Name: Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung chemischer Verbindungen, die die bakterielle Persistenz beeinflussen. Diese Methode ist anpassbar für Arzneimittelpanels und Genbibliotheken.

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Wir danken den Mitgliedern des Orman Lab für ihre wertvollen Beiträge während dieser Studie. Diese Studie wurde durch den NIH / NIAID K22AI125468 Career Transition Award und ein Startup-Stipendium der University of Houston finanziert.

1. Herstellung von Wachstumsmedium, Ofloxacinlösung und E. coli-Zellbeständen
<ol><li>Normales Luria-Bertani (LB) Medium: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L Natriumchlorid (NaCl) und 5 g / L Hefeextrakt in entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.</li>
	<li>LB-Agarplatten: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L NaCl, 5 g / L Hefeextrakt und 15 g / L Agar in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren. Bei der gewünschten Temperatur (~55 °C) ~30 mL Agarmedium in quadratische Platten (10 x 10 cm) gießen. Die Platten trocknen und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Modifiziertes LB-Medium: Fügen Sie 10 g / L Trypton und 5 g / L Hefeextrakt in DI-Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.</li>
	<li>Modifiziertes LB-Medium einschließlich Osmolyt: Mischen Sie 2x modifiziertes LB-Medium mit einer 2x Osmolytlösung in gleichen Mengen. Um 2x modifiziertes LB-Medium vorzubereiten, fügen Sie 20 g / L Trypton und 10 g / L Hefeextrakt in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren. Um die 2x Osmolytlösung vorzubereiten, lösen Sie den interessierende Osmolyten (2x Menge) in DI-Wasser auf und sterilisieren Sie dann die Lösung. HINWEIS: Der interessierenswerte Osmolyt und seine Konzentrationen können aus den Phänotyp-Microarray-Screening-Assays bestimmt werden (siehe Protokoll 4). Der getestete Osmolyt und die damit verbundene 2-fache Konzentration können jedoch je nach Art der Forschung angepasst werden. Um beispielsweise die Auswirkungen von 1 mM Natriumchlorid zu untersuchen, wäre eine 2x Osmolytlösung eine 2 mM Natriumchloridlösung.</li>
	<li>Ofloxacin-Stammlösung (5 mg/ml): 5 mg Ofloxacin (OFX)-Salz in 1 ml DI-Wasser hinzufügen. Fügen Sie 10 μL 10 M Natriumhydroxid hinzu, um die Löslichkeit von OFX in Wasser zu erhöhen, und filtern Sie dann die Lösung. Aliquoten zubereiten und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Ofloxacin ist ein Chinolon-Antibiotikum, das sowohl für wachsende als auch für nicht wachsende Bakterienzellen weit verbreitet ist14,21. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von OFX für E. coli MG1655-Zellen liegt im Bereich von 0,039–0,078 μg/ml19,20. Beachten Sie auch, dass andere Antibiotika wie Ampicillin und Kanamycin häufig in der Persisterforschung verwendet werden. Die Wahl der Antibiotika hängt von der Art der Studie ab.</li>
	<li>
E. coli MG1655-Zellbestände: Impfen Sie 2 ml normales LB-Medium mit einer einzigen Kolonie in einem 14-ml-Reagenzglas (Snap-Capped) und kultivieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 ° C. Wenn die Zellen die stationäre Phase erreichen, mischen Sie 500 μL der Zellkultur mit 500 μL 50% Glycerin (steril) in einer kryogenen Durchstechflasche und lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
</ol>2. Vermehrung von Zellen zur Eliminierung bereits vorhandener Persister
<ol><li>Um eine Kultur über Nacht vorzubereiten, kratzen Sie eine kleine Menge Zellen aus einem gefrorenen Zellbestand mit einer sterilen Pipettenspitze (tauen Sie den Glycerinzellbestand nicht auf) und impfen Sie die Zellen in 2 ml modifiziertem LB-Medium in einem 14-ml-Snap-Capped-Reagenzglas. Die Zellen werden in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C für 12 h kultiviert.</li>
	<li>Erste Vermehrung<ol>
<li>Nach 12 h 250 μL Nachtkultur in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250 ml schallgefassten Kolben, der mit einer sterilen Aluminiumfolie bedeckt ist, übertragen.</li>
		<li>Züchten Sie die Zellkultur in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 °C, bis die Zellen die mittlere exponentielle Phase (OD600 = 0,5) erreichen.</li>
		<li>Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600)mit einem Mikroplattenleser alle 30 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zweite Ausbreitung<ol>
<li>Bei OD600 = 0,5 werden 250 μL Zellkultur aus dem ersten Kolben in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250 ml schweren Kolben verdünnt.</li>
		<li>Die zweite Zellkultur wird in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C bis OD600=0,5 züchtet.</li>
