Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, Zustände zu identifizieren, die die bakterielle Persistenz in hoher Durchsatzweise erheblich beeinflussen können. Diese Methode ist leicht an das Screening für verschiedene Bereiche wie Arzneimittelpanels, Genbibliotheken und mehr anpassbar. Da die Methode verschiedene Teilschritte umfasst, die gleichzeitig durchgeführt werden sollen, kann die visuelle Demonstration den Forschern helfen, ihr Timing zu verwalten, um präzise Ergebnisse zu erhalten.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Microarray-Zellkulturen. 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen in 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Dann mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.

Die verdünnte Zellsuspension wird in ein steriles 50-Milliliter-Reservoir überführen. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Microarray-Platte, die verschiedene Chemikalien enthält. Microarrays können auch manuell nach der im Textmanuskript beschriebenen Methode generiert werden.

Decken Sie die Microarray-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min. Um Persister-Assay-Platten herzustellen, bereiten Sie 25 Milliliter modifiziertes LB-Medium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Ofloxacin in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor und übertragen Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir. 190 Mikroliter des modifizierten LB-Mediums in jede Vertiefung einer generischen flachen Bodenplatte mit 96 Well geben.

Nach der 24-stündigen Inkubation entfernen Sie das Microarray aus dem Shaker und übertragen 10 Mikroliter Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit Ofloxacin enthält. Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellsuspensionen von der Persister-Aufsatzplatte und verdünnen Sie sie dreimal in 290 Mikroliter PBS-Lösung mit einer runden bodenigen 96-Well-Platte und einer Mehrkanalpipette. Entdecken Sie dann 10 Mikroliter aller seriell verdünnten Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten.

Decken Sie die Persister-Assay-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Wiederholen Sie nach der sechsstündigen Inkubation die serielle Verdünnung und Fleckenbildung auf Agarplatten. Inkubieren Sie die Agarplatten 16 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Zählen Sie dann die koloniebildenden Einheiten oder CFUs. Verwenden Sie die CFU-Werte vor und sechs Stunden nach der Antibiotikabehandlung, um die Persisterfraktion in jeder Vertiefung zu berechnen. Die CFU-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch, die Auswirkungen von Osmoliten auf die Lebensfähigkeit von E-Coli zu beurteilen.

Übertragen Sie 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium, das das beim Microarray-Screening identifizierte Osmolit enthält. Inkubieren Sie den Kolben in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach 24 Stunden den Kolben aus dem Shaker nehmen und 250 Mikroliter der Zellkultur in einen 250 Milliliter geblendeten Kolben auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium übertragen.

25 Mikroliter Ofloxacin-Stammlösung in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Inkubieren Sie den Kolben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Zu jeder Stunde während der Behandlung, einschließlich eines Zeitpunkts vor der Zugabe von Ofloxacin, einen Milliliter der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und drei Minuten lang bei 17.000 mal G zentrifugieren.

Entfernen Sie 950 Mikroliter Überstand und waschen Sie die Zellen dreimal mit 950 Mikrolitern PBS. Nach der abschließenden Wäsche suspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern PBS-Lösung erneut. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal seriell mit 90 Mikrolitern PBS in einer 96 gut runden Bodenplatte.

Spot 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen auf einer antibiotikafreien Agarplatte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, legen Sie die restlichen 90 Mikroliter Zellsuspension auf eine frische Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden und zählen Sie dann CFUs.

Ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des CFU-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden, ist hier gezeigt. Die erste Spalte ist die Kontrollgruppe. Die zweite Säule enthält Zellen, die in 100 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden, und die dritte Säule enthält Zellen, die in 60 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden.

Der Einfachheit halber werden hier nur zwei Osmolite im Fokus. Eine grafische Darstellung der CFU-Daten der Platten und Persisterfraktionen der in 96 Well-Platten getesteten Zellkulturen ist hier dargestellt. Um die Fraktionen zu berechnen, wurden die Persisterzahlen auf die vor der Antibiotikabehandlung erhaltenen Zellzahlen normalisiert.

Um byphasische Tötungskurven zu erzeugen, wurden die Zellen in 25 Millilitern modifiziertem LB-Medium mit den angegebenen Osmomiten und verblüfften Kolben für 24 Stunden kultiviert und dann zur Persister-Enumeration in Persister-Assay-Kolben überführt. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass das Erkennen der Zellen auf der Agarplatte arbeitsintensiv ist und Konzentration erfordert. Ein Fehler während des Schritts kann zu einer Kreuzkontamination zwischen den zu testenden Bedingungen führen.

Daher ist es wichtig, vor dem Experiment zu üben, mehrere Proben gleichzeitig zu erkennen. Nach diesem Protokoll können Wirkstoffpanels und mutierte Zellbibliotheken untersucht werden, um die Auswirkungen auf die Persistenz zu untersuchen. Mit diesem Screening haben wir eine Reihe von Osmomiten und PS-Zuständen identifiziert, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.