Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung
28. Januar 2021
SEC-BioSAXS-Messungen biologischer Makromoleküle sind ein Standardansatz zur Bestimmung der Lösungsstruktur von Makromolekülen und deren Komplexen. Hier analysieren wir SEC-BioSAXS-Daten aus zwei Arten häufig auftretender SEC-Spuren – Chromatogramme mit vollständig aufgelösten und teilweise aufgelösten Peaks. Wir zeigen die Analyse und Dekonvolution mit Scatter und BioXTAS RAW.
Die biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung ermöglicht strukturelle Messungen von Makromolekül- und Makromolekularkomplexen. Idealerweise sollte die zu messende Probe monodispergiert sein. Obwohl in einigen Fällen die Größenausschlusschromatographie SAXS nicht ausreicht, um Monodispersität zu erzeugen, kann eine softwarebasierte Dekonvolution der SAXS-Daten durchgeführt werden, um eine idealisierte SAXS-Kurve zu erzeugen.
Im Anschluss an dieses Protokoll können ein Dekonvolution-Programm und das benutzerfreundliche Scatter-Programm verwendet werden, um das Vaccinia-Virus DNA-Polymerase-Exominus-Mutationen zu analysieren. Um eine Hintergrundsubtraktion der Größenausschlusschromatographiedaten durchzuführen, öffnen Sie das Java-basierte Scatter 4-Programm, und öffnen Sie die Registerkarte SEC. Ziehen und ablegen Sie die reduzierten Datendateien in die Drop-Daten unter dem Fenster, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausgabeverzeichnis" und öffnen Sie, um das Ausgabeverzeichnis festzulegen, in dem die Daten gespeichert werden.
Geben Sie den Beispielnamen in das Feld Speichern als ein, und klicken Sie auf Ablaufverfolgung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Details bearbeiten, um die experimentellen Details zu bearbeiten und die entsprechenden Felder auszufüllen. Um die Pufferrahmen manuell auszuwählen, klicken Sie auf Puffer festlegen.
Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um den Puffer als flache Stagnungskurve vor dem leeren Volumen der Spalte "Größenausschlusschromatographie" von etwa 100 Frames erneut auszuwählen, und klicken Sie auf Puffer festlegen, und aktualisieren Sie, um die SEC-Datei neu zu berechnen. Klicken sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um einen Bereich auszuwählen, der für das Signaldiagramm von Interesse ist, und ziehen Sie die Fadenkreuze im Heatmap-Plot, um den Zoom und die Teilmenge der Frames auszuwählen, die zum Zusammenführen verwendet werden. Markieren Sie mit einem weiteren Linksklick die Rahmen in der Heatmap, die dem Bereich der rechten unteren Seite der Fadenkreuze entsprechen.
Idealerweise sollte der Rahmen einen Bereich mit einer überwiegend zyanischen Farbe und einem stabilen Kreiselradius hervorheben. Wenn Sie mit den ausgewählten Frames zufrieden sind, klicken Sie auf Zusammenführen, um die subtrahierten Frames zusammenzuführen, und klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, um die Daten anzuzeigen. Laden Sie den Datensatz in das Dekonvolution-Programm, um die Daten zu dekonvolutionieren.
Verwenden Sie im Bedienfeld unter Dateien das Ordnersymbol, um die Daten zu suchen und alle DAT-Dateien hervorzuheben. Im Seriendiagramm wird ein Diagramm mit integrierter Intensität im Vergleich zur Rahmenzahl gezeichnet. Klicken Sie auf der Registerkarte Serie, um die Kurve hervorzuheben und das Popupfenster für die LC-Analyse zu öffnen.
Um einen geeigneten Pufferbereich auszuwählen, klicken Sie auf Bereich hinzufügen, um einen Bereich vor der Spitze des Chromatogramms und einen nach der Lösungsmittelfront auszuwählen, und klicken Sie auf Den puffer festlegen. Popupfenster zeigen an, dass Rahmen nicht für den Hintergrund ausgewählt wurden. Um die EFA zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierte Datei und wählen Sie EFA aus dem Menü aus.
