Name: Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung von Nahinfrarot-Photoimmuntherapie bei pleural disseminiertem Lungenkrebs in einem Mausmodell. Diese Methode nutzt Biolumineszenz-Bildgebung zur Überwachung therapeutischer Effekte in vivo.

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Alle In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortierressourcen des Nagoya University Animal Care and Use Committee durchgeführt (Genehmigung #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Sechs Wochen alte homozygote athymische Nacktmäuse wurden im Animal Center der Nagoya University gekauft und gepflegt. Bei der Durchführung des Verfahrens an Mäusen wurden sie mit Isofluran betäubt (Einführung: 4-5%, Erhaltung 2-3%); die Pfote wurde mit einer Pinzette gedrückt, um die Tiefe der Anästhesie zu bestätigen.
1. Konjugation von IR700 mit mAb
<ol><li>Inkubieren Sie mAb (1 mg, 6,8 nmol) mit IR700 NHS-Ester (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L in DMSO) in 0,1 mol/LNa2HPO4 (pH 8,6) bei 15-25 °C für 1 h.</li>
	<li>Reinigen Sie die Mischung mit einer Säule (z. B. Sephadex). Bereiten Sie die Säule vor und waschen Sie sie mit PBS. Tragen Sie dann die Mischung auf die Säule auf und sammeln Sie den Tropfen, der den gereinigten IR700-konjugierten Antikörper enthält. Dieser IR700-konjugierte Antikörper wird als Antikörper-Photosensibilisator-Konjugat (APC) bezeichnet.</li>
	<li>Messen Sie die Protein- und IR700-Konzentration im APC.<ol>
<li>Erstellen Sie Kalibrierkurven für Protein und IR700 mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Mischen Sie Standardkonzentrationen von Albumin mit einem Protein-Assay-Kit nach dem Kit-Protokoll (siehe Materialtabelle,Coomassie Brilliant Blue (CBB) Proteinfärbung). Messen Sie die Absorption von Albumin bei einer Wellenlänge von 595 nm und zeichnen Sie die Kalibrierkurve (eine lineare Näherungsformel) für das Protein mit der folgenden Gleichung: y = ax + b (x: Konzentration, y: Absorption).</li>
		<li>Erhalten Sie Kalibrierkurven für IR700 mit Absorption bei 690 nm mit dem gleichen Verfahren. Die Standardkonzentration von IR700 wird bei 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/ml) empfohlen.</li>
		<li>Messen Sie die Proteinkonzentration und die IR700-Konzentration im APC mit einer Kalibrierkurve [x = (y-b)/a (x: Konzentration, y: Absorption)].</li>
		<li>Bestimmen Sie die Anzahl der pro mAb gebundenen IR700-Farbstoffe mit den Ergebnissen der molaren Konzentration. HINWEIS: Es ist wichtig, die optimale Konjugationszahl von IR700-Molekülen pro mAb-Molekül zu bestimmen. Im Allgemeinen wären etwa drei IR700-Moleküle, die an ein einzelnes mAb-Molekül gebunden sind, sowohl in vitro als auch in vivowirksam. Viele IR700, die pro Antikörper gebunden sind (z. B. sechs), erleichtern es, während in vivo-Experimenten in der Leber gefangen zu werden. Das Verhältnis der an IR700 gebundenen Antikörper lag im Bereich von 1:2-1:4. Der Anteil an IR700 wurde bei Bedarf reduziert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) als Bestätigung für die Bildung eines APC durch. Stellen Sie das Gel bei 700 nm mit einem fluoreszierenden Imager ab und färben Sie das Protein im Gel mit einem Proteinfärbekit nach dem Kit-Protokoll (siehe Materialtabelle,CBB-Proteinfärbung).</li>
</ol>2. Generierung eines Pleura-Verbreitungsmodells
<ol><li>Herstellung von Luciferase-exprimierenden Zielzellen und Suspendierung von 1,0 × 106 Zielzellen in 100 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) HINWEIS: Intrathorakische Krebszellen wie Lungenkrebs und MPM eignen sich als Zielzellen. Luciferase-exprimierende Zellen wurden über die Luciferase-Gentransfektion hergestellt, und eine hohe Expression von Luciferase wurde nach > 10 Zellpassagen bestätigt. Die Zellen wurden in einem Medium kultiviert, das mit 10% fetalem Rinderserum und Penicillin (100 IE / ml) und Streptomycin (100 mg / ml) ergänzt wurde. Die Anzahl der Zellen wurde entsprechend der Tumorwachstumsrate und dem zeitlichen Verlauf der Behandlung angepasst (1,0. × 105-6,0 × 106 Zellen/Körpergewicht).</li>
	<li>Bereiten Sie 8-12 Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse mit einem bevorzugten Körpergewicht von 19-21 g vor.</li>
	<li>Anästhesie von Mäusen während des Eingriffs mit Isofluran (Einführung: 4-5%, Erhaltung 2-3%); Drücken Sie den Schwanz mit einer Pinzette, um zu bestätigen, dass keine Reaktion vorliegt.</li>
