Ein Ansatz zur Untersuchung formabhängiger Transkriptomik auf einer Ebene einer einzelzelligen Ebene
November 2nd, 2020
Dieses Papier stellt Methoden für den Anbau von Herzmyozyten mit verschiedenen Formen, die verschiedene Pathologien darstellen, und das Sortieren dieser anhaftenden Herzmyozyten basierend auf ihrer Morphologie auf einer einzelnen Zellebene. Die vorgeschlagene Plattform bietet einen neuartigen Ansatz für hohe Durchsatz- und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Wir schlagen eine neuartige Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der Zellform auf die Genexpression vor, indem Methoden zum Anbau und Sortieren von Aufhaltungen mit verschiedenen Morphologien auf Einzelzellebene verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Untersuchung der Zellform in vitro mit hohem Durchsatz erleichtert, da der Vergleich von Zellen mit verschiedenen Formen in vivo technisch anspruchsvoll ist. Um eine gemusterte Kardiomyozytenkultur einzurichten, übertragen Sie eine Kardiomyozytensuspension im Seitenverhältnis von Interesse auf eine 15-Milliliter-Röhre zum Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter geeigneter Beschichtungsmediumkonzentration.
Fügen Sie zwei Milliliter Zellen auf einen fibronectin beschichteten mikrogemusterten Chip in zwei Milliliter warmes Beschichtungsmedium in einer 35 Milliliter Grenier Petrischale und legen Sie die Schale in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für 18 Stunden. Überprüfen Sie am nächsten Tag den Chip mit lichtmikroskopischer Mikroskopie, um zu bestätigen, dass die meisten Zellen angebracht sind. Entfernen Sie das Medium aus der Schale, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen, und beginnend von der Mitte und in Richtung der Seiten in einer tropfenweise Weise, sanft HINZUFÜGEN PBS zu den Zellen.
Nach der dritten Wäsche das PBS durch ein Vier-Milliliter-Wartungsmedium ersetzen und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Nach 72 Stunden die Spanoberfläche zwei Mal vorsichtig mit zwei Millilitern warmer Dulbecco-PBS pro Waschgang spülen und den gewaschenen Chip sofort auf eine neue sterile 35 Milliliter Grenier Petri Schale übertragen. Fügen Sie schnell 1,5 Mikroliter lebendiges Dicycle Grün verdünnt 1000-fach in DPBS auf den Chip.
Befestigen Sie eine Kammer über dem Chip und legen Sie die Schale auf den Tellerhalter der Zelle Picker-Bühne. Setzen Sie die Magnetkappe ein und suchen Sie das Fadenkreuz im Live-Ansichtsfenster. Konzentrieren Sie sich auf das Fadenkreuz und wählen Sie im Scan- und Sortierfenster die Kalibrierung für die automatisierte Injektion und Kalibrierung aus.
Ersetzen Sie den Tellerüberstand durch 1,5 Milliliter eines 1:1-Triple-E in DPBS-Lösung, um die Zellen aus dem Fibronectin zu lösen und die Scan-Registerkarte zu öffnen. Um den gesamten Chip zu scannen, konzentrieren Sie sich auf die obere linke Ecke des Chips im Sichtfeld und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition. Als nächstes konzentrieren Sie sich auf die untere rechte Ecke des Chips und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition.
Klicken Sie im Popup-Fenster auf Schärfste auf festlegen, und klicken Sie auf Rechts oben und gehen Sie zu den linken oberen Schaltflächen. Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um mit dem Scannen zu beginnen. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und klicken Sie auf Karte anzeigen, um die einzelnen Zellen auszuwählen, die die Studienkriterien bestehen.
Zentrieren Sie die Glasmikrokapillare in der Mitte des Mikroskops Live-Ansicht und öffnen Sie die Pumpe Lasche. Um ein Vakuum zu erzeugen, ziehen Sie den Kolben von einer 50 Milliliter Spritze Nummer eins vier Milliliter ein und öffnen Sie die Sortierlasche. Um die Kommissionierung einer einzelnen Zelle zu ermöglichen, stellen Sie das Ventil zwei für 120 Millisekunden und das Ventil 1 für 20 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 200 Millisekunden ein.