Im Popupfenster sollte die Einzelwertzerlegung des Datasets beobachtet werden. Aktivieren Sie im Feld Steuerelemente die Werte für die Verwendung von Rahmen, um zu bestätigen, dass der gesamte zu dekonvolute maximale Bereich im Intensitätsdiagramm abgedeckt ist. Das Singularwertediagramm zeigt die Intensität der Singularwerte über der Basislinie an.
Wenn die linken und rechten Einzelvektoren nicht übereinstimmen, ändern Sie die signifikante Singularvektorzahl in zwei, und verschieben Sie die Frames, bis die linken und rechten Singularvektoren ähnlich sind. Der EFA wird berechnet, erzeugt Diagramme in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für jeden Vektor und gibt an, wann die Komponenten das Lösungsprofil für die ausgewählten Größenausschlusschromatographie-SAXS-Daten starten und verlassen. RAW versucht, die Bereiche zu identifizieren.
Verwenden Sie bei Bedarf die Pfeile, um die Bereiche so zu ändern, dass jeder Kreis der Beginn eines Wendepunkts ist, der von oder vom Basisgrund aufsteigt oder fällt, und klicken Sie auf weiter. Um Spitzen zu reduzieren oder zu eliminieren, identifizieren Sie ungefähr, welcher Rahmen der Spitze entspricht, indem Sie die Bereichssteuerungspfeile verwenden, um die Komponentenbereichssteuerelemente anzupassen. Wenn ein Mindest-Chi-Quadrat erreicht wurde, klicken Sie zurück, um eine Validierungsprüfung durchzuführen.
Wenn die ursprünglichen EFA-Plots noch gültig aussehen, klicken Sie auf Weiter, und speichern Sie EFA-Daten, um die Diagramme zu speichern. Klicken Sie dann auf Fertig, um das EFA-Fenster zu schließen. Öffnen Sie dann im RAW-Fenster Profile im Plotfenster, um die Kurven anzuzeigen.
Klicken Sie auf der Registerkarte Profile des Bedienfelds mit der rechten Maustaste, um die Kurven als DAT-Dateien zu speichern. Öffnen Sie zur SAXS-Ermittlung die Registerkarte Streuungsanalyse, und wählen Sie G aus, um das manuelle Guinier-Analysewerkzeug auszuwählen. Fügen Sie im Diagramm Punkte hinzu oder entfernen Sie sie, sodass die Residuen kein Lächeln oder Stirnrunzeln haben.
Die ausgewählten Daten in der Guinier-Anpassung sollten die maximale Warteschlange multipliziert mit dem Kreiselradius von 1,3 nicht überschreiten. Klicken Sie auf normalisierte kratky. Die resultierende Darstellung liefert eine Bewertung des strukturellen Zustands des Makromoleküls, kugelförmig, zylindrisch, ungeordnet, normalisiert für Masse und Konzentration.
Klicken Sie auf das Volumen der Korrelation. Die gesamte streute Intensität und ein integrierter Bereich der gesamten Streuintensität als Funktion von Q-Plots erscheinen als Schnelle Referenz für die Validierung der Qualität der Streukurve. Um die Flexibilitätsanalyse zu starten, klicken Sie auf Flexibilität.
Jedes Panel im Popup-Fenster zeigt ein Diagramm, das eine Machtrechtsbeziehung ausnutzt, die zwischen den kompakten und den langgestreckten flexiblen Biopolymeren besteht. Verwenden Sie den Schieberegler am unteren Rand des Feldes, um die Ansicht der Daten zu ändern, bis ein Plateau in einem der Diagramme erreicht ist. Klicken Sie unmittelbar nach der Durchführung einer Flexibilitätsanalyse auf Volume.