	<li>Machen Sie einen Stopfen mit Polystyrolschaum und befestigen Sie den Stopfen an der 30 G-Nadel, so dass die Spitze bei 5 mm bleibt, um Lungenverletzungen zu vermeiden. Biegen Sie die Nadelspitze mit einer sauberen Zange oder drücken Sie sie gegen einen harten Gegenstand, der mit 70% EtOH gereinigt wurde, um Pneumothorax zu vermeiden (Abbildung 1). ACHTUNG: Achten Sie darauf, sich nicht selbst zu durchbohren. Verwenden Sie eine Zette, um die Nadel zu biegen. Halten Sie den Stopfen nicht gedrückt, wenn Sie ihn an der Nadel befestigen. Es ist sicherer, den Stopfen zu kleben, bevor Sie die Zellen in die Spritze füllen.</li>
	<li>Füllen Sie eine Spritze (1 ml) mit Zielzellen und befestigen Sie eine 30G-Nadel mit einem Stopfen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Brust des Tieres vor dem Eingriff mit 70% EtOH.</li>
	<li>Stechen Sie eine Nadel durch den Interkostalraum in die Brust der Maus. Aufgrund des Widerstands beim Damaligen Schlagen gegen die Rippen bewegte sich die Nadelspitze auf und ab. Drücken Sie nach dem Passieren des Interkostalraums die Spritze gegen die Maus und injizieren Sie 100 μL Zielzellen (Abbildung 2). HINWEIS: Die Maus atmet tief ein, wenn die Nadel richtig in die Brusthöhle eintritt. Mit dem Biegen der Nadelspitze konnten Pneumothorax und eine unsachgemäße Injektion von Zellen in die Lunge vermieden werden. HINWEIS: Die Punktion der rechten Brustwand wird empfohlen, um das Risiko einer Herzwandpunktion zu vermeiden.</li>
	<li>Rollen Sie die Maus 2-3 mal, um die Zellen in der Brusthöhle zu verteilen.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in einen sauberen und warmen Käfig zurück und überwachen Sie bis zum Ambulanz. Nach dem Eingriff wacht die Maus aus der Anästhesie auf und verhält sich normal.</li>
</ol>3. Messung der Biolumineszenz
HINWEIS: Die für die Datenerfassung verwendete Software ist in der Materialtabelleaufgeführt.
<ol><li>Um die Generierung des Pleuraverbreitungsmodells zu bestätigen, werten Sie die Biolumineszenzbilder jeden Tag nach der Injektion der Zellen in die Brusthöhle aus.</li>
	<li>Mäuse betäuben (Schritt 2.3) und intraperitoneal mit D-Luciferin injizieren (15 mg/ml, 200 μL).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus vor und nach der Bildgebung normal atmet. Verwenden Sie bei Bedarf eine Heizung, um eine Hypothermie während der Anästhesie zu verhindern.</li>
	<li>Zehn Minuten nach der Injektion stellen Sie die Maus in das Biolumineszenz-Bildgebungsgerät (BLI) ein. Für die Bilderfassung öffnen Sie die Erfassungssteuerung der Software. Wählen Sie Luminescent, Photographund Overlay(Abbildung 3) aus.</li>
	<li>Stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Legen Sie Binning als klein fest.</li>
	<li>Stellen Sie f / stop als 1 für Lumineszenz und 8 für Foto ein; f/stop steuert die Lichtmenge, die vom Detektor des geladenen gekoppelten Geräts empfangen wird.</li>
	<li>Legen Sie das Sichtfeld auf C fest.</li>
	<li>Sobald die Mausprobe für die Bildgebung bereit ist, klicken Sie auf Zur Bilderfassung erfassen. Mäuse mit ausreichender Luciferase-Aktivität wurden für weitere Studien ausgewählt. HINWEIS: Ein geeignetes Pleuraverbreitungsmodell zeigt eine starke Lumineszenz an der diffusen Stelle in der Brust, wenn es von der ventralen Seite betrachtet wird. Wenn die BLI-Bilder nicht im Thorax und nur an der Injektionsstelle diffundiert sind, kann der Tumor subkutan transplantiert werden.</li>
	<li>Nachdem Sie das Bild angezeigt haben, stellen Sie das Anzeigeformat auf Radianceein. Öffnen Sie das Werkzeugpalettenbedienfeld (Abbildung 4A).</li>
	<li>Wählen Sie ROI-Tools. Wir empfehlen, den Kreis zu verwenden, um den biolumineszierenden Bereich auf Bildern zu bereichen.</li>
	<li>Klicken Sie auf ROIs messen, um die Biolumineszenzintensität der Oberfläche zu messen (Abbildung 4B).</li>
	<li>Verwenden Sie Messung konfigurieren in der linken Ecke des ROI-Messfelds, um die erforderlichen Werte/Informationen auszuwählen. Exportieren Sie diese Datentabelle als .csv Datei (Abbildung 4C).</li>
	<li>Verwenden Sie die Werte des Gesamtflusses (p/s) als Quantifizierung der biolumineszierenden Intensität in der .csv Datei.</li>
</ol>4. Diffuse Lumineszenz-Bildgebungstomographie (DLIT)
HINWEIS: Die für die Datenerfassung verwendete Software ist in der Materialtabelleaufgeführt.
