Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen
1. September 2020
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen ist eine aufkommende Technik zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen. Verschiedene Lösungsmittelzusätze und Liganden haben unterschiedliche Hydroxyl-Radikal-Aufräumeigenschaften. Um die Proteinstruktur unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, ist eine Echtzeitkompensation von Hydroxylradikalen, die in der Reaktion erzeugt werden, erforderlich, um die Reaktionsbedingungen zu normalisieren.
Die Methode erleichtert die Messung von Proteinbestätigungen und Proteinwechselwirkungen. Die Anforderungen an Pufferzusammensetzung, Probenreinheit und Proteinkonzentration sind flexibel, so dass die Methode anspruchsvolle strukturelle Probleme angehen kann. Diese Technik ermöglicht eine Komprimierung von Proben in einer Vielzahl von verschiedenen Puffersystemen.
Mit unserer Dosimetriemethode können Forscher überwachen, wie gut ihre Etikettierungsreaktionen in Echtzeit funktionieren. Eine Anwendung dieser Technologie ist in der Arzneimittelentwicklung, weil es Forschern ermöglicht, sehr unterschiedliche Arzneimittelformulierungen zu testen und wie sie die Proteinstruktur beeinflussen. Zur Vorbereitung der optischen FPOP-Bank.
Schalten Sie zuerst den Laser ein und stellen Sie den Laser auf externen Auslöser, konstante Energie und keinen Gasaustausch ein. Wenn der Laser erwärmt hat, stellen Sie die Laserenergie pro Puls auf 80 bis 120 Milligramm pro Puls und verwenden Sie einen Butanbrenner, um die Polyimidkodierung der Kapillare an der Stelle, an der das Inline-Dosimeter das absorbierende Signal nach Laserbelichtung abliest, vorsichtig zu verbrennen. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch und Methanol, um den Schmutz sanft von der Kapillare abzuwischen und die gereinigte Kapillare durch den Strahlweg des Lasers und in das Inline-Dosimeter zu legen.
Drücken Sie den Hebel auf der Oberseite des Inline-Dosimeters, um das Scharnier zu öffnen und die Magnethalter zu entfernen. Legen Sie die Kapillare in die Maschinennut des Inline-Dosimeters mit den Magnethaltern, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten und das Dosimeterscharnier über der Kapillare zu schließen, indem Sie das Scharnier drücken, bis der Hebel verriegelt ist. Klicken Sie auf den Startblitz-Button in der Dosimetrie-Software, um mit dem Abfeuern des Excimerlasers zu beginnen und die voreingestellte Wiederholungsrate zwischen 10 und 20 Hertz in der Dosimetrie-Software mit dem Laserfeuer zu setzen, bewegen Sie die motorisierte Stufe durch ihren Bewegungsbereich und stellen sie sicher, dass der Strahl auf der Blende zentriert bleibt und die Silhouette der Kapillare durchgehend beobachtet werden kann.
Spülen Sie dann die Kapillare mit Wasser bei 20 Mikroliter pro Minute für mindestens eine Minute und klicken Sie auf Startdaten plus Auto Null in der Dosimeter-Software, um das Dosimeter auf das Wasser zu null, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen. Um ein FPOP-Experiment durchzuführen, fügen Sie zwei Mikroliter Wasserstoffperoxid zu 18 Mikroliter FPOP-Lösung hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vorsichtig zu mischen, um die Lösung an der Unterseite des Rohres durch Zentrifugation schnell zu sammeln und sofort eine gasdichte Spritze zu verwenden, um die Lösung in eine Spritzenpumpe zu laden. Klicken Sie auf Pumpe starten und Daten in der Dosimeter-Software starten, um den Durchfluss auf der Spritzenpumpe bei der entsprechenden Durchflussrate zu starten und das Inline-Dosimeter zu verwenden, um den Echtzeit-Adenin-Wert zu überwachen, bis das absorbierende Signal bei 265 Nanometern die Entnahme der Probe in einem Abfallbehälter stabilisiert.
Um den Laser bei der voreingestellten Wiederholungsrate Endenergie abzufeuern, klicken Sie auf den Startblitzknopf in der Dosimeter-Software und verwenden Sie das Inline-Dosimeter, um den Echtzeit-Adenin-Wert zu überwachen. Der Unterschied in der Absorption bei 265 Nanometern mit dem Laser aus und dem Laser auf wird die Delta-Absorptionsmittel bei 265 Nanometer Lesung sein. Um sicherzustellen, dass vergleichbare Hydroxylradikale zur Verfügung stehen, um mit Proteinen über verschiedene Proben hinweg zu reagieren.
Vergleichen Sie die Deltaabsorber bei 265 Nanometern, die mit dem Inline-Dosimeter erhalten wurden, mit den Wunschdelta-Absorbenten bei 265 Nanometern, die aus früheren Experimenten oder Kontrollen gewonnen wurden. Wenn der Messwert auf der gewünschten Ebene ist, sammeln Sie die Probe unmittelbar nach Demlaser oder Strahlung im Quench-Puffer. Um die effektive Radikaldosis zu kompensieren, um die Absorptionswerte auszugleichen, ändern Sie die Wasserstoffperoxidkonzentration, ändern Sie die Laserenergie pro Puls oder ändern Sie die Fokusebene der Fokussierlinse, um den Laserflonnz zu erhöhen.
