Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Diese Methode kann verwendet werden, um die koronare Mikrozirkulation in lebendem Herzgewebe von Mäusen und Gefäßbaumkomponenten durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses zu untersuchen. Diese Methode bietet eine nützliche Plattform, um die Funktion der Mikrozirkulation von Perizyten und Reagenzien im Herzen zu untersuchen, indem wir dazu neigen, den Gefäßdurchmesser und den arteriolischen Luminaldruck zu messen. Um eine Kanüle für das Experiment vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenabzieher, um zwei Kanülen mit langen, dünnen Spitzen aus einem einzigen sauberen Borosilikatglasröhrchen herzustellen.

Schneiden Sie die Spitze jeder Kanüle mit einer feinen Schere und einem Präpariermikroskop auf einen endgültigen Spitzendurchmesser von 100 bis 150 Mikrometern ab und polieren Sie die Spitzen feuerhart, um die scharfen Kanten leicht abzurunden. Verwenden Sie einen Platindraht, der an der Seite des Schafts positioniert ist, etwa zwei Millimeter von der Spitze entfernt, um die Kanüle entlang des Schafts in einem Winkel von etwa 45 Grad zu biegen, und führen Sie das offene Ende der Kanüle in den Kanülenhalter ein. Ziehen Sie dann die Armatur fest und spülen Sie die Kanüle und den Schlauch mit einer Fünf-Milliliter-Spritze mit der Tyrode-Lösung.

Montieren Sie den Kanülenhalter auf die Mikromanipulation einer Druckmyographenkammer. Um ein Mausherz für das Experiment zu sammeln, geben Sie zunächst ein Paar ein und injizieren Sie 500 Mikroliter Heparin in eine betäubte acht bis 16 Wochen alte C 57 schwarze Sechsermaus. Setzen Sie die Maus nach 10 Minuten in Rückenlage auf ein beheiztes Bett und stabilisieren Sie die Pfoten mit Beschriftungsband.

Verwenden Sie eine Pinzette und eine chirurgische Schere, um einen Schnitt in die Bauchhaut oberhalb des Zwerchfells zu machen, und schneiden Sie das Zwerchfell und das Brustbein durch, um die Dissektion des Herzens aus der Brusthöhle zu ermöglichen. Legen Sie das Herz in eine eiskalte Tyrode-Lösung, die 30 Millimolare BDM enthält, und entfernen Sie bei Bedarf jegliches Bindegewebe aus dem Herzen. Legen Sie dann das Herz in eine vorgekühlte Präparierkammer, die mit frischer Tyrode-Lösung gefüllt ist, die mit 30 Millimolar BDM ergänzt ist.

Um die Septumarterie für die Kanülierung vorzubereiten, schalten Sie den Servo-Pomp ein und stellen Sie den Druck des Servoreglers auf den Flow-Modus ein. Im Herzen auf das PDMS, wobei darauf zu achten ist, dass der mittlere Bereich des Gewebes nicht beschädigt wird, und das Gewebe unter ein Präpariermikroskop zu legen. Entfernen Sie einen oder beide Vorhöfe und schneiden Sie den rechten Ventrikel auf.

Entfernen Sie die rechte ventrikuläre freie Wand und legen Sie die Septumarterie frei. Verwenden Sie einen Nylonfaden mit einem Durchmesser von 30 Mikrometern, um einen losen Knoten um die Septumarterie zu binden. Mit einer feinen Schere die linksventrikuläre freie Wand entfernen und die Apparatur der Papillenmuskulatur in die Experimentierkammer überführen.

Führen Sie mit einem Mikromanipulator eine Kanüle in die Septumarterie ein und sichern Sie die Kanüle mit der Naht. Befestigen Sie dann den Papillarmuskel mit Stiften am Kammerboden, wobei die Spitze der Kanüle parallel zur Arterienwand verläuft, so dass eine freie Sicht auf das Gefäßsystem möglich ist, und spülen Sie mit der Spritze die Lösung nach und nach durch die Kanüle. Um die Gewebepräparation zu stabilisieren, schalten Sie eine Peristaltikpumpe ein und schmelzen Sie das Präparat kontinuierlich mit vorvergaster physiologischer Kochsalzlösung bei einer Durchflussrate von drei bis vier Millilitern pro Minute, schalten Sie den Temperaturregler für die Superfusionslösung ein und stellen Sie die Temperatur des Badsuperfusats auf 35 bis 37 Grad Celsius ein.

Schließen Sie die Kanüle an die Servopumpe an und stellen Sie den Durchfluss so ein, dass der Druck auf etwa 10 Millimeter Quecksilbersäule eingestellt wird. Lassen Sie die Superfusion etwa 10 Minuten lang laufen, erhöhen Sie dann den Fluss der luminalen Lösung, um den Arteriendruck auf etwa 60 Millimeter Quecksilbersäule einzustellen, und lassen Sie die Probe unter Überwachung 30 bis 60 Minuten lang stabilisieren. Um die Probe mit Weizenkeim-Agglutinin zu beladen, perfundieren Sie das Präparat mit fünf Millilitern Tyrode-Lösung, ergänzt mit 100 Mikrogramm Alexa Fluor-488 konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin.

Wechseln Sie nach 30 Minuten die Perfundhilfe wieder auf die normale Tyrode-Lösung und schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein. Verwenden Sie das Mikroskop mit einer geringeren Vergrößerungsstärke, um die Septumarterie im Durchlichtmodus zu lokalisieren, und beginnen Sie mit der Bildgebung mit dieser konfokalen Spinning-Disc. Wählen Sie eine 40-fache Objektivvergrößerung und den 488-Nanometer-Anregungslaser und passen Sie die Laserintensität und die Abtastrate an.

Um den Bildgebungsbereich zu definieren, legen Sie die obere und untere Bildgebungsposition für das Mikroskop fest und legen Sie die Schrittweite und die Z-Stapel-Bildgebungsparameter fest. Wählen Sie dann einen Ordner zum Speichern des Bildes aus und klicken Sie auf Ausführen, um mit der Aufnahme der Bilder zu beginnen. Wenn ein Fluoreszenz-Gefäßmarker in das Gefäßlumen perfundiert wird, ist es möglich, ganze Gefäßbäume mit Hilfe der konfokalen Hochgeschwindigkeitsmikroskopie sichtbar zu machen.

Eine weitere Vergrößerung ermöglicht eine detaillierte Abbildung der Kapillare. Wenn Pinacidil und ATP-empfindlicher Kaliumkanalagonist aus dem Lumen verabreicht werden, vergrößert sich der Durchmesser der Arterien. Beim Vasokonstriktor Endothelin wird eines aus dem Lumen aufgetragen.

Der Durchmesser der Arterien nimmt ab. Wenn der eingestellte Durchfluss konstant ist, steigt der luminale Druck. In diesen Bildern des papillären Gewebes einer transgenen Maus mit NG zwei DS rot exprimieren können sowohl die Kapillaren als auch die Perizyten innerhalb des papillären Muskelgewebes sichtbar gemacht werden, unter Bedingungen, die die Physiologie lebender Tiere besser nachahmen.

Es ist wichtig, dass sich zu keinem Zeitpunkt des Eingriffs Blasen im Schlauch befinden. Durch die Kombination dieser Methode mit optischen Bildgebungsverfahren kann das Präparat verwendet werden, um die Mikrozirkulation im Herzen und die interzelluläre Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen unter Verwendung von transgenen Mäusen mit Fluoreszenztechnologie zu untersuchen.