<ol><li>Aktivieren Sie die Taste X-ray Armed.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse (Schritt 2.3) und injizieren Sie dann D-Luciferin (15 mg/ml, 200 μL) intraperitoneal in die Mäuse. Um DLIT kontinuierlich von 3.2 bis 3.7 aufzunehmen, überspringen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Zehn Minuten nach der Injektion setzen Sie die Maus in das BLI-Gerät.</li>
	<li>Öffnen Sie die Erfassungssteuerung der Software. Wählen Sie Luminescent, Photograph, CT, Standard-One Mouseund Overlay. Andere Einstellungen waren die gleichen wie in 3.4-3.6 (Abbildung 5A).</li>
	<li>Wählen Sie den Imaging-Assistenten in der Erfassungssteuerung aus.</li>
	<li>Wählen Sie Biolumineszenz und dann DLIT (Abbildung 5B).</li>
	<li>Wählen Sie Firefly als zu messende Wellenlänge aus (Abbildung 5C).</li>
	<li>Stellen Sie das Bildmotiv als Maus, die Belichtungsparameter als Autoeinstellungen, das Sichtfeld als C-13,4 cmund die Motivhöhe auf 1,5 cm ein ( Abbildung5D).</li>
	<li>Drücken Sie die Röntgenstrahlen, die erzeugt werden, wenn sie mit Energie versorgt werden. Erwerben.</li>
	<li>Öffnen Sie die ct-sequenziellen Bilddaten.</li>
	<li>Öffnen Sie Flächentopografie in der Werkzeugpalette. Wählen Sie Anzeigen aus (Abbildung 6A).</li>
	<li>Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die violette Anzeige nur die Körperoberfläche anzeigt (Abbildung 6B). Wählen Sie dann die Betreffnackmaus aus, und klicken Sie auf Fläche generieren. Stellen Sie sicher, dass der Umriss der Maus genau gezeichnet ist (Abbildung 6C).</li>
	<li>Öffnen Sie die Registerkarte Werkzeugpalette, Eigenschaften der DLIT-3D-Rekonstruktion. Wählen Sie Gewebeeigenschaften als Mausgewebe und Quellspektrum als Glühwürmche aus (Abbildung 6D). Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte Analysieren und bestätigen Sie die Daten für jede ausgewählte Wellenlängendaten. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Rekonstruieren (Abbildung 6E).</li>
	<li>Bestätigen Sie das Vorhandensein von BLI in der Brusthöhle im konfigurierten DLIT-Bild.</li>
</ol>5. NIR-PIT für in vivo Pleuraverbreitungsmodell
<ol><li>Messen Sie die Lichtdosis des NIR-Lasers (690 nm Wellenlänge) mit einem Leistungsmesser und stellen Sie die Leistung auf 100 mW/cm2ein. HINWEIS: Das Laserlicht ist kohärent mit einer genauen Spulengröße; somit ändert sich die Lichtenergie kaum unabhängig von der Entfernung innerhalb von 50 cm. Wenn es viele unerwünschte Ereignisse wie Verbrennungen gibt, reduzieren Sie die Leistungim Bereich von 40 mW/cm2 .</li>
	<li>Reinigen Sie den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren Sie APC (100 μg) intravenös über die Schwanzvene 24 h vor der NIR-Bestrahlung. Drücken Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Blutung zu kontrollieren. HINWEIS: Stellen Sie das Volumen des APC für die Injektion auf 50-200 μL ein.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse (Schritt 2.3) und legen Sie sie auf den Rücken. Um eine NIR-Bestrahlung der Nichtzielstelle zu vermeiden, schirmen Sie andere Stellen mit Aluminiumfolie ab (Abbildung 7A). Bestrahlung mit NIR-Licht mit einem Laser von 100 J/cm2; Wenn der Tumor zurück in den Bauch verteilt wird, könnte die NIR-Lichtbestrahlungsdosis in mehrere Richtungen aufgeteilt werden (Abbildung 7B). HINWEIS: Stellen Sie die Dosis auf 30-150 J / cm2 in Abhängigkeit von den In-vitro-Ergebnissen und unerwünschten Ereignissen wie Verbrennungen ein.</li>
	<li>Wenn die NIR-Bestrahlung abgeschlossen ist und die Maus wach ist, bringen Sie sie in den Käfig zurück.</li>
	<li>Beobachten Sie den BLI und messen Sie den ROI im Zeitverlauf (jeden Tag) (siehe 3.2-3.12).</li>
	<li>Für die Ex-vivo-Bildgebung euthanasieren Sie Mäuse mit Kohlendioxid 24 h nach der APC-Injektion, unmittelbar vor der NIR-Bestrahlung.<ol>
<li>Um das Innere der Brust der Maus zu beobachten, entfernen Sie den Thorax und schneiden Sie die Rippen und das Brustbein. Erfassen Sie das Fluoreszenzbild (700 nm) zusammen mit der Kontrolle ohne APC-Verabreichung. Dann D-Luciferin (150 μg/ml) über den exponierten Thorax auftragen, und das BLI wurde entnommen (siehe 3.2-3.7).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In dieser Studie demonstrierten wir eine Methode zur Messung der therapeutischen Wirkung von NIR-PIT auf das Pleuraverbreitungsmodell von MPM. Hochselektive Zelltötung wurde mit NIR-PIT durchgeführt; so wurde das normale Gewebe kaum geschädigt23,24,25. Bei dieser Art der selektiven Zelltötung erwies sich NIR-PIT in disseminierten Modellen9,26</...