		<li>Messen Sie die optische Dichte alle 30 Minuten. HINWEIS: Eine Nachtkultur kann eine signifikante Menge an Persisterzellenaufweisen 4,5,22. Die oben beschriebene Verdünnungs-/Wachstumszyklusmethode5 kann verwendet werden, um diese bereits vorhandenen Persister zu eliminieren, bevor die Zellen auf Microarrays übertragen werden. Ihre Eliminierung kann durch Quantifizierung der Persister-Spiegel von Nachtkulturen mit dem in Protokoll 3 beschriebenen Assay validiert werden. Diese Methode wurde bereits in einer früheren Studie validiert19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Validierung der Eliminierung bereits vorhandener Persisterzellen
<ol><li>Nach der zweiten Vermehrung (siehe Schritt 2.3) werden 250 μL der Zellkultur (OD600 = 0,5) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250 ml schallgefassten Kolben verdünnt. HINWEIS: Für Kontrollen 250 μL Nachtkultur (siehe Schritt 2.1) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250-ml-Schallkolben verdünnen. Vor dem Transfer der Zellen in den Kolben sollte die Zelldichte der Nachtkultur in frischem modifiziertem LB-Medium angepasst werden, um OD600 = 0,5 zu erhalten.</li>
	<li>25 μL OFX-Stammlösung (5 mg/ml) in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Die Endkonzentration von OFX beträgt 5 μg/ml in der Assay-Kultur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Assay-Kultur in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie zu jeder Stunde während der Behandlung (einschließlich 0 h, dem Zeitpunkt vor der Zugabe von OFX in die Assay-Kultur) 1 ml der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge die Assaykultur im Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.000 x g für 3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig 950 μL des Überstandes, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>950 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Waschschritte 3,5-3,7 für insgesamt 3x, bis die Antibiotikakonzentration unter der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) liegt.</li>
	<li>Nach der abschließenden Wäsche wird das Zellpellet in 100 μL PBS-Lösung wieder aufgebraucht, was zu einer 10-fach konzentrierten Probe führt.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal in 90 μL PBS-Lösung mit einer 96-well-runden Bodenplatte.</li>
	<li>Spot 10 μL verdünnte Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, werden die verbleibenden 90 μL Zellsuspension auf einer frischen Agarplatte plattiert.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C für 16 h und zählen Sie dann die koloniebildenden Einheiten (CFUs). Berücksichtigen Sie die Verdünnungsraten bei der Berechnung der Gesamtzahl der CFUs in 1 ml Assay-Kultur. Kill-Kurven werden generiert, indem die logarithmischen CFU-Werte in Bezug auf die Dauer der Antibiotikabehandlung dargestellt werden. HINWEIS: Eine 6-h-OFX-Behandlung reicht aus, um eine biphasische Tötungskurve für E. coli-Zellen 19,20zu erhalten. Der Persistergehalt der vermehrten Zellen (gemessen anhand der CFU-Anzahl bei 6 h) sollte signifikant niedriger sein als der der Nachtkultur. Die in Protokoll 2 und 3 beschriebenen Verfahren können je nach Forschungsdesign mit regulärer LB durchgeführt werden.</li>
</ol>4. Microarray-Platten-Screenings 
<ol><li>Herstellung von Microarray-Zellkulturen<ol>
<li>250 μL Exponentialphasenzellen in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen. HINWEIS: Die Exponentialphasenzellen (OD600 = 0,5) werden aus dem zweiten Ausbreitungsschritt erhalten (siehe Schritt 2.3).</li>
		<li>Die verdünnte Zellsuspension wird in ein steriles 50-ml-Reservoir überführen.</li>
		<li>Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 150 μL der Zellsuspension auf jede Vertiefung eines Microarrays, d. H. Eine 96-Well-Platte, die verschiedene Osmolyte enthält. HINWEIS: Vertiefungen, die keine Osmolyte haben, dienen als Kontrollen.</li>
		<li>Decken Sie das Microarray mit einer gasdurchlässigen Dichtmembran ab.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h. HINWEIS: In diesen Experimenten wurden kommerziell erhältliche Platten wie Phänotyp-Microarrays (PM-9 und PM-10) verwendet, die eine breite Palette von Osmolyten, pH-Puffern und anderen Chemikalien in getrocknetem Zustand in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Diese Microarrays sind in halbfappigen 96-Well-Plattenformaten erhältlich. Das Kulturvolumen sollte je nach Art der verwendeten Platten angepasst werden. Microarrays können auch manuell generiert werden (siehe unten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manuelle Vorbereitung von Microarray-Platten<ol>