Es wird ein Popup mit drei Diagrammen generiert. Die Porod-Debye-Plot-Diagrammspuren, wo der Schieberegler aus dem Flexibilitätsdiagramm links und zeigt die Plateau-Bereich Daten. Um das Volumen des Partikels zu berechnen, verschieben Sie den Anfangs- und Endpunkt, bis die blaue Linie auf dem Diagramm in den Plateaubereich passt.
Für ein unvoreingenommenes Ergebnis sollten die Residuen im Porod-Debye Exponenten-Machtgesetz kein Muster aufweisen. Unter der Registerkarte P von R können die reale Raumverteilung und die Streukurve für die Probe beobachtet werden. Idealerweise sollte die Verteilungskurve ohne Wellen glatt sein und nur sanft die x-Achse berühren.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen und klicken Sie auf DMAX suchen, um ein neues Fenster zu öffnen. Die Grenzwerte für die maximale Dimension sind mit dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich, den für die Berechnung zu verwendenden maximalen Datenpunkten, den unteren und oberen maximalen Dimensionsgrenzen sowie einem unteren und oberen Alpha-Score voreingestellt. Klicken Sie auf Start.
Es wird eine zusammengesetzte Verteilung zusammen mit einer vorgeschlagenen maximalen Dimension und Alphaebene erstellt. Wenn diese Daten akzeptabel sind, schließen Sie das Fenster, um zur Registerkarte P von R zurückzukehren, wo das gegenseitige Leerzeichen nun zugeschnitten wird, um dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich zu entsprechen. Wählen Sie das Modell "Weitere Modelle" aus, und klicken Sie auf Hintergrund, um die Alphaebene und die maximale Dimension auf die vorgeschlagenen Werte aus dem Popup-Feld festzulegen.
Klicken Sie auf Verfeinern. Es wird ein Kreuzvalidierungsdiagramm geöffnet, das anzeigt, ob Punkte wie rot angegeben zurückgewiesen werden mussten. Wenn es nur wenige abgelehnte Punkte gibt und die Verteilung gut aussieht, dann ist das Modell gut.
Sie drucken einen Bericht auf der Registerkarte Analyse. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um das Beispiel hervorzuheben, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen. Wählen Sie Bericht aus dem einzelnen Dataset erstellen aus.
Es wird ein Textfeld geöffnet, in dem Kommentare möglich sind, und es wird ein PDF-Dokument mit allen generierten Zahlen und Werten erstellt. In dieser repräsentativen Analyse wurde E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant an die DNA gebunden und lief mit Größenausschlusschromatographie Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Es wurden zwei Gipfel beobachtet.
Der erste große Peak stellt den E9-DNA-Polymeraseexonuklease minus mutierten DNA-Komplex dar. Und die zweite zeigt den ungebundenen Zustand an. Während der klassische Ansatz der Auswahl von Rahmen einen stabilen Kreiselradius des Komplexes in der ersten Spitze bietet, wird der zweite Gipfel klar zusammengeführt und der Kreiselradius über das Diagramm zeigt, dass der zweite Gipfel von Interesse keinen stabilen Kreiselradius aufgrund von Kreuzspitzenkontamination hat.
In dieser Analyse konnten nur fünf Rahmen verwendet werden, die einen halbstabilen Kreiselradius zeigten. Wenn sie subtrahiert wurden, gaben sie einen Kreiselradius von 36,3 Angstroms an. Wenn die Spitzen mit EFA dekonvolutiert wurden, wurde die entsprechende Kurve für den zweiten Peak mit dem Original überlagert, was eine deutliche Abnahme des Signals auf das Rauschen und einen niedrigeren Kreiselradius von 34,1 Angstroms zeigte.
