Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Durch die effiziente Induktion von Punktmutationen mit dem CRISPR-vermittelten Cytosin-Basis-Editor kann die Funktionalität von BRCA1-Varianten, die für die Prävention und Diagnose von Krankheiten wichtig ist, identifiziert werden. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie direkt endogen ausgedrücktes BRCA1 mutiert, was die Einschränkung der funktionellen Bewertung mit exogen exogen exogen ausgedrücktem BRCA1 überwindet. Die Identifizierung des Verlusts von Funktionsmutationen von BRCA1 kann verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Krebserkrankungen im Zusammenhang mit BRCA1-Mutationen, wie Brust-, Eierstock-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, vorherzusagen.

Es kann auch verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffziele zu finden, indem nach essentiellen Genen gesucht wird, deren Lebensfähigkeit durch funktionelle Erschöpfung reduziert wird. Um zu beginnen, erhalten Sie die BRCA1 Genomsequenz von GenBank bei NCBI und durchsuchen Die 20 Basispaar-Zielstellen mit der protospacer benachbarten Motivsequenz, NGGNCCN, um die Mutation von Interesse. Die Mutation des Interesses sollte innerhalb von vier bis acht Nukleotiden im PAM-distalen Ende der Guide-RNA-Zielsequenzen liegen.

Bestellen Sie zwei kostenlose Oligonukleotide pro Guide RNA. Für die Vorwärtsoligonukleotide CACCG an das 5'Ende der Führungssequenz und für die umgekehrten Oligonukleotide hinzufügen, AAC zum 5'End und C zum 3'End hinzufügen. Nach Erhalt der Oligonukleotide in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar aussetzen.

Mischen Sie die beiden kostenlosen Oligonukleotide zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren mit T4-Ligationspuffer und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, dann kühlen Sie sie auf Raumtemperatur für das Glühen. PRG2 mit dem Restriktionsenzym Bsa1 für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdauen, dann das verdaute Produkt auf einem 1%Agarose-Gel laufen lassen und das entsprechende Band reinigen. Ligate das geglühte Oligonukleotid-Duplex mit der gekauften DNA-Ligase gemäß dem Herstellerprotokoll in die Vektor-DNA und wandelte sie in DH5-alpha-fähige Zellen um.

Fügen Sie die Transformanten zu einer Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin hinzu und brüten Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Reinigen Sie die Plasma-DNA von mehreren Transformationsmitteln und analysieren Sie ihre Leitenden RNA-Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung mit Primern, die am U6-Promotor grundieren. Säen Sie fünfmal 10 bis die fünften HAP1-BE3-Zellen pro Brunnen in 24-Well-Platten einen Tag vor der Transfektion und kultivieren sie, um 70 bis 80% Konfluss für die Transfektion zu erreichen.

Transfekte BRCA1-Targeting-Führungs-RNAs mit den gekauften Transfektionsreagenzien gemäß dem Herstellerprotokoll. Verwenden Sie ein Mikrogramm BRCA1-Targeting-Guide-RNAs, um die CG-zu-TA-Konvertierung an BRCA1-Zielstandorten zu induzieren und die Zellen dann alle drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius und Subkultur zu inkubieren. Ernten Sie die Zellpellets drei, 10 und 24 Tage nach der Transfektion, um die Effizienz der Basisbearbeitung zu analysieren.

Extrahieren Sie genomische DNA mit dem genomischen DNA-Reinigungskit. Entwerfen Sie die ersten PCR-Primer, um BRCA1-Zielstandorte zu erweitern. Obwohl es keine Beschränkung auf die Größe des ersten PCR-Produkts gibt, wird eine Produktgröße von weniger als einem Kilobasis empfohlen, um eine bestimmte Region effizient zu verstärken.

Entwerfen Sie die zweiten PCR-Primer innerhalb des ersten PCR-Produkts unter Berücksichtigung der Größe des Amplicons entsprechend der NGS-Leselänge. Um wesentliche Sequenzen für die NGS-Analyse anzuhängen, fügen Sie zusätzliche Sequenzen zu den 5'Enden der zweiten PCR-Primer hinzu. Amplizieren Sie die BRCA1-Zielstellen auf der genomischen DNA, die aus den drei Zeitpunkten mit High-Fidelity-Polymerase gewonnen wird.