Krebs bleibt trotz jahrzehntelanger Forschung eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit. Ein Grund dafür ist, dass Strahlentherapie und Chemotherapie hochinvasive Techniken sind, die ihren therapeutischen Nutzen einschränken können. Zell- oder molekular-zielgerichtete Therapien, bei denen es sich um weniger invasive Techniken handelt, erhalten erhöhte Aufmerksamkeit. Die Photoimmuntherapie ist eine Behandlungsmethode, die die therapeutische Wirkung durch die Kombination von Immuntherapie und Phototherapie synergistisch verstärkt. Die Immuntherapie verbessert die Tumorimmunität, indem sie die Immunogenität der Tumormikroumgebung erhöht und die immunregulatorische Unterdrückung reduziert, was zur Zerstörung von Tumoren im Körper führt. Die Phototherapie zerstört Primärtumoren mit einer Kombination aus Photosensibilisatoren und Lichtstrahlen, und tumorspezifische Antigene, die aus den Tumorzellen freigesetzt werden, verbessern die Tumorimmunität. Tumore können selektiv mit Photosensibilisatoren behandelt werden, da sie spezifisch und selektiv für die Zielzellen sind. Die Modalität der Phototherapie umfasst photodynamische Therapie (PDT), photothermische Therapie (PTT) und photochemische Therapien1.
Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Methode der Antitumor-Phototherapie, die photochemisch basierte Therapie und Immuntherapiekombiniert 1,2. NIR-PIT ist eine molekular zielgerichtete Therapie, die auf spezifische Zelloberflächenmoleküle durch die Konjugation eines Nahinfrarot-Siliziumphthalocyaninfarbstoffs, IRdye 700DX (IR700), zu einem monoklonalen Antikörper (mAb) abzielt. Die Zellmembran der Zielzelle wird bei Bestrahlung mit NIR-Licht (690 nm)zerstört 3.
Das Konzept der gezielten Lichttherapie durch Kombination herkömmlicher Photosensibilisatoren und Antikörper oder gezielter PDT ist über drei Jahrzehnte alt4,5. Frühere Studien haben versucht, konventionelle PDT-Wirkstoffe anzusprechen, indem sie mit Antikörpern konjugiert wurden. Der Erfolg war jedoch begrenzt, da diese Konjugate aufgrund der Hydrophobie der Photosensibilisatoren in der Leber eingeschlossen waren6,7. Darüber hinaus unterscheidet sich der Mechanismus von NIR-PIT völlig von dem der herkömmlichen PDT. Herkömmliche Photosensibilisatoren erzeugen oxidativen Stress, der aus einer Energieumwandlung resultiert, die Lichtenergie absorbiert, in einen angeregten Zustand verrenkt, in den Grundzustand übergeht und Apoptose verursacht. NIR-PIT verursacht jedoch eine schnelle Nekrose, indem es die Zellmembran direkt zerstört, indem Es Photosensibilisatoren auf der Membran durch eine photochemische Reaktion aggregiert8. NIR-PIT ist der herkömmlichen zielgerichteten PDT in vielerlei Hinsicht überlegen. Herkömmliche Photosensibilisatoren haben niedrige Extinktionskoeffizienten, die die Bindung einer großen Anzahl von Photosensibilisatoren an ein einzelnes Antikörpermolekül erfordern, was möglicherweise die Bindungsaffinität verringert. Die meisten herkömmlichen Photosensibilisatoren sind hydrophob, was es schwierig macht, die Photosensibilisatoren an Antikörper zu binden, ohne ihre Immunreaktivität oder In-vivo-Zielakkumulation zu beeinträchtigen. Herkömmliche Photosensibilisatoren absorbieren typischerweise Licht im sichtbaren Bereich und reduzieren die Gewebepenetration.
Mehrere Studien zu NIR-PIT, die auf intrathorakische Tumoren wie Lungenkrebs und maligne Pleuramesotheliomzellen (MPM) abzielen, wurden berichtet9,10,11,12,13,14,15,16,17. Allerdings haben nur wenige Berichte die Wirksamkeit von NIR-PIT in pleural disseminierten MPM- oder Lungenkrebsmodellen9,10,11,12beschrieben. Subkutane Tumor-Xenograft-Modelle gelten als Standard-Tumormodelle und werden derzeit häufig verwendet, um die Antitumoreffekte neuer Therapien zu bewerten18. Die mikroumgebung des subkutanen Tumors ist jedoch nicht freizügig für die Entwicklung einer geeigneten Gewebestruktur oder eines Zustands, der einen echten malignen Phänotyp19, 20,21,22richtig rekapituliert . Idealerweise sollten orthotopische Krankheitsmodelle für eine genauere Beurteilung der Antitumorwirkungen erstellt werden.
Hier demonstrieren wir eine Methode zur Wirksamkeitsbewertung in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs, das mit NIR-PIT behandelt wurde. Ein Pleuraverbreitungsmausbau-Mausmodell wird durch Injektion von Tumorzellen in die Brusthöhle generiert und mittels Luciferase-Lumineszenz bestätigt. Die Maus wurde mit einer intravenösen Injektion von mAb behandelt, konjugiert mit IR700 und NIR-Bestrahlung in die Brust. Die therapeutische Wirkung wurde mittels Luciferase-Lumineszenz evaluiert.