<li>75 μL 2x Osmolytlösungen in die Vertiefungen einer halbfrächtigen 96-Well-Platte geben.</li>
		<li>500 μL Exponentialphasenzellen in 25 mL 2x modifiziertes LB-Medium in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen. HINWEIS: Die Impfrate wurde angepasst, um mit dem in 4.1 beschriebenen Microarray-Screening-Protokoll übereinzukommen.</li>
		<li>75 μL der Zellsuspension in jede Vertiefung der halbfärbigen 96-Well-Platte mit 2x Osmolytlösungen geben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Persister-Assay-Platten<ol>
<li>Bereiten Sie 25 ml modifiziertes LB-Medium mit 5 μg/ml OFX in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor und geben Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir.</li>
		<li>Übertragen Sie 190 μL modifiziertes LB-Medium mit OFX aus dem Reservoir in jede Vertiefung einer generischen Flachboden-96-Well-Platte (Persister-Assay-Platte) mithilfe einer Mehrkanalpipette.</li>
		<li>Entfernen Sie das Microarray aus dem Shaker (nach 24 h Kultivierung) und übertragen Sie 10 μL Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit OFX enthält.</li>
		<li>Nehmen Sie 10 μL Zellsuspensionen von der Persister-Assay-Platte und verdünnen Sie sie dreimal in 290 μL PBS-Lösung mit einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und einer Mehrkanalpipette.</li>
		<li>Nach der seriellen Verdünnung werden 10 μL aller seriell verdünnten Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten mit einer Mehrkanalpipette gefunden.</li>
		<li>Die Persister-Assay-Platte (vorbereitet in Schritt 4.3.3) wird in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 6 h inkubiert, nachdem die Platte mit einer gasdurchlässigen Dichtungsmembran abgedeckt wurde.</li>
		<li>Nach 6 h Inkubation in einem Shaker nehmen Sie die Persister-Assay-Platte heraus und wiederholen die Schritte 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Agarplatten für 16 h bei 37 °C und zählen Sie dann die CFUs. Die CFU-Werte vor und 6 h nach der Antibiotikabehandlung ermöglichen es, die Persisterfraktion in jeder Vertiefung zu berechnen. Die CFU-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch, die Auswirkungen von Osmolyten und auf die Lebensfähigkeit von E. coli zu beurteilen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validierung der ermittelten Bedingungen
<ol><li>Transfer von 250 μL der exponentiellen Phasenzellen aus Schritt 2,3 auf 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium, das den beim Microarray-Screening identifizierten Osmolyten enthält (siehe Protokoll 4).</li>
	<li>Inkubieren Sie den Kolben in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 °C für 24 h.</li>
	<li>Nach 24 h den Kolben aus dem Shaker nehmen und 250 μL der Zellkultur in 25 mL frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250-ml-Schallkolben übertragen.</li>
	<li>25 μL OFX-Stammlösung (5 mg/ml) in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Inkubieren Sie den Kolben in einem Shaker bei 37 °C und 250 U/min.</li>
	<li>Übertragen Sie während der Behandlung stündlich 1 ml der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge die Assaykultur im Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.000 x g für 3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie 950 μL Überstand und fügen Sie 950 μL PBS hinzu.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Waschschritte 5.6 und 5.7 für 3x.</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche wird das Zellpellet in 100 μL PBS-Lösung wieder aufgebraucht.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie 6x in 90 μL PBS-Lösung mit einer 96-well-runden Bodenplatte.</li>
	<li>Spot 10 μL der verdünnten Zellsuspensionen auf einer antibiotikafreien frischen Agarplatte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, werden die verbleibenden 90 μL Zellsuspension auf einer frischen Agarplatte plattiert.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Agarplatte bei 37 °C für 16 h und zählen Sie dann CFUs.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Der hier beschriebene Hochdurchsatz-Persister-Assay wurde entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Chemikalien auf die Persistenz von E. coli aufzuklären. Zusätzlich zu kommerziellen PM-Platten können Microarrays manuell konstruiert werden, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Darüber hinaus ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel und kann verwendet werden, um andere Microarrays wie Drug Panels und Zellbibliotheken zu screenen, die in 96 Well-Plate-Formaten vorliegen. Die experimentellen Bedingungen einschl...

