Name: Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Lernen Sie die Isolierung adipogener und fibro-inflammatorischer Stromazell-Subpopulationen aus murinem intraabdominalem Fettgewebe mittels FACS oder immunomagnetischer Bead-Separation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung funktionell und molekular unterschiedlicher Zelltypen.

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Die Autoren danken Lisa Hansen und Kirsten Vestergaard für die hervorragende technische Unterstützung sowie P. Scherer, N. Joffin und C. Crewe für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Autoren danken dem UTSW Flow Cytometry Core für die hervorragende Anleitung und Unterstützung bei der Entwicklung der hier beschriebenen Protokolle. R.K.G. wird von NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 und NIDDK R01 DK119163 unterstützt. J.P. wird durch einen Pre-Doctoral Award des Innovation Fund Denmark gesponsert.

Alle Tierprotokolle und -verfahren wurden vom Institutional Animal Use and Care Committee des Southwestern Medical Center der University of Texas genehmigt.
1. Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus gonadalem weißem Fettgewebe
<ol><li>Präparieren Sie das gonadale weiße Fettgewebe von 6-8 Wochen alten Mäusen und legen Sie die Fettpolster in 1x PBS-Lösung.</li>
	<li>Kombinieren Sie bis zu 4 Fettdepots (2-4 Depots von 1-2 Mäusen empfohlen) und zerkleinern Sie das Gewebe in einem 10 mL Becherglas mit 200 μl Verdauungspuffer (1x HBSS, 1,5% BSA und 1 mg/mL Kollagenase D).</li>
	<li>Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 mL Verdauungspuffer.</li>
	<li>Die Mischung bei 37 °C im Wasserbad 1 h lang unter Schütteln inkubieren.</li>
	<li>Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zellsieb, um unverdautes Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Die filtrierte Probe mit PBS mit 2 % FBS auf 30 mL verdünnen und 5 min bei 4 °C bei 600 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand, der reife Adipozyten enthält.</li>
	<li>Fahren Sie sofort mit der bevorzugten Zellisolationsmethode fort.</li>
</ol>2. Isolierung von APCs und FIPs mittels FACS
<ol><li>Lösen Sie das Pellet in 1 mL 1x RBC-Lysepuffer auf, indem Sie das Röhrchen leicht schütteln.</li>
	<li>1-2 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>10 ml 2 % FBS/PBS zugeben und durch ein 40-μm-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 400-800 μl 2 % FBS/PBS, das den Fc-Block (1:200) enthält.</li>
	<li>Bei 4 °C 10 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 400 μl bis 800 μl Zellsuspensionen mit ≤106 Zellen pro ml auf 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind im Abschnitt Materialtabelle aufgeführt.<ol><li>Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen (Fluoreszenz minus eins) vor.</li>
		<li>Färben Sie die Proben mit PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C Antikörpern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Medien aspirieren und Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS resuspendieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl mit 2 % FBS/PBS. Führen Sie sie dann durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte für das Gating aus.<ol><li>Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.</li>
		<li>Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die in Abbildung 1 gezeigte Gating-Strategie, um APCs und FIPs zu erhalten. Gate APCs als CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- und FIPs als CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ Zellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie sortierte Zellen in Röhrchen mit 500 μl 100 % Serum und halten Sie die Zellen auf Eis.</li>
	<li>Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Fügen Sie 2% FBS/PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, indem Sie erneut bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, verwenden Sie die pelletierten Zellen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in dem entsprechenden Volumen des gonadalen APC-Kulturmediums (für die Zellkultur) oder einem geeigneten Puffer für die anschließende Analyse.</li>
</ol>3. Immunomagnetische Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen
<ol><li>Isolieren Sie SVF aus gonadalem weißem Fettgewebe gemäß den Schritten 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das SVF-Pellet in 10 mL 1x handelsüblichem MS-Puffer.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 μl 1x MS-Puffer.</li>
	<li>Führen Sie die CD31+ - und CD45+ -Zelldepletion wie unten beschrieben durch (Abbildung 2A, Schritt 1). Dies geschieht, um endotheliale und hämatopoetische Zellen zu entfernen.<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und stellen Sie die Konzentration auf ≤ 1 x 108 Zellen/ml ein.</li>
