kerne unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Trümmer und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Sie sollten rund sein und die Kernmembran sollte nicht verformt sein. Zählen Sie die Zellkerne mit Trypanblau-Färbung auf einem Hämozytometer und aliquotieren Sie sie für snRNA-seq oder snATAC-seq.Verschiedene Filtrationsschritte ermöglichen zusammen mit der Gradientenzentrifugation die Isolierung reiner Kerne, wobei der Großteil der Ablagerungen verworfen wird. Die gleiche isolierte Zellkernpräparation kann sowohl für Einzelkern-RNA-seq als auch für Einzelkern-ATAC-seq verwendet werden. Da die isolierten Kerne aus derselben Probe stammen, können die generierten Daten mit R-Paketen wie dem Seurat co-eingebettet werden, um Cluster zu generieren und eine Multiomics-Perspektive zu bieten.Um festzustellen, ob das Protokoll mit veröffentlichten Datensätzen vergleichbar ist, wurden die erhaltenen Daten mit vier öffentlich zugänglichen Einzelkern-RNA-seq-Studien verglichen, die sich auf das zentrale Nervensystem beziehen. Alle Datensätze wurden zusammengeführt und die Verteilung der Anzahl der UMIs und Gene mit Hilfe eines Violin-Plots visualisiert. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die Methode mit dem neuesten snRNA-seq-Protokoll vergleichbar ist.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, besonders vorsichtig zu sein und die Schichten während der Gradientenzentrifugation und der Kernisolierung nicht zu vermischen.

nuclei-isolation-from-fresh-frozen-brain-tumors-for-single-nucleus

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe. Die isolierten Einzelkerne können als Proben für Sequenzierungstechniken wie die Einzelkern-RNA (snRNA)-Sequenzierung und die Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin (snATAC)-Sequenzierung verwendet werden, um tiefere Einblicke in die inter- und intratumorale Heterogenität zu erhalten, die bei Gliomen des zentralnervösen Gewebes beobachtet wird.

Isolierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe: Eine Methode zur Gewinnung intakter Zellkerne aus Gliomtumorproben

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus schockgefrorenem, archiviertem Lebergewebe für Einzelkern-RNA-seq, ATAC-seq und Gelenk-Multiomics (RNA-seq und ATAC-seq) vor.

Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Lebergewebe für Einzelzell-Multiomics

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.

Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

Lernen Sie die effiziente Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenen Gliomgeweben für snRNA-seq und snATAC-seq. Diese Methode ermöglicht transkriptionale und epigenetische Studien zur Erforschung der intratumoralen Heterogenität.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

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