Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es die genetische Modifikation eines zuvor nicht manipulierbaren Serotyps ermöglicht und es ermöglicht, den Serotyp zu erforschen und zu verstehen. Dies eröffnet Wege für biologische Arbeiten, wie z. B. die Entwicklung von Impfstoffen. Vanessa S.Terra, Assistenzprofessorin an der London School of Hygiene and Tropical Medicine, wird das Verfahren vorführen.

Um mit der Erzeugung des Plasmids pSD1 zu beginnen, führen Sie eine Ligation gemäß den Anweisungen des Herstellers von pGEM-T Easy System I durch. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius. Transformieren Sie am nächsten Tag chemisch kompetentes E.coli Dh5-alpha mit pSD1, inkubieren Sie 50 Mikroliter der Zellen mit drei Mikrolitern pSD1-Ligationsreaktion für 15 Minuten auf Eis, setzen Sie dann die Zellen einem thermischen Schock aus und legen Sie die Zellen für zwei Minuten auf Eis.

Nehmen Sie die Zellen aus dem Eis und fügen Sie 350 Mikroliter SOC-Medien hinzu und inkubieren Sie die Kultur zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 120 U/min. Die Transformation auf Luria-Bertani-Agar wird mit 0,4 Millimolar IPTG, 0,24 Milligramm pro Milliliter X-Gal für die Blau-Weiß-Selektion und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin ergänzt, um sicherzustellen, dass alle Kolonien, die auf der Platte wachsen, das Plasmidrückgrat haben. Pflücken Sie drei weiße Kolonien, die pSD1 enthalten, und legen Sie über Nacht Wachstum in 10 Millilitern L-B an, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin ergänzt werden.

Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.082 g und verwenden Sie das Pellet für die Plasmidextraktion. Nach der Extraktion der Plasmid-DNA wird ein BamH1-Restriktionsverdau sowohl für das pSD1-Plasmid als auch für die Spectinomycin-Kassette eingerichtet.

Inkubieren Sie die Restriktionsverdauungsreaktionen und -kontrollen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Wenn die Beschränkung abgeschlossen ist, analysieren Sie die Produkte durch Elektrophorese, schneiden Sie die richtige Bande heraus und reinigen Sie sie mit einem handelsüblichen Kit. Als nächstes führen Sie eine Ligationsreaktion mit dem BamH1-verdauten pSD1 und Spectinomycin durch.

Dadurch wird das Plasmid pSD2 erzeugt. Wandeln Sie pSD2 in chemisch kompetentes E.coli DH5-alpha um, wie zuvor beschrieben. Wählen Sie dann die Transformanten aus, die das Plasmid pSD2 tragen, basierend auf ihrer Fähigkeit, in LBA zu wachsen, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Spectinomycin und Ampicillin, und extrahieren Sie die Plasmid-DNA.

Bereiten Sie eine Übernachtkultur von S.pneumoniae 519/43 in BHI vor und lassen Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid statisch wachsen. Am nächsten Tag die Kulturen 1:50 und 1:100 in 10 Millilitern frischer BHI-Brühe verdünnen. Inkubieren Sie die Kultur statisch bei 37 Grad Celsius, bis der OD bei 595 Nanometern zwischen 0,05 und 0,1 liegt.

Sobald der entsprechende OD erreicht ist, nehmen Sie 860 Mikroliter Kultur und überführen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 100 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumhydroxid, 10 Mikroliter 20 % BSA, 10 Mikroliter 100 Millimolare Calciumchlorid, zwei Mikroliter 50 Nanogramm CSP1 pro Milliliter und 500 Nanogramm pSD2 hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion statisch bei 37 Grad Celsius für drei Stunden.

Dann werden über eine dreistündige Inkubationszeit stündlich 330 Mikroliter auf 5%ige Blutagarplatten aufgefüllt, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Spectinomycin ergänzt werden. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Patchen Sie Spectinomycin-resistente Kolonien auf eine andere Blutagarplatte, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Spectinomycin ergänzt wird, und auf Blutagarplatten, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin ergänzt werden, wodurch das Vorhandensein des Plasmidrückgrats getestet wird.

Inkubieren Sie beide Plattensätze über Nacht. Die korrekte Assemblierung von pSD2 wurde durch Restriktionsverdau bestätigt. pSD2 wurde dann verwendet, um 519.43 Wildtyp-Zellen zu transformieren.

Kolonien, die nach einer Inkubation über Nacht auf Spectinomycin wuchsen, wurden als positive Transformanten angesehen. Die phänotypische Bestätigung der Pneumolysin-Mutation erfolgte durch Beurteilung der hämolytischen Aktivität für D39, 519/43 Wildtyp und mutiertes 519/43 Delta Ply. Dies wurde mit der Hämolyse der roten Blutkörperchen um 0,5 % Saponin verglichen, was als 100 % gilt. Die Mutante verlor ihre Fähigkeit, rote Blutkörperchen zu lysieren.

Alle positiven Kolonien wurden durch Sequenzierung zur Beurteilung der Lokalisation des Insertionsortes weiter bestätigt. Es wurden Primer mit Bindungsstellen außerhalb der Homologieregion verwendet. Bei der Durchführung der Transformationsreaktion ist es wichtig, die Reagenzien in der richtigen Reihenfolge hinzuzufügen.