		<li>Die Biotin-konjugierten CD31- und CD45-Antikörper in der Zellsuspension jeweils in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 106 Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS Puffer.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Den Überstand aspirieren und das Pellet mit 100 μl 1x MS-Puffer resuspendieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 μl Streptavidin-Nanokügelchen hinzu und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS-Puffer.</li>
		<li>Bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand ansaugen.</li>
		<li>Die Zellen werden in 2,5 mL 1x MS-Puffer resuspendiert und in ein 5 mL Polypropylen-Röhrchen überführt.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr für 5 Minuten in das Magnetgestell.</li>
		<li>Sammeln Sie unmarkierte Zellen, indem Sie die Zellsuspension in ein sauberes 15-ml-Zentrifugenröhrchen gießen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Schütteln oder Abtupfen von hängenden Tröpfchen, da dies zu einer Kontamination durch unerwünschte Zellfraktionen führt.</li>
		<li>Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und wiederholen Sie die Schritte 3.6.9. bis 3.6.11. Zwei weitere Male für insgesamt 3 Wäschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen (Abbildung 2A, Schritt 2)<ol><li>Arbeiten Sie weiter mit der unmarkierten Fraktion (z. B. CD45-CD31-Fraktion).</li>
		<li>Das 15-ml-Röhrchen mit den unmarkierten Zellen wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 600 x g zentrifugiert.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl 1x MS-Puffer.</li>
		<li>Biotin-konjugierte LY6C- bzw. CD9-Antikörper in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 106 Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 3.6.3 aus. bis 3.6.12. , um die zweite Trennung abzuschließen.</li>
		<li>Sammeln Sie ungebundene Fraktionen. Unmarkierte Zellen (LY6C-CD9-) stellen eine adipogene Fraktion dar, die APCs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).</li>
		<li>Röhrchen aus dem Magneten nehmen, gebundene Zellen resuspendieren und in 1x MS-Puffer eluieren. Eluate oder markierte Fraktion (LY6C+ CD9+) stellt eine nicht-adipogene Fraktion dar, die FIPs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie markierte und unmarkierte Fraktionen bei 600 x g für 5 min und pelletieren Sie die Zellen bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Fahren Sie sofort mit der Zellkultur fort (Schritt 6) oder verwenden Sie undifferenzierte Vorläufer für bevorzugte Analysen (Schritt 4 und/oder Schritt 5).</li>
</ol>4. Bewertung der Reinheit von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Resuspendieren Sie bead-isolierte Zellfraktionen in 200-400 μl 2 % FBS/PBS mit Fc-Block (1:200).</li>
	<li>Bei 4 °C 10 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt.<ol><li>Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen vor.</li>
		<li>Fügen Sie den Proben CD45-, CD31-, CD9- und LY6C-Antikörper hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Bei 600 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Überstand aspirieren und resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS.</li>
	<li>Die Suspension bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl 2 % FBS/PBS. Filtern Sie durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für die Analyse durch Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung der Reinheit<ol><li>Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.</li>
		<li>Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die Gating-Strategie für aktive Zellen und einzelne Zellen, wie in Abbildung 2B gezeigt.</li>
		<li>Führen Sie das Gating wie in Abbildung 2B für CD45, CD31, LY6C und CD9 dargestellt durch.</li>
		<li>Verwenden Sie Durchflusszytometrie-Software, um die Häufigkeiten von CD45-, CD31-, LY6C-, CD9-Zellen (APCs) und CD45-CD31-LY6C+-Zellen (FIPs) innerhalb isolierter Fraktionen zu bewerten.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR zur Beurteilung der Reinheit von FIPs und APCs
<ol><li>Extrahieren Sie mRNA aus magnetisch oder FACS-isolierten Zellen mit einem handelsüblichen Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Verwenden Sie 1 μg RNA zur Synthese von cDNA mit einem cDNA-Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle), indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.</li>
	<li>Bestimmung der relativen mRNA-Spiegel von APC- und FIPs-selektiven Genen (Tabelle 1) durch quantitative PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mix.<ol><li>Richten Sie die Probenreaktion für die PCR wie folgt ein: 5 μl 2x SYBR grüner Farbstoff, 1 μl cDNA (~50 ng/ μL), 0,5 μl jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers (10 μM) und 3 μl Wasser.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Standard-PCR-Bedingungen für den quantitativen PCR-Lauf: Haltephase: 50 °C für 2 Minuten, 95 °C für 10 Minuten; PCR-Stufe (40 Zyklen): 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalisieren Sie die Werte auf die Werte des Haushaltsgens (Rps18), indem Sie ΔΔ-Ct berechnen.</li>