Bakterienkulturen enthalten eine kleine Subpopulation von Persisterzellen, die vorübergehend tolerant gegenüber ungewöhnlich hohen Antibiotikaspiegeln sind. Persisterzellen sind genetisch identisch mit ihren antibiotikaempfindlichen Verwandten, und ihr Überleben wurde der vorübergehenden Wachstumshemmung zugeschrieben1. Persisterzellen wurden zuerst von Gladys Hobby2 entdeckt, aber der Begriff wurde zuerst von Joseph Bigger verwendet, als er sie in Penicillin-behandelten Staphylococcus pyogenes-Kulturen identifizierte3. Eine bahnbrechende Studie, die von Balaban et al.4 veröffentlicht wurde, entdeckte zwei Persistertypen: Typ-I-Varianten, die hauptsächlich durch die Passage durch die stationäre Phase gebildet werden, und Typ-II-Varianten, die während des exponentiellen Wachstums kontinuierlich erzeugt werden. Persister werden durch klonogene Überlebenstests nachgewiesen, bei denen Während der Antibiotikabehandlung in verschiedenen Abständen Kulturproben entnommen, gewaschen und auf einem typischen Wachstumsmedium plattiert werden, um die überlebenden Zellen zu zählen, die sich ohne Antibiotika ansiedeln können. Die Existenz von Persistern in einer Zellkultur wird durch eine biphasische Tötungskurve4,5 beurteilt,wobei der anfängliche exponentielle Zerfall den Tod antibiotikaempfindlicher Zellen anzeigt. Der Tötungstrend nimmt jedoch im Laufe der Zeit ab, was schließlich zu einer Plateauregion führt, die die überlebenden Persisterzellen darstellt.
Persisterzellen wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Tuberkulose6, Mukoviszidose7, Candidiasis8 und Harnwegsinfektionen9 inVerbindung gebracht . Fast alle bisher getesteten Mikroorganismen erzeugen persistere Phänotypen, darunter hochpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 und Candida albicans8. Neuere Studien liefern auch Hinweise auf den Anstieg multiresistenter Mutanten aus persisteren Subpopulationen11,12. Erhebliche Anstrengungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass Persistenzmechanismen sehr komplex und vielfältig sind; Es istbekannt,dass sowohl stochastische als auch deterministische Faktoren, die mit der SOS-Reaktion13,14, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)15, Toxin/Antitoxin (TA) -Systemen16, Autophagie oder Selbstverdauung17 und ppGpp-bezogener strenger Reaktion18 verbunden sind, die Persisterbildung erleichtern.
Trotz signifikanter Fortschritte beim Verständnis des Persistenzphänotyps sind die Auswirkungen von Osmolyten auf die bakterielle Persistenz nicht vollständig verstanden. Da die Aufrechterhaltung eines optimalen osmotischen Drucks eine Notwendigkeit für das Wachstum, die ordnungsgemäße Funktion und das Überleben der Zellen ist, könnte eine eingehende Untersuchung von Osmolyten zu potenziellen Zielen für Anti-Persister-Strategien führen. Obwohl mühsam, ist das Hochdurchsatz-Screening ein sehr effektiver Ansatz zur Identifizierung von Metaboliten und anderen Chemikalien, die eine entscheidende Rolle bei der Persistenz des Phänotyps19,20spielen. In dieser Arbeit werden wir unsere veröffentlichte Methode19diskutieren, bei der wir Microarrays verwendet haben, dh 96 Wellplatten, die verschiedene Osmolyte enthalten (z. B. Natriumchlorid, Harnstoff, Natriumnitrit, Natriumnitrat, Kaliumchlorid), um Osmolyte zu identifizieren, die die Persistenz von E. coli signifikant beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>14-ml-Reagenzglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Stamm MG1655</td><td>Princeton University</td><td></td><td>Gewonnen aus dem Brynildsen-Labor</td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Gasdurchlässige Dichtungsmembran</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Durch Gammabestrahlung sterilisiert und frei von Zellgiften</td></tr><tr><td>Halbflächig 96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td> Ofloxacin-Salz <td>in molekulargenetischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge; 97.5</td></tr><tr><td>Phänotyp-Microarray (PM-9 und PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>PM-9- und PM-10-Platten enthielten verschiedene Osmolyte bzw. Puffer</td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit rundem Boden</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Zertifizierte ACS-Qualität</td></tr><tr><td>Natriumnitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>ACS-Reagenzqualität</td></tr><tr><td>Natriumnitrit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>98% Reinheit</td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Molekulargenetik</td></tr><tr><td>Varioskan lux Multimode-Mikroplatten-Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Wird für die optische Dichtemessung bei 600 nm verwendet</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Molekulargenetik</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening chemischer verbindungen zur aufklärung ihrer auswirkungen auf die bakterielle persistenz