<table><tbody><tr><td>0,25 W/v% Trypsin-1 mmol/l EDTA 4Na Lösung mit Phenolrot</td><td>Wako</td><td>209-016941</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td>für Mäuse Experiment</td></tr><tr><td>30G Nadel</td><td>Nipro</td><td>1907613</td><td>für Mäuse Experiment</td></tr><tr><td>BALB/cSlc-nu/nu</td><td>Japan SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collidal Blue Färbekit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>verwenden für die Färbung von Gelproteinen</td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Plus Proteinassay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td>zur Messung der APC-Konzentration</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>zur Konjugation von IR700</td></tr><tr><td>D-Luciferin (Kaliumsalz)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td>für die Biolumineszenz-Bildgebung und DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td><td>GraphPad-Software</td><td></td><td>für die statistische Analyse</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>für die Analyse von 700 nm Fluoreszenzbildern</td></tr><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Wako</td><td>095-06573</td><td>für Mäuse Anästhesie</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>für die Aufnahme Biolumineszenzbild und DLIT</td></tr><tr><td>Living Image</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>zur Analyse von Biolumineszenzbildern und DLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td>zur Konjugation von IR700</td></tr><tr><td>NIR-Laser</td><td>Changchun New Industries Optoelectronics Technology</td><td>MRL-III-690R</td><td>für NIR-Bestrahlung</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4 bis 20%, Tris-Glycin, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12 well</td><td>Invitrogen</td><td>XP04202BOX</td><td>Verwendung für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer (x4)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Verwendung für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td>zur Messung der Leistung des NIR-Lasers&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy Imaging System</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>für die Aufnahme von 700 nm Fluoreszenzbildern</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin Lösung (x100)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochlorid</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>für Luciferase-Transfektion</td></tr><tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td><td>für Luciferase-Transfektion</td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit L-Glutamin und Phenolrot</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Sephadex G25 Säule (PD-10) &nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td>Verwendung zur Konjugation von IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>zur Messung der APC-Konzentration</td></tr></tbody></table>