	<li>Um die statistische Signifikanz zu bewerten, führen Sie den ungepaarten Student's t-Test durch.</li>
</ol>6. Zellkultur und Differenzierung
<ol><li>Zentrifugieren Sie magnetisch oder FACS-isolierte Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl gonadalem APC-Kulturmedium und plattieren Sie 40 K Zellen/Well aus jeder Fraktion in einer 48-Well-Kulturplatte.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 1-2 Tage. APCs beginnen, sich in Adipozyten zu differenzieren, wenn sie sich der Konfluenz nähern. FIPs, die in denselben Medien aufbewahrt werden, sind resistent gegen Adipogenese.</li>
</ol>

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<li>Vijay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+adipose+tissue+identifies+depot+and+disease+specific+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types.</a> Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).</li>
</ol>

T.A.P. ist Mitarbeiter und Anteilseigner von Novo Nordisk A/S

Der C57BL/6-Stamm von Mäusen ist der am häufigsten verwendete Mausstamm in Studien zu ernährungsbedingter Adipositas. C57BL/6-Mäuse nehmen schnell an Gewicht zu, wenn sie auf eine fettreiche Diät (HFD) gesetzt werden, und entwickeln einige der herausragenden Merkmale des metabolischen Syndroms, die mit Fettleibigkeit verbunden sind (z. B. Insulinresistenz und Hyperlipidämie). Bemerkenswert ist, dass die WAT-Expansion, die in Verbindung mit der Fütterung mit fettreicher Diät (HFD) auftritt, depotspezifisch auftritt 19,20,...

Weißes Fettgewebe (WAT) stellt die Hauptstelle für die Energiespeicherung bei Säugetieren dar. In diesem Gewebe speichern Adipozyten oder "Fettzellen" überschüssige Kalorien in Form von Triglyceriden, die in großen unilokulären Lipidtröpfchen verpackt sind. Darüber hinaus sezernieren Adipozyten eine Vielzahl von Faktoren, die verschiedene Aspekte der Energiehomöostase regulieren 1,2,3. Adipozyten machen den Großteil des WAT-Volumens aus; Adipozyten machen jedoch nur weniger als 50 % der Gesamtzellen aus, die in WAT 4,5 gefunden werden. Das nicht-adipozyten-Kompartiment der WAT oder stromal-vaskulären Fraktion (SVF) ist recht heterogen und enthält vaskuläre Endothelzellen, geweberesidente Immunzellen, Fibroblasten und Adipozyten-Vorläuferzellpopulationen (APC).
WAT ist außergewöhnlich in seiner bemerkenswerten Fähigkeit, mit steigender Nachfrage nach Energiespeichern zu expandieren. Die Aufrechterhaltung dieser Gewebeplastizität ist von entscheidender Bedeutung, da eine angemessene Speicherung von Lipiden in WAT vor schädlicher ektopischer Lipidablagerung in Nicht-Fettgewebe schützt6. Die Art und Weise, wie die einzelnen WAT-Depots diese Expansion als Reaktion auf einen Kalorienüberschuss erfahren, ist eine kritische Determinante für die Insulinsensitivität bei Fettleibigkeit7. Die pathologische WAT-Expansion, die bei adipösen Personen mit metabolischem Syndrom beobachtet wird, ist durch eine bevorzugte Expansion der viszeralen WAT-Depots auf Kosten des metabolisch günstigen subkutanen Fettgewebes gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die Insulinresistenz bei Adipositas mit einem pathologischen Umbau der WAT verbunden. Dies ist gekennzeichnet durch hypertrophes Wachstum der vorhandenen Adipozyten (Vergrößerung), unzureichende Angiogenese, chronische metabolische Entzündung, Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten (Fibrose) und Gewebehypoxie 8,9. Diese WAT-Phänotypen der Adipositas sind mit Lebersteatose und Insulinresistenz verbunden, ähnlich wie bei der Lipodystrophie (Fehlen einer funktionellen WAT). Im Gegensatz dazu wird eine gesunde WAT-Expansion in der metabolisch gesunden adipösen Population beobachtet und ist durch eine bevorzugte Expansion der protektiven subkutanen WAT und eine Depotexpansion durch Adipozytenhyperplasie gekennzeichnet10. Die Rekrutierung neuer Adipozyten wird durch die De-novo-Differenzierung von Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) (als "Adipogenese" bezeichnet) vermittelt. Die Adipozytenhyperplasie fällt mit einem relativ niedrigeren Grad der WAT-Fibrose und der metabolischen Entzündung zusammen 6,11. Eine Vielzahl von Zelltypen innerhalb der WAT-Mikroumgebung beeinflussen direkt die Gesundheit und Erweiterbarkeit von WAT bei Adipositas12. Daher hat die Definition der Funktion der verschiedenen Zelltypen, die in WAT vorhanden sind, nach wie vor eine hohe Priorität für das Feld.