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bakterielle Persister sind definiert als eine kleine Subpopulation phänotypischer Varianten mit der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von Antibiotika zu vertünden. Sie sind ein wichtiges Gesundheitsproblem, da sie mit wiederkehrenden chronischen Infektionen in Verbindung gebracht wurden. Obwohl bekannt ist, dass stochastische und deterministische Dynamiken stressbezogener Mechanismen eine bedeutende Rolle bei der Persistenz spielen, sind die Mechanismen, die dem phänotypischen Wechsel zum/vom Persistenzzustand zugrunde liegen, nicht vollständig verstanden. Während Persistenzfaktoren, die durch Umweltsignale ausgelöst werden (z. B. Erschöpfung von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffquellen), umfassend untersucht wurden, müssen die Auswirkungen von Osmolyten auf die Persistenz noch bestimmt werden. Mit Microarrays (d.h. 96 Brunnenplatten, die verschiedene Chemikalien enthalten) haben wir einen Ansatz entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Osmolyte auf die Persistenz von Escherichia coli mit hohem Durchsatz aufzuklären. Dieser Ansatz ist transformativ, da er leicht für andere Screening-Arrays wie Arzneimittelpanels und Gen-Knockout-Bibliotheken angepasst werden kann.

Abbildung 1 beschreibt unser experimentelles Protokoll. Die Verdünnungs-/Wachstumszyklusexperimente (siehe Protokoll 2) wurden aus einer Studie von Keren et al.5 adaptiert, um die Persister aus den Nachtkulturen zu eliminieren. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des KBE-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden. In diesen Experimenten wurden Zellen in modifiziertem...

In diesem Methodenpapier stellen wir eine Hochdurchsatz-Screening-Strategie vor, um chemische Verbindungen wie Osmolyte zu identifizieren, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.

Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, Zustände zu identifizieren, die die bakterielle Persistenz in hoher Durchsatzweise erheblich beeinflussen können. Diese Methode ist leicht an das Screening für verschiedene Bereiche wie Arzneimittelpanels, Genbibliotheken und mehr anpassbar. Da die Methode verschiedene Teilschritte umfasst, die gleichzeitig durchgeführt werden sollen, kann die visuelle Demonstration den Forschern helfen, ihr Timing zu verwalten, um präzise Ergebnisse zu erhalten.Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Microarray-Zellkulturen. 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen in 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Dann mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.Die verdünnte Zellsuspension wird in ein steriles 50-Milliliter-Reservoir überführen. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Microarray-Platte, die verschiedene Chemikalien enthält. Microarrays können auch manuell nach der im Textmanuskript beschriebenen Methode generiert werden.Decken Sie die Microarray-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min. Um Persister-Assay-Platten herzustellen, bereiten Sie 25 Milliliter modifiziertes LB-Medium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Ofloxacin in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor und übertragen Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir. 190 Mikroliter des modifizierten LB-Mediums in jede Vertiefung einer generischen flachen Bodenplatte mit 96 Well geben.Nach der 24-stündigen Inkubation entfernen Sie das Microarray aus dem Shaker und übertragen 10 Mikroliter Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit Ofloxacin enthält. Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellsuspensionen von der Persister-Aufsatzplatte und verdünnen Sie sie dreimal in 290 Mikroliter PBS-Lösung mit einer runden bodenigen 96-Well-Platte und einer Mehrkanalpipette. Entdecken Sie dann 10 Mikroliter aller seriell verdünnten Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten.Decken Sie die Persister-Assay-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Wiederholen Sie nach der sechsstündigen Inkubation die serielle Verdünnung und Fleckenbildung auf Agarplatten. Inkubieren Sie die Agarplatten 16 Stunden bei 37 Grad Celsius.Zählen Sie dann die koloniebildenden Einheiten oder CFUs. Verwenden Sie die CFU-Werte vor und sechs Stunden nach der Antibiotikabehandlung, um die Persisterfraktion in jeder Vertiefung zu berechnen. Die CFU-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch, die Auswirkungen von Osmoliten auf die Lebensfähigkeit von E-Coli zu beurteilen.Übertragen Sie 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium, das das beim Microarray-Screening identifizierte Osmolit enthält. Inkubieren Sie den Kolben in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach 24 Stunden den Kolben aus dem Shaker nehmen und 250 Mikroliter der Zellkultur in einen 250 Milliliter geblendeten Kolben auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium übertragen.25 Mikroliter Ofloxacin-Stammlösung in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Inkubieren Sie den Kolben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Zu jeder Stunde während der Behandlung, einschließlich eines Zeitpunkts vor der Zugabe von Ofloxacin, einen Milliliter der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und drei Minuten lang bei 17.000 mal G zentrifugieren.Entfernen Sie 950 Mikroliter Überstand und waschen Sie die Zellen dreimal mit 950 Mikrolitern PBS. Nach der abschließenden Wäsche suspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern PBS-Lösung erneut. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal seriell mit 90 Mikrolitern PBS in einer 96 gut runden Bodenplatte.Spot 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen auf einer antibiotikafreien Agarplatte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, legen Sie die restlichen 90 Mikroliter Zellsuspension auf eine frische Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden und zählen Sie dann CFUs.Ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des CFU-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden, ist hier gezeigt. Die erste Spalte ist die Kontrollgruppe. Die zweite Säule enthält Zellen, die in 100 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden, und die dritte Säule enthält Zellen, die in 60 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden.Der Einfachheit halber werden hier nur zwei Osmolite im Fokus. Eine grafische Darstellung der CFU-Daten der Platten und Persisterfraktionen der in 96 Well-Platten getesteten Zellkulturen ist hier dargestellt. Um die Fraktionen zu berechnen, wurden die Persisterzahlen auf die vor der Antibiotikabehandlung erhaltenen Zellzahlen normalisiert.Um byphasische Tötungskurven zu erzeugen, wurden die Zellen in 25 Millilitern modifiziertem LB-Medium mit den angegebenen Osmomiten und verblüfften Kolben für 24 Stunden kultiviert und dann zur Persister-Enumeration in Persister-Assay-Kolben überführt. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass das Erkennen der Zellen auf der Agarplatte arbeitsintensiv ist und Konzentration erfordert. Ein Fehler während des Schritts kann zu einer Kreuzkontamination zwischen den zu testenden Bedingungen führen.Daher ist es wichtig, vor dem Experiment zu üben, mehrere Proben gleichzeitig zu erkennen. Nach diesem Protokoll können Wirkstoffpanels und mutierte Zellbibliotheken untersucht werden, um die Auswirkungen auf die Persistenz zu untersuchen. Mit diesem Screening haben wir eine Reihe von Osmomiten und PS-Zuständen identifiziert, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Venkateswaran, S., et al. Hochdurchsatz-Identifizierung von bakterienabweisenden Polymeren für Medizinprodukte. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung bakterienabweisender Polymere mit Hilfe eines Microarray-Objektträgers, der gemischten Bakterienkulturen ausgesetzt wurde. Die bakterielle Bindung wird durch DAPI-Fluoreszenz bewertet, wobei ein reduziertes Signal Polymere mit minimaler Oberflächenbindung anzeigt.

Hochdurchsatz-Identifizierung von bakterienabweisenden Polymeren mittels Microarray-Screening

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode, um die Wirkung von Osmolyten auf die Bildung von bakteriellen Persisteren zu bewerten. Die Bakterienzellen werden zunächst Osmolyten ausgesetzt, um osmotischen Stress zu induzieren, was die Bildung von Persistern auslöst, und dann mit Antibiotika behandelt, um die Persister aufzuzählen.

In-vitro-Persister-Assay: Eine Methode zur Bewertung der Wirkung von Osmolyten auf die bakterielle Persistenz

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