Damit die entnommene Zelle erfolgreich in ihren PCR-Rohr mit Lysepuffer geliefert werden kann, stellen Sie das Ventil 1 für 20 Millisekunden und das Ventil zwei für 10 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 10 Millisekunden ein. Wenn die Ventileinstellungen angepasst wurden, klicken Sie auf Pfad berechnen. Die Software berechnet den schnellsten Pfad von Zelle zu Zelle für die Aufnahme und Injektion der ausgewählten Zellen im gesamten Chip.
Konzentrieren Sie das Mikroskop dann auf ein Muster auf der Spanoberfläche. Verwenden Sie den Joystick, um die Mikrokapillare vorsichtig nach unten zu bewegen, so dass das schärfste Bild der Spitze der Mikrokapillare erhalten werden kann, ohne die Spanoberfläche zu berühren und auf Set zu klicken. Es öffnet sich ein neues Fenster, das den Mikrokapillarquerschnitt zeigt.
Um die Software den Spitzenversatz der Kapillare in den X-, Y- und Z-Koordinaten aufzeichnen zu lassen, klicken Sie auf die genaue Mitte der Kapillare. Klicken Sie dann auf Sortieren starten, um die Sortierung zu starten. Bei dieser repräsentativen Analyse der vorverstärkten cDNA aus einer entnommenen Einzelzelle wurde ein klares Band im Gel wie densitometry-Plot beobachtet, das dem Peak bei 1, 852 Basenpaaren im Elektropherogramm entspricht.
Die durchschnittliche Größe der Fragmente betrug 1, 588 Basenpaare mit einer kleinen Anzahl von Fragmenten, die kürzer als 300 Basenpaare waren, was auf die Generierung einer guten cDNA-Bibliothek hinweist. Immunfluoreszierende Färbung und Analyse können auch durchgeführt werden, um die Sarkome-Struktur innerhalb der gemusterten Kardiomyozyten zu bewerten. Diese Plattform ebnet den Weg für Hochdurchsatzstudien und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Überblick
Diese Studie stellt eine neuartige Plattform für das Wachstum und die Sortierung von kardialen Myozyten auf der Grundlage ihrer Morphologie auf Einzelzellebene vor. Diese Methode ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Herzmyozytenkultur
- Zellmorphologieanalyse
- Methoden des Medikamentenscreenings
Hintergrund
- Herzmyozyten zeigen verschiedene Formen, die mit unterschiedlichen Pathologien korrelieren.
- Die Untersuchung von Zellformeffekten auf die Genexpression ist in vivo schwierig.
- Hochdurchsatz-Techniken sind für ein effektives Medikamentenscreening unerlässlich.
- Aktuelle Methoden mangelt es an Effizienz bei der Sortierung und Analyse einzelner Zellen basierend auf der Morphologie.
Zweck der Studie
- Eine Plattform für die Untersuchung der Auswirkungen der Zellform auf die Genexpression zu entwickeln.
- Die Sortierung von Herzmyozyten basierend auf ihrer Morphologie zu erleichtern.
- Die Prozesse des Medikamentenscreenings für Herzinsuffizienzbehandlungen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung und Verdünnung von Kardiomyozytensuspensionen.
- Verwendung von Fibronektin-beschichteten mikrogemusterten Chips für die Zellkultur.
- Lichtmikroskopie zur Bestätigung der Zellhaftung.
- Automatisiertes Scannen und Sortieren einzelner Zellen unter Verwendung eines Mikrokapillarsystems.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anhaftung und Aufrechterhaltung von gemusterten Kardiomyozyten.
- Erzeugung einer guten cDNA-Bibliothek aus sortierten Einzelzellen.
- Immunfluoreszente Färbung zeigte Sarkomerstrukturen.
- Die Plattform unterstützt Hochdurchsatz-Studien und Medikamentenscreening.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Plattform bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Herzmyozyten.
- Sie ermöglicht eine effiziente Sortierung und Analyse von Zellen basierend auf der Morphologie.
- Diese Methode kann die Forschung zu Herzinsuffizienztherapien erheblich voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