In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um native APCs aus Mensch und Maus zu definieren und zu isolieren WATSVF 13. Bei solchen Strategien werden APCs basierend auf der Zelloberflächenexpression gemeinsamer mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellmarker unter Verwendung von Antikörper-basierten Zelltrennungstechniken isoliert. Zu diesen Ansätzen gehören die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit fluorophormarkierten Antikörpern oder die immunomagnetische Bead-Trennung (d. h. chemisch modifizierte Antikörper). Zu den Zelloberflächenproteinen, die für die Isolierung von APCs vorgesehen sind, gehören PDGFRα, PDGFRβ, CD34 und SCA-1. Diese Ansätze haben dazu beigetragen, APCs zu bereichern; Die Zellpopulationen, die auf der Grundlage dieser Marker isoliert werden, sind jedoch recht heterogen. Jüngste Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) haben die molekulare und funktionelle Heterogenität von Stromazellen innerhalb der isolierten stromal-vaskulären Fraktion (SVF) der murinen WAT 14,15,16,17 hervorgehoben. Aus unseren eigenen scRNA-seq- und funktionellen Analysen haben wir funktionell unterschiedliche immunmodulierende und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen im stromalen Kompartiment von intraabdominalen WAT bei adulten Mäusen identifiziert und charakterisiert15. Fibroinflammatorische Vorläufer (FIPs) stellen eine prominente Subpopulation von PDGFRβ+-Zellen dar und können auf der Grundlage der LY6C-Expression (LY6C+ PDGFRβ+-Zellen) isoliert werden15. FIPs fehlt es an adipogener Kapazität, sie üben eine starke entzündungsfördernde Reaktion auf verschiedene Reize aus, produzieren Kollagen und sezernieren anti-adipogene Faktoren15. Die proinflammatorische und fibrogene Aktivität dieser Zellen nimmt in Verbindung mit Fettleibigkeit bei Mäusen zu, was diese Zellen als Regulatoren des WAT-Umbaus impliziert. Die LY6C-CD9-PDGFRβ+-Subpopulation repräsentiert Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs). Diese APCs sind in der Expression von Pparg und anderen pro-adipogenen Genen angereichert und differenzieren sich in vitro und in vivo leicht zu reifenAdipozyten 15. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung dieser unterschiedlichen Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse unter Verwendung von FACS und die immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern zur Verfügung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um funktionell unterschiedliche Fettvorläufer-Subpopulationen aus mehreren intraabdominalen WAT-Depots von adulten männlichen und weiblichen Mäusen zu isolieren15. Die isolierte Untersuchung dieser funktionell unterschiedlichen Zellpopulationen kann wesentlich zu unserem aktuellen Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, die die Adipogenese und den Umbau des intraabdominalen Fettgewebes bei Gesundheit und Krankheit regulieren.
Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von adipösen Vorläuferzellen aus murinen Nebenhoden-WAT; Das gleiche Verfahren kann jedoch verwendet werden, um entsprechende Zellen aus dem mesenterialen und retroperitonealen WAT-Depot sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse zu isolieren15. Ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung und Isolierung dieser Depots bei Mäusen findet sich in Bagchi et al.18. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung von Mäusen im Alter von 6-8 Wochen optimiert. Die Häufigkeit und Differenzierungsfähigkeit von APCs kann im Zusammenhang mit dem Altern abnehmen.