nahinfrarot-photoimmuntherapie für mausmodelle der pleuraverbreitung

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

Die Wirksamkeit der Photoimmuntherapie kann mit einem orthotopen Mausmodell genauer beurteilt werden als mit einem subkutanen. Ein Pleuraverbreitungsmodell kann zur Bewertung von Behandlungsmethoden für intrathorakische Erkrankungen wie Lungenkrebs oder malignes Pleuramesotheliom verwendet werden.
Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Krebsbehandlungsstrategie, die die Spezifität von tumoranvisierenden Antikörpern mit der Toxizität kombiniert, die durch einen Photoabsorber (IR700Dye) nach Exposition gegenüber NIR-Licht verursacht wird. Die Wirksamkeit von NIR-PIT wurde unter Verwendung verschiedener Antikörper berichtet; die therapeutische Wirkung dieser Strategie wurde jedoch nur in wenigen Berichten in einem orthotopischen Modell gezeigt. In der vorliegenden Studie zeigen wir ein Beispiel für die Wirksamkeitsbewertung des pleural disseminierten Lungenkrebsmodells, das mit NIR-PIT behandelt wurde.

Der Anti-Podoplanin-Antikörper NZ-1 wurde mit IR700 konjugiert, um NZ-1-IR700 zu erzeugen. Wir haben die Bindung von NZ-1 und IR700 auf einer SDS-PAGE bestätigt (Abbildung 8). Luciferase-exprimierendes H2373 (H2373-luc) wurde hergestellt, indem maligne Mesotheliomzellen (H2373) mit einem Luciferase-Gen10transfiziert wurden.
Wir betäubten 8-12 Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse und injizierten 1 × 105 H2373-luc...