Ein Kratky-Diagramm der Daten zeigt, dass der Komplex mit dem verworrenen Peak kugeliger ist, wie die PR-Kurve bestätigt, die eine maximale Dimension von 108,5 Angstroms für die dekonvolutierte Kurve ergibt. Die nicht dekonvolutierten Daten für diese Analyse sind mit einer maximalen Dimension von 120 Angstroms gestreckt, wahrscheinlich aufgrund der Heterogenität, die sich aus der ungebundenen E9-Polymerase minus Exonukleasemutant ergibt. Die wichtigsten Schritte sind die Auswahl der Singularwerte und des verwendeten Datenbereichs, da diese die Genauigkeit der Dekonvolution stark beeinflussen.
Die Ergebnisse sollten nicht allein genommen, sondern mit zusätzlichen Techniken wie analytischezentrifugation oder Multi-Winkel-Laserlichtstreuung weiter bewertet werden, um ihre biologische Interpretation zu ermöglichen. Inline-Säulengekoppelte SAXS in Kombination mit Dekonvolution und einer benutzerfreundlichen Schnittstelle wie das Programm Scatter bietet ein leistungsstarkes Paket, um aussagekräftige Strukturdaten auch aus an sich schwierigen Systemen bereitzustellen.
Übersicht
Dieser Artikel behandelt SEC-BioSAXS-Messungen, eine Standardmethode zur Bestimmung der Lösungsstruktur biologischer Makromoleküle und ihrer Komplexe. Die Analyse konzentriert sich auf SEC-Chromatogramme mit vollständig aufgelösten und teilweise aufgelösten Peaks und veranschaulicht die Datenentfaltung unter Verwendung der Software Scatter und BioXTAS RAW.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologische Makromoleküle
- Strukturbiologie
- Röntgenstreuverfahren
Hintergrund
- Die Röntgen-Kleinwinkelstreuung (SAXS) liefert strukturelle Einblicke in Makromoleküle.
- Für genaue Messungen ist die Monodispersität der Proben ideal.
- Die Größenausschlusschromatographie (SEC) erreicht nicht immer Monodispersität.
- Eine softwarebasierte Dekonvolution kann die SAXS-Datenanalyse optimieren.
Zweck der Studie
- Analyse von SEC-BioSAXS-Daten aus verschiedenen SEC-Kurven.
- Veranschaulichung der Softwareanwendung zur Datenentfaltung.
- Bereitstellung eines Protokolls für die SAXS-Analyse makromolekularer Komplexe.
Verwendete Methoden
- Verwendung der Software Scatter und BioXTAS RAW zur Datenanalyse.
- Methoden zur Hintergrundsubtraktion bei SEC-Daten.
- Entfaltung von SAXS-Daten mittels EFA und anderen analytischen Werkzeugen.
- Analyse struktureller Zustände und der Flexibilität von Makromolekülen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Dekonvolution von SAXS-Daten, die zu idealisierten SAXS-Kurven führt.
- Identifizierung struktureller Zustände von Makromolekülen durch Analyse.
- Überprüfung der Datenqualität mittels verschiedener grafischer Bewertungen.
- Erkenntnisse zur Flexibilität und den Abmessungen der analysierten Teilchen.
Schlussfolgerungen
- SEC-BioSAXS ist eine wertvolle Technik zur Untersuchung makromolekularer Strukturen.
- Software-Tools verbessern die Analyse und Interpretation von SAXS-Daten.
- Entfaltungsmethoden können die Genauigkeit struktureller Bewertungen erhöhen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels Deconvolution von SEC-SAXS-Daten lässt sich die Struktur heterogener makromolekularer Proben charakterisieren, die allein durch Chromatographie nicht monodispers erhalten werden können. Dieser Ansatz unterstützt die Target-Validierung, indem überlappende Spezies aufgelöst und quantitative strukturelle Parameter für die mechanistische Ent-Risikobewertung in der frühen Entdeckungsphase bereitgestellt werden. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen, indem sie reproduzierbare Daten im Lösungszustand für komplexe Biologika sowie für Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem strukturelle Signaturmerkmale einzelner Bestandteile in heterogenen Gemischen isoliert werden.