<table><tbody><tr><td>Mechanische Gewebevorbereitung und SVF-Isolierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 und 100 &micro; m Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufschlusspuffer (für 10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg Kollagenase D (1 mg/ml final cc.)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0,15 g BSA (1,5 % final cc.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunomagnetische Trennung von APCs und Nicht-APCs</td>5X MojoSort Puffer (MS-Puffer<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Magnet (MS-Magnet)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purity Check und FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Lysepuffer für rote Blutkörperchen</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block (Maus CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Konzentration: &le; 0,25 &micro; g pro 10^6 Zellen Spezies: Maus Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotin CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Konzentration: &le; 0,25 &micro; g pro 10^6 Zellen Spezies: Maus Klon: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotin CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Konzentration: &le; 0,25 &micro; g pro 10^6 Zellen Spezies: Maus Klon: MZ3</td></tr><tr><td>Biotin LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Konzentration: &le; 0,25 &micro; g pro 10^6 Zellen Spezies: Maus Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>Konzentration: Verdünnung 1:400 Spezies: Maus Klon: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Konzentration: Verdünnung 1:400 Spezies: Maus Klon: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Konzentration: Verdünnung 1:50 Spezies: Maus Klon: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Konzentration: Verdünnung 1:400 Spezies: Maus Klon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend 124808</td><td></td><td>Konzentration: Verdünnung 1:400 Spezies: Maus Klon: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur und Differenzierung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Gonaden-APC-Nährmedien (für 500 ml)</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM mit 1 g/l Glukose</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Fötales Rinderserum (FBS)** Lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS Premix</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-Ascorbinsäure-2-2phosphat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 & Mikro; L 100 g/ml FGF-basic</td><td>R& D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 & Mikro; L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**HINWEIS: Die adipogene Kapazität von primären APCs kann von Charge zu Charge kommerzieller FBS variieren. Es sollten mehrere Chargen/Quellen von FBS getestet werden.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen stromazell-subpopulationen aus murinen intraabdominalen fettdepots

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Die stroma-vaskuläre Fraktion (SVF) des weißen Fettgewebes (WAT) ist bemerkenswert heterogen und besteht aus zahlreichen Zelltypen, die funktionell zur Expansion und zum Umbau von WAT im Erwachsenenalter beitragen. Ein enormes Hindernis für die Untersuchung der Auswirkungen dieser zellulären Heterogenität ist die Unfähigkeit, funktionell unterschiedliche Zellsubpopulationen aus WAT SVF für in vitro- und in vivo-Analysen zu isolieren. Die Einzelzellsequenzierungstechnologie hat kürzlich funktionell unterschiedliche fibroinflammatorische und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen in intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse identifiziert. Fibroinflammatorische Vorläuferzellen (als "FIPs" bezeichnet) sind nicht-adipogene Kollagen produzierende Zellen, die einen entzündungsfördernden Phänotyp ausüben können. PDGFRβ+ Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) sind sowohl in vitro als auch in vivo nach Zelltransplantation stark adipogen. In dieser Arbeit beschreiben wir mehrere Methoden zur Isolierung dieser stromalen Zell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen WAT-Depots. FIPs und APCs können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder durch Nutzung der auf biotinylierten Antikörpern basierenden immunomagnetischen Bead-Technologie isoliert werden. Isolierte Zellen können für molekulare und funktionelle Analysen verwendet werden. Die isolierte Untersuchung der funktionellen Eigenschaften der Stromazell-Subpopulation wird unser aktuelles Wissen über den Umbau von Fettgewebe unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen auf zellulärer Ebene erweitern.

Dieses Protokoll beschreibt zwei Strategien, die die Isolierung unterschiedlicher stromaler Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse ermöglichen. APCs und FIPs können durch FACS (Abbildung 1) oder immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern (Abbildung 2) isoliert werden. Bei beiden Ansätzen werden Reagenzien und Antikörper verwendet, die alle kommerziell erhältlich sind. Die immunomagnetische Kügelchentrennung führt zur Tr...