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

Mit dieser Methode können die therapeutischen Wirkungen von NIR-PIT auf thorakale Tumoren in einem klinisch relevanten Tumormodell bewertet werden. Die NIR-PIT-Verfahren mit dem pleuraseminierten Krebsmodell sind leicht zu verstehen und durchzuführen. Um ein Mausverbreitungsmodell einzurichten, verwenden Sie Polystyrolschaum, um einen Stopfen herzustellen, und desinfizieren Sie ihn mit 70% Ethanol.Befestigen Sie die Nadel am Stopfen, wobei die Spitze fünf Millimeter aus dem Stopfen herausragt. Biegen Sie die Spitze einer 30-Gauge-Nadel mit einer sauberen Zette oder gegen einen harten Gegenstand, der mit 70% Ethanol gereinigt wurde, und füllen Sie eine Spritze mit einmal 10 zu den sechs Zieltumorzellen in 100 Mikroliter PBS. Bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf pedalreflex bei einer betäubten, 19 bis 21 Gramm alten, acht bis 12 Wochen alten, weiblichen, homozygoten, athymischen Nacktmaus.Führen Sie die Nadel durch den Interkostalraum in die Brust ein und bewegen Sie die Nadel nach oben und unten, um eine Berührung der Rippen zu vermeiden. Wenn die Spitze den Interkostalraum passiert hat, positionieren Sie die Spritze so, dass sie gegen die Maus gedrückt wird, und injizieren Sie das gesamte Volumen der Zielzellen. Nach der Injektion rollen Sie die Maus zwei- bis dreimal, um die Zellen in der Gesamten Brusthöhle zu verteilen, und bringen Sie die Maus mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung in ihren Käfig zurück.24 Stunden nach der Zellinjektion und jeden Tag danach injizieren Sie den anästhesierten Tumorzell-injizierten Mäusen 200 Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter D-Luciferin. Setzen Sie die Mäuse nach 10 Minuten in einen Biolumineszenz-Imager und öffnen Sie das Acquisition Control Panel in der Imager-Software. Wählen Sie Luminescent, Photograph und Overlay aus.Stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto, die Binning auf Small, die Leuchte auf eins für Luminescent und auf acht für Photograph und das Sichtfeld auf C.Click Acquire ein, um die Biolumineszenz abbilden. Legen Sie das Anzeigeformat auf Bogenmaß fest, und wählen Sie den Kreis aus den Werkzeugbereichswerkzeugen im Werkzeugpalettenbedienfeld aus. Klicken Sie auf Relevante Bereiche messen, um die Biolumineszenzintensität der Oberfläche zu messen, und wählen Sie mit "Messung konfigurieren" die für das Experiment relevanten Werte aus.Exportieren Sie diese Datentabelle als CSV-Datei. Verwenden Sie dann die Gesamtflusswerte für die Quantifizierung der biolumineszierenden Intensität in der Datei. Bevor Sie eine Nahinfrarot-Phototherapie der tumorinjizierten Mäuse durchführen, verwenden Sie ein Leistungsmessgerät, um die Lichtdosis eines 690-Nanometer-Wellenlängenlasers zu messen und die Leistung auf 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter einzustellen.24 Stunden vor der Behandlung wurden intravenös 100 Mikrogramm Antikörper-Photosensibilisator-Konjugat in 50 bis 200 Mikroliter PBS über die Schwanzvene des tumorinjizierenden Tieres injiziert. Legen Sie am Tag der Phototherapie-Behandlung die anästhesierte konjugierte, tumorbeladene Maus in Rückenlage und schirmen Sie die Nicht-Zielstellen mit Aluminiumfolie ab. Wenn alle Schilde platziert sind, verwenden Sie einen 100-Joule-pro-Quadratzentimeter-Laser, um die Brusthöhle für etwa 30 Sekunden mit Nahinfrarotlicht zu bestrahlen.Wenn die Bestrahlung abgeschlossen ist und die Maus aufgewacht ist, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und messen Sie die Biolumineszenz täglich, wie gezeigt. In dieser repräsentativen Analyse wurde die Konjugation des Anti-Podoplanin-Antikörpers mit IR700 durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Nach der Injektion von Tumorzellen sollten Biolumineszenzbildgebung und diffuse Lumineszenzbildtomographie durchgeführt werden, um festzustellen, welche Mäuse ausreichende Luciferase-Aktivität in der Brusthöhle für weitere Studien exprimieren.Am fünften Tag nach der Injektion zeigen Anti-Podoplanin-Antikörper IR700-injizierte Mäuse eine hohe IR700-Fluoreszenz- und Luciferase-Aktivität in thorakalen Tumoren, was darauf hindeutet, dass intravenös injizierte IR700-konjugierte Antikörper disseminierte Pleuratumorstellen erreichen. Insbesondere pleural disseminierte Mäuse, die mit einer Nahinfrarot-Photoimmuntherapie behandelt wurden, zeigen eine verminderte Luciferase-Aktivität, während die relativen Lichteinheiten in der Kontrollgruppe eine allmähliche Zunahme der Intensität aufweisen. Da die erforderliche NIR-Bestrahlungsenergie von der Zelllinie und den Antikörpern abhängt, sollten Sie die Bedingungen im Voraus in vitro überprüfen.