Um eine Änderung der Absorptionseinheit um mehr als 10 Milli in den Deltaabsorbern vorzunehmen, stellen Sie die Probe mit mehr oder weniger Wasserstoffperoxid um und führen Sie die Probe wie gezeigt erneut aus. Um eine kleine Änderung des Absorptionsmesswerts in Echtzeit vorzunehmen, verwenden Sie die 50 Millimeter motorisierte Stufe, um die Position der Fokussierlinse anzupassen, um die Brennebene des Einfallsstrahls anzupassen. Zur Messung der effektiven Menge an Hydroxylradikalen, die in der Probe nach der Laserstrahlungsüberwachung vorhanden ist, werden die Adenindelta-Absorbenten in Echtzeit mit einem Inline-UV-Kapillardetektor in Echtzeit gemessen, wobei die motorisierte Stufe verwendet wird, um die Linsenposition anzupassen, bis die Deltaabsorber bei 265 Nanometern dem gewünschten Messwert entsprechen.
Ein Vergleich des schweren Kettenpeptid-Fußabdrucks des Adilumumab-Biosimilars im Phosphatpuffer und nach einer Stunde Erwärmung bei 55 Grad Celsius zeigt, dass die angegebenen Peptidregionen einen signifikanten Schutz vor Lösungsmitteln aufweisen, wenn das Protein zu Aggregaten erhitzt wird. Die Verwendung eines Inline-Dosimeters in Echtzeit zur Überwachung des Unterschieds in den Adenin-Absorbern vor und nach Laser oder Strahlung zeigt an, dass eine vergleichbare Veränderung des Adenin-Absorptionsmittelspiegels im MES-Puffer im Vergleich zum Phosphatpuffer beobachtet wird. Während die durchschnittliche Oxidation der Peptide in Gegenwart von MES-Puffer niedriger ist im Vergleich zu Phosphatpuffer.
Da jedoch der Laserflonz erhöht wird, um eine gleiche Adenin-Dosimetrie-Antwort zu haben, sind die durchschnittlichen Peptid-Oxidationswerte nach FPOP und MES-Puffer und Phosphatpuffer fast gleich. Da die Dosimetrie-Messung durch die Laser-Fluzperoxid-Konzentration sowie den Radikalfänger beeinflusst wird. Achten Sie darauf, dass die Dosimetrie-Antwort zwischen der Stichprobenerhebung nahe beieinander liegt.
Sitedirected Mutagenese wird häufig verwendet, um in FPOP geschützte Sites zu untersuchen. Auf diese Weise können Forscher feststellen, ob Änderungen auf Alistair zurückzuführen sind. Diese Technik erleichtert den Vergleich von Proteinen in verschiedenen Puffern oder Formulierungen, so dass Forscher die Wirkung verschiedener Additive auf die Proteinbestätigung bestimmen können.
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Übersicht
Schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) ist eine neuartige Technik zur Charakterisierung von Proteinstrukturen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Hydroxylradikalerzeugung und erlaubt es Forschern, Proteinwechselwirkungen und -konformationen unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Proteinkarakterisierung
- Strukturbiologie
- Wirkstoffentwicklung
Hintergrund
- FPOP nutzt Hydroxylradikale zur Proteinoxidation.
- Unterschiedliche Lösungsmitteladditive beeinflussen die Radikalfängereigenschaften.
- Eine Echtzeitkompensation der Radikale ist entscheidend für konsistente Ergebnisse.
- Die Methode ist an verschiedene Puffersysteme und Probenvorgaben anpassbar.
Zweck der Studie
- Um die Messung von Proteinstrukturen zu erleichtern.
- Um Proteinwechselwirkungen in Echtzeit zu untersuchen.
- Um die Auswirkungen verschiedener Arzneimittelformulierungen auf die Proteinstruktur zu bewerten.
Verwendete Methoden
- FPOP-Optikbank-Aufbau.
- Flexible Zusammensetzung des Puffers und Anforderungen an die Probereinheit.
- Echtzeit-Dosimetrie zur Überwachung der Markierungsreaktionen.
- Anwendung bei der Arzneimittelformulierungsprüfung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung von Proteinwechselwirkungen unter wechselnden Bedingungen.
- Nachgewiesene Flexibilität in Puffersystemen für anspruchsvolle strukturelle Fragestellungen.
- Die Echtzeitüberwachung verbesserte die Zuverlässigkeit von Markierungsreaktionen.
- Anwendungsmöglichkeiten in der Arzneimittelentwicklung wurden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- FPOP ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse der Proteinstruktur.
- Die Anpassungsfähigkeit der Methode macht sie für verschiedene Forschungsanwendungen geeignet.
