Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells

Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung Jedoch, effektive Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantation ist ein Problem für Ärzte und die Forscher. Dieses Protokoll ist eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode, um die Immunabstoßung der Xenotransmutation zu überwachen. Diese Technik kann im Xenotransplantationsfeld eingesetzt werden, einschließlich Schweine-zu-Mensch-Islet-Transplantation, Nierentransplantation, Lebertransplantation und Herztransplantation.

Beginnen Sie mit der Übertragung von 500 Mikroliter blutproben in verschiedene Mikrozentrifugenröhren. 20 Mikroliter Protease K und 500 Mikroliter Lysepuffer in die Schläuche geben. Dann gründlich schütteln sie zu mischen.

Legen Sie die Rohre in ein Wasserbad bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten, schütteln Sie sie zwei bis drei Mal während der Inkubation, bis die Lösung klar Zentrifuge sie kurz zentrifuge, um die flüssigen Perlen von der Innenwand der Rohrabdeckungen zu entfernen. Dann 500 Mikroliter Wasserkraft, Ethylalkohol hinzufügen und gründlich schütteln. Übertragen Sie die Mischung in die Adsorptionsspalte.

Dann zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit. Fügen Sie 800 Mikroliter Spüllösung zu jeder Adsorptionssäule und Zentrifuge für eine Minute hinzu. Lassen Sie die Säulen für einige Minuten bei Raumtemperatur, um die verbleibende Spüllösung zu trocknen.

Übertragen Sie die Absorptionssäulen in ein sauberes Zentrifugalrohr. Fügen Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer in die Mitte der Adsorptionsfolien und legen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten, dann Zentrifugieren Sie sie für eine Minute. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix nach Manuskriptanweisungen vor, und fügen Sie dann 23 Mikroliter der Mischung in jedes 0,6 Milliliter Mikrozentrifugenrohr ein.

Fügen Sie zwei Mikroliter genomischer DNA zu jeder Röhre und sorgfältig Cabot. Dann kurz mischen und Zentrifugen. Legen Sie die Rohre in einen PCR-Cycler und starten Sie die Verstärkung.

Wenn die Reaktion beendet ist, führen Sie Agarose Elektrophorese. 1,2 Gramm Agarose in einen Kolben mit hundert Millimetertae geben und fünf Minuten in der Mikrowelle kochen. Sobald die Agarose auf ca. 70 Grad Celsius abgekühlt ist, fügen Sie fünf Mikroliter Nukleinsäurefarbstoff in den Kolben, langsam, gießen Sie es in die Platte und lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis es zu einem Gel verfestigt.

Fügen Sie fünf Mikroliter jeder Probe und 2-Log DNA Leiter oder DNA Marker 1, in die Brunnen des Agarose Gel und Elektrophorese bei 120 Millionen Pier, bis die Bänder getrennt sind. Visualisieren Sie das Gel mit einem ultravioletten Imager. Nach der Transformation, wie im Textmanuskript beschrieben, überprüfen Sie die Plasmide durch doppelte Restriktionsenzymverdauung mit EcoR I und Bam HI. Trennen Sie die verdauten Produkte mit 1%Agarose-Elektrophorese und setzen Sie das Gel UV-Licht aus.

Verdünnen Sie das konzentrierte Plasmid mit dem Fragment der Schweine-DNA auf zwei mal 10 bis die 11. Kopien pro Milliliter für die Ausgangsstandardlösung, mit doppelt destilliertem Wasser. Um eine Standardkurve zu erstellen, bereiten Sie einen qPCR-Mastermix vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und fügen Sie 40 Mikroliter der Mischung in jedes Rohr eines Achtrohrstreifens ein. Fügen Sie 10 Mikroliter Standard-DNA in verschiedenen Konzentrationen hinzu, kappen Sie die Röhren dann kurz und zentrifugieren Sie sie.

Legen Sie die Rohre in die qPCR-Maschine und führen Sie die Verstärkung durch. Verwenden Sie EDTA-Röhren, um Blutproben von etwa 400 Mikrolitern aus den Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Modellen oder 100 Mikroliter aus den Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen zu sammeln. Dann die Proben in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen.

Entfernen Sie die Blutkörperchen aus den Blutproben durch Zentrifugation bei niedriger Temperatur und hoher Geschwindigkeit. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und entfernen Sie den Zellabfall durch Zentrifugation bei 16.000-facher G für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und extrahieren Sie die zirkulierende DNA mit einem kommerziellen Serum, während sie DNA-Extraktionskit zirkulieren.

Kondensieren Sie das Volumen der zirkulierenden DNA auf 40 Mikroliter und speichern Sie es bei negativen 20 Grad Celsius. Führen Sie qPCR durch, um die zirkulierende schweinespezifische DNA zu quantifizieren. Porcine-spezifische Primer wurden entwickelt und verwendet, um zirkulierende schweinespezifische DNA durch qPCR zu quantifizieren, in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch, Transplantationsmodelle.

Die Agaroseelektrophorese wurde verwendet, um verstärkte DNA-Fragmente zu isolieren. Mit PCR wurden die Primer-spezifisch für amplifizierte genomische DNA von Schweinen identifiziert. Als nächstes wurden die Spezifitäten dieser Primer in der Kohorte der Affen- oder menschlichen genomischen DNA oder in der Kohorte der genomischen DNA der Maus bestätigt.

Schließlich wurden zwei artenspezifische Primer verwendet, um Schweine-DNA im Schweine-zu-Affen-Arterienpflaster und Schwein-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle zu verstärken. Das Wichtigste, was man sich beim Versuch dieses Protokolls merken sollte, ist, dass eine Kontamination aller Art verhindert werden sollte. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, neue Fragen innerhalb der Xenotransplantation zu erforschen, da es sich um eine einfache kostengünstige und nicht-invasive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantation handelt.