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Forschung

JoVE Journal

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Medizin

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. Dieses Video beschreibt die in vivo Anti-Tumor-Wirksamkeitsanalyse mit Hilfe von Photosensibilisatoren, die Nanopartikel enthalten, in einer tumortragenden Maus, um das phototoxische Potenzial des...

In vivo Antitumor-Wirksamkeitsanalyse der PDT: Eine Technik zur Bestimmung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators bei tumortragenden Mäusen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines Mausmodells der Pleuraverbreitung durch Injektion von Lungenkrebszellsuspension in die Brusthöhle einer immundefizienten Maus.

Etablierung eines Mausmodells für pleural disseminierten Lungenkrebs

Dieses Video demonstriert eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs in einem manipulierten Mausmodell, das Luciferase-exprimierende Tumorzellen zeigt. Nach der Injektion eines Antikörper-Photosensibilisator-Konjugats (APC), das an spezifische Antigene auf den Tumorzellen bindet, wird die Maus Nahinfrarotstrahlung ausgesetzt, die photochemische Veränderungen im APC induziert und zum nekrotischen Tod der gebundenen Tumorzellen führt. Die Wirksamkeit der Behandlung...

Eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs im Mausmodell

Dieses Video zeigt eine Technik zur selektiven Entnahme spezifischer Zellen aus einer gemischten 3D-Zellkultur durch Nahinfrarot-Photoimmuntherapie. Bei dieser Methode werden Zielzellen mit Hilfe eines Antikörpers, der mit einem NIR-Photoabsorber konjugiert ist, genau identifiziert. Die anschließende Bestrahlung mit Infrarotlicht induziert den Zelltod, wodurch die Zielzellen effektiv aus der 3D-Kultur eliminiert werden.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie zur gezielten Zelleliminierung in gemischten 3D-Kulturen

Spezifische Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, ist extrem schwierig, insbesondere in etablierten Geweben, dennoch besteht ein dringender Bedarf an einer Zelleliminierungsmethode im Bereich der Gewebezüchtung. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor.

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Forschung auf Behandlungsstrategien für pluripotente Stammzellen abgeleitet darum ist wichtig für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erstens Stammzellen abgeleitet darum zu generieren, bei Mäusen und dann selektiv auf und behandeln diese Tumoren in vivo mit einem kleinen Tier Brutapparat.

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

Dieser Artikel beschreibt die Erzeugung eines orthotopischen Mausmodells des menschlichen Pleuramesothelioms durch Implantation von H2052/484 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle immungeschwächter athymischer Mäuse. Die Längsüberwachung der Entwicklung intrapleuraler Tumoren wurde durch nicht-invasive multimodale [18F]-2-Fluor-2-Deoxy-D-Glucose-Positronen-Emissionstomographie und Computertomographie untersucht.

Implantation und Überwachung eines orthotopischen Modells des menschlichen Pleuralmesothelioms bei athymischen Mäusen durch PET/CT

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Wir stellen eine Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen aus Lungenmetastasen vor, die ein chirurgisches Protokoll zur selektiven Photokonversion von Lungenmetastasen beinhaltet, gefolgt von der Identifizierung von redisseminierten Tumorzellen in tertiären Organen.

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

Die Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie wird durch das geringe Eindringen in das Gewebe erschwert. Hier beschreiben wir ein Mausmodell mit dorsaler Fensterkammer, das die Co-Registrierung der Intravitalmikroskopie und klinisch anwendbarer Bildgebungsmodalitäten (z. B. CT, MRT) für eine direkte räumliche Korrelation ermöglicht und so die klinische Translation von Befunden der Intravitalmikroskopie möglicherweise rationalisiert.

Ein Mausmodell eines dorsalen Hautfaltenfensterkammertumors für die kombinierte Intravitalmikroskopie und Magnetresonanztomographie in der translationalen Krebsforschung

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Erfahren Sie die Anwendung von Nahinfrarot-Photoimmuntherapie bei pleural disseminiertem Lungenkrebs in einem Mausmodell. Diese Methode nutzt Biolumineszenz-Bildgebung zur Überwachung therapeutischer Effekte in vivo.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

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