- Operationaler Wert: Klärt Signalwege durch entfaltete SAXS-Kurven, die zwischen gebundenen und ungebundenen Zuständen makromolekularer Komplexe unterscheiden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch quantitative Kenngrößen wie Trägheitsradius und maximale Ausdehnung für jeden aufgelösten Bestandteil.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem idealisierte SAXS-Kurven aus SEC-getrennten Peaks erzeugt werden.
- Operativer Wert: Trägt durch Hintergrundsubtraktion und Protokolle zur Frame-Auswahl, die Kreuzkontamination zwischen Peaks minimieren, zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Screenings durch benutzerfreundliche Software-Schnittstellen (Scatter, BioXTAS RAW), die eine konsistente Datenverarbeitung über verschiedene Projekte hinweg ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Analyse eines Exonuklease-negativen Mutanten des Vaccinia-E9-DNA-Polymerase, einem Modell für mechanistische Untersuchungen von Nukleinsäure-verarbeitenden Enzymen.
- Präklinische Abstimmung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem strukturelle Zustände aus SAXS-Daten mit funktionellen Ergebnissen über ergänzende Methoden wie die analytische Ultrazentrifugation verknüpft werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungs- und Entschärfungswert, indem Flexibilitätsanalysen und Kratky-Diagramme zur Beurteilung struktureller Unordnung und zur Unterstützung von Go/No-Go-Entscheidungen verwendet werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung bis zur Leitstruktur-Identifizierung und präklinischen Arbeit und unterstützt die Hypothesenprüfung, die Bereitschaft von Assays sowie strukturelle Analysen.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem überlappende SEC-SAXS-Peaks aufgelöst werden, um makromolekulare Wechselwirkungen und konformationelle Zustände zu klären.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand der Reproduzierbarkeit dekonvolutierter SAXS-Kurven sowie quantitativer Auswertungen wie Trägheitsradius und maximale Dimension.
- Analytik: Hebt Messgrößen und Auswerteverfahren hervor (Guinier-Anpassung, Kratky-Diagramm, Porod-Debye-Analyse), die es Teams ermöglichen, strukturelle Bedingungen zu vergleichen und die Datenqualität zu beurteilen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem SAXS-basierte Dimensionen und Flexibilitätsaussagen mit unabhängigen Methoden validiert werden, um eine biologische Interpretation zu ermöglichen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Kompetenz dar, die durch standardisierte Software-Workflows (Scatter, BioXTAS RAW) gewährleistet wird und konsistente Verfahren zur Daten-Dekonvolution und -Berichterstattung über verschiedene Teams hinweg sicherstellt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeit in heterogenen Proben.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der SAXS-Datenanalyse durch definierte Methoden zur Hintergrundsubtraktion und EFA-Protokolle.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und reduziertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Aufklärung struktureller Heterogenität.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend auf quantitativen strukturellen Parametern aus entfalteten Komponenten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Interpretation von SAXS-Daten, der Integration von Chromatographiedaten und der softwarebasierten Dekonvolution (EFA, Guinier, Kratky).
- Benötigt Instrumentierung für die Kopplung von SEC-SAXS sowie eine rechnerische Infrastruktur, um Scatter und BioXTAS RAW für die Auswahl von Einzelbildern, die Hintergrundsubtraktion und die singuläre Wertanalyse auszuführen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Pufferauswahl, der Hervorhebung von Einzelbildern und der Bereichsanpassung voraus, um konsistente Dekonvolutionsergebnisse zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen bei unterschiedlichen Modellsystemen, insbesondere bei flexiblen Biopolymeren oder strukturell wechselnden Komplexen, die das Elutionsprofil verändern.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit einer orthogonalen Validierung (z. B. analytische Ultrazentrifugation, MALS), um die biologische Relevanz der dekonvolvierten SAXS-Kurven zu bestätigen.