Für die erste PCR-Reaktion verwenden Sie 100 Nanogramm genomische DNA für die Amplifikation über 15 Zyklen. Für die zweite PCR-Reaktion verwenden Sie einen Mikroliter des ersten PCR-Produkts für die Verstärkung über 20 Zyklen. Führen Sie fünf Mikroliter des zweiten PCR-Produkts auf 2%Agarose-Gel aus und bestätigen Sie die Größe.

Fügen Sie dann die wesentlichen Sequenzen für die NGS-Analyse an, indem Sie das zweite PCR-Produkt mit den im Textmanuskript aufgeführten Primern verstärken. Verstärken Sie jedes Sample mit verschiedenen Primer-Sets. Verwenden Sie einen Mikroliter des zweiten PCR-Produkts für bis zu 30 Zyklen der Verstärkung mit einer Hochtreue-Polymerase.

Führen Sie fünf Mikroliter des PCR-Produkts auf 2%Agarose-Gel aus, um die Größe zu bestätigen und das Amplicon mit einem kommerziellen PCR-Reinigungskit zu reinigen. Mischen Sie jedes Beispiel in gleichen Mengen, um eine NGS-Bibliothek zu erstellen. Quantifizieren Sie die NGS-Bibliothek mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie mit einem Nanomolar auf eine Konzentration von einem Nanomolaren mit Resuspensionspuffer oder 10 Millimolar Tris-HCl bei pH 8,5.

Bereiten Sie 100 Mikroliter der Bibliothek auf die entsprechende Belastungskonzentration verdünnt. Als Steuerung kombinierte PhiX mit der verdünnten Probe. Laden Sie die Bibliothek auf die Kassette und führen Sie NGS gemäß dem Herstellerprotokoll aus.

Erhalten Sie mehr als 10.000 Lesevorgänge pro Zielamplikon für eine gründliche Analyse der Basisbearbeitungseffizienz. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine funktionelle Bewertung von endogenen BRCA1-Varianten durchzuführen, die von CRISPR-basierten Cytosin-Basis-Editoren generiert wurden. CAS-9 und Guide RNAs wurden in HAP1-Zelllinien transfiziert, um BRCA1 zu stören, und Mutationsfrequenzen wurden analysiert.

Mutationsfrequenzen in HAP1-Zelllinien verringerten sich im Laufe der Zeit signifikant, was darauf hindeutet, dass BRCA1 ein wesentliches Gen für die Zelllebensfähigkeit in diesen Zellen ist. Um zu untersuchen, ob CG-ta-substituierte Varianten die Funktion von BRCA1 beeinflussen, wurden die DNA-Plasmide und Diekodierungs-Führungs-RNAs, die jede Mutation induzieren konnten, mit HAP1-BE3-Zelllinien transfiziert. Und die Substitutionsfrequenzen wurden analysiert.

Die relativen Substitutionsfrequenzen von 3598C bis T, einer pathogenen Variante, die eine Nonsense-Mutation induziert, nahmen dramatisch ab. Während die von 4527C bis T, einer gutartigen Variante, die eine Nonsense-Mutation induziert, mit der Zeit ähnlich blieben. Es wurde festgestellt, dass die Nukleotidsubstitutionsfrequenzen dieser drei Varianten zeitabhängig abnahmen.

Da es notwendig ist, eine hohe Anfangsmutationshäufigkeit zu erhalten, um die Veränderung der Zelllebensfähigkeit mit dem Ablauf des Datums deutlich zu erkennen, ist es eine Priorität, optimierte Transfektionsbedingungen zu etablieren. Dieses Verfahren kann zur Überprüfung anderer unbekannter genetischer Varianten wie BRCA VUS angewendet werden. Es kann Hinweise auf die Pathogenität von Patienten abgeleiteten unbekannten Varianten und deren Behandlung liefern.