- Die Echtzeitüberwachung verbessert die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) ermöglicht eine Echtzeitkompensation der Variabilität der Hydroxylradikal-Dosis und gewährleistet somit konsistente Oxidationsmesswerte über heterogene Proben hinweg. Diese Fähigkeit unterstützt eine zuverlässige Detektion konformationeller Veränderungen, Liganden-Bindungsstellen und Protein-Protein-Interaktionen bei der frühen Target-Validierung. Durch die Bereitstellung quantitativer, auf der Lösungsmittelzugänglichkeit basierender Messungen erhöht FPOP das Vorhersagevertrauen in strukturbiologische Arbeitsabläufe, die für die biopharmazeutische Forschung und Entwicklung relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit, um therapeutische Hypothesen zu überprüfen und proteinkonformationelle Zustände zu klären.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung, indem Oxidationsmuster mit ligandenbindungs- oder aggregatspezifischen strukturellen Verschiebungen korreliert.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem reproduzierbare, quantitative Footprint-Daten bereitgestellt werden, die mechanistische Annahmen zur Zielinteraktion entlasten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem konsistente, dosimetrisch kontrollierte Oxidationsausgaben bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch Echtzeit-Überwachung des Adenin-Signals bei 265 nm und verringert so die Variabilität durch Laser-Fluenz oder Puffer-Effekte.
- Skalierbarkeitswert: Erleichtert die Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen Puffersystemen (z. B. Phosphat, MES), indem die Laserenergie oder Peroxidkonzentration angepasst wird, um eine äquivalente Radikaldosis aufrechtzuerhalten.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem ein direkter Vergleich der Proteintopographie zwischen Formulierungen, Puffern oder Belastungsbedingungen (z. B. hitzeinduzierte Aggregation) ermöglicht wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungsfindung: Unterstützt Go/No-Go-Kriterien durch Quantifizierung von Schutzmustern in Peptiden (z. B. schwerer Kette eines Adalimumab-Biosimilars) unter wechselnden Umweltbedingungen.
- Mechanistische Risikominimierung: Unterscheidet echte konformationelle Veränderungen von Artefakten, die durch Radikalfänger oder Pufferzusammensetzung verursacht werden, mithilfe der Dosisnormalisierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
FPOP fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Lead-Identifizierung ein, insbesondere bei der Beurteilung, wie Arzneimittelformulierungen oder Zusatzstoffe die Proteinstruktur unter nahezu physiologischen Bedingungen beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Abbildung von Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit als Reaktion auf Ligandenbindung, Oligomerisierung oder Umweltstress.
- Screening: Liefert assaysbereite, reproduzierbare Oxidationsprofile, wenn die Echtzeit-Dosimetrie das Delta-Absorptionssignal über mehrere Durchläufe hinweg stabilisiert.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Delta-Absorption bei 265 nm), die den Vergleich der Hydroxylradikal-Exposition und des Oxidationsumfangs zwischen Proben ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem direkte Vergleiche der Proteintopographie in verschiedenen Puffern ermöglicht werden, wodurch Formulierungsänderungen abgebildet werden, wie sie in der Entwicklung auftreten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare, dosimetriegesteuerte Plattform statt als Einweg-Protokoll und ist durch Anpassung der Laserfluenz oder Peroxidkonzentration auf verschiedene Zielstrukturen und Puffersysteme übertragbar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten durch einen direkten, quantifizierbaren Zusammenhang zwischen Oxidation und Lösungsmittelzugänglichkeit verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch eine Echtzeit-Inlin-Dosimetrie, die Laser-Schwankungen, Peroxid-Zersetzung und Puffer-Scavenging-Effekte ausgleicht.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapital-Effizienz, indem zuverlässige Go/No-Go-Entscheidungen früh im Entdeckungsprozess ermöglicht werden und dadurch das Risiko später Fehlschläge aufgrund nicht bestätigter Zielinteraktion verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem konsistente strukturelle Daten über heterogene Probensätze hinweg bereitgestellt werden, was einen objektiven Vergleich von Wirkstoffformulierungen oder Mutanten ermöglicht.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in laserbasierten photochemischen Systemen und der UV-Vis-Dosimetrie zur genauen Interpretation der Signale.
- Hängt von der Integration eines inline UV-Kapillardetektors und eines motorisierten Probentisches für die Echtzeit-Justierung der Fokusebene und Signalstabilisierung ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Dosimetrie-Referenzpunkte (Delta-Absorption bei 265 nm), um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Standorten oder Experimenten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel zwischen Puffersystemen aufgrund variabler Radikalfängung (z. B. MES im Vergleich zu Phosphat), die eine Anpassung der Laserfluenz oder der Peroxidkonzentration erfordern können.
- Praktische Einschränkung: Eine wirksame Kompensation setzt eine stabile Detektion des Adenin-Signals voraus; Signaldrift oder Verschmutzung der Kapillare können eine Neukalibrierung oder Wartung erforderlich machen.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Fast Photochemical Oxidations of Proteins (FPOP) Optical Bench Preparation
2:43
FPOP Experiment
3:58
Compensation Performance
5:45
Results: Representative Adalimumab FPOP and Compensated Myoglobin FPOP in MES Buffer
6:51
Conclusion