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Das Protokoll ermöglicht es den Forschern, funktionell und molekular unterschiedliche Subpopulationen von perigonadalen Stromazellen aus weißem Fettgewebe aus Mausmodellen von Interesse zu isolieren. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Werkzeuge und Reagenzien weit verbreitet sind. Lavanya Vishvanath, ein leitender Laboranalytiker aus dem Labor von Dr. Rana Gupta, wird das Verfahren vorführen.Nach der Isolierung von stromalen Gefäßzellen aus gonadalem weißem Fettgewebe (WAT) resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen für eine ein- bis zweiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Lyse mit 10 Millilitern 2%FBS und PBS und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 400 bis 800 Mikrolitern FBS und PBS, ergänzt mit einem FC-Block.Nach einer 10-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius werden 400 bis 800 Mikroliter Zellen in die entsprechende Anzahl von Röhrchen für die fluoreszenzkonjugierte Antikörperfärbung überführt und die Zellen 15 Minuten lang unter Lichtschutz bei vier Grad Celsius mit den interessierenden Kontroll- und experimentellen Antikörpern markiert. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen die Zellen in 400 Mikrolitern frischem FBS und PBS pro Röhrchen. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Pellets in 400 bis 800 Mikrolitern frischem FBS und PBS pro Röhrchen und filtrieren Sie die Zellen durch 40-Mikron-Filterkappen in fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS.Setzen Sie die Kompensations- und experimentellen Gates, um die antigenpräsentierenden Zellen und fibroinflammatorischen Vorläuferzellen zu erhalten. Nach der Zellsortierung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und gewaschen und die Pellets in 500 Mikrolitern gonadenantigenpräsentierendem Zellkulturmedium pro Fraktion resuspendiert. Für die immunmagnetische Bead-Trennung der adipogenen und nicht-adipogenen Zellfraktionen resuspendieren Sie das stromale Gefäßpellet in 10 Millilitern MS-Puffer und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb.Nach der Zählung werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und die Zellen bei nicht mehr als eins mal 10 bis zu einem Achtel Zellen pro Milliliter MS-Pufferkonzentration resuspendiert. Geben Sie anschließend nicht mehr als 0,25 Gramm anti-CD31- und anti-CD45-Biotin-konjugierte Antikörper pro mal zehn zu den sechs Zellen für eine 15-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation in vier Millilitern MS-Puffer und resuspendieren das Pellet in 100 Mikrolitern frischem MS-Puffer.Geben Sie 10 Mikroliter Streptavidin-Nanokügelchen in die Zellen für eine 15-minütige Inkubation auf Eis, gefolgt von einer weiteren Wäsche in vier Millilitern MS-Puffer. Resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Millilitern frischem MS-Puffer und geben Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf einen Magneten, bevor Sie die unmarkierten Zellen in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen.Wiederholen Sie den Waschvorgang wie gezeigt noch zwei weitere Male, ziehen Sie die unmarkierten Zellen nach jedem Waschen und sammeln Sie die endothelialen und hämatopoetischen Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern MS-Puffer und markieren Sie die Zellen mit nicht mehr als 0,25 Mikrogramm Ly6C- und CD-9-Antikörpern pro einmal 10 der sechsten Zellen für 15 Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die ungebundenen Ly6C-negativen CD-9-negativen adipogenen Zellen, wie gerade gezeigt, bevor Sie die Ly6C-positiven nicht-adipogenen Zellen sammeln.Sammeln Sie dann beide Zellpopulationen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern gonadischem Antigen-präsentierendem Zellkulturmedium pro Fraktion. Um Zellkulturen für die Differenzierung einzurichten, plattieren Sie jede Fraktion mit viermal 10 der vierten Zellen pro Well in Konzentration in einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Kulturplatte und legen Sie die Platten für sieben bis 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator. Die Adipozyten-Vorläuferzellen beginnen, sich in Adipozyten zu differenzieren, wenn sie sich der Konfluenz nähern, während die Fibroin-Entzündungsvorläuferzellen resistent gegen eine Adipogenese sind.Mit Hilfe dieses Protokolls können unterschiedliche Stromazellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse durch FACS- oder immunomagnetische Kügelchentrennung isoliert werden, wie gezeigt. Mit der immunmagnetischen Bead-Trennung können adipogene und nicht-adipogene Zellen aus der gonadalen WATT-Stroma-Gefäßfraktion isoliert werden. Wie durch die Durchflusszytometrie beobachtet, sind 75 % der Zellen innerhalb der adipogenen Fraktion Ly6C-negative CD-9-negative Adipozyten-Vorläuferzellen, während über 75 % der nicht-adipogenen Fraktion Ly6C-positive fibroinflammatorische Vorläuferzellen sind.Adipozyten-Vorläuferzellen, die auf beiden Methoden isoliert wurden, differenzieren sich innerhalb von sieben bis 10 Tagen nach der Beschichtung zu lipidhaltigen Adipozyten mit hoher Reinheit. Im Gegensatz dazu bleiben nicht-adipogene Vorläufer fibroblastenartig und werden unter den gleichen Kulturbedingungen nicht zu Adipozyten. Das Protokoll dient zur Isolierung von adipogenen und fibroinflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus perigonadalem weißem Fettgewebe.Ähnliche Zellpopulationen finden sich in anderen Fettdepots von Mäusen. Ihre Auswahl wird jedoch von der Verwendung verschiedener Antikörper abhängen. Die durch FACS und magnetische Trennung isolierten Zellpopulationen können für in vitro Assays zur Zelldifferenzierung verwendet oder durch Genexpressionsanalysen weiter charakterisiert werden.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir stellen die Techniken vor, die zur Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus inguinalen (subkutanen) und perigonadalen (viszeralen) Fettgewebsdepots der Maus erforderlich sind, um ihre Genexpression und kollagenolytische Aktivität zu beurteilen. Diese Methode umfasst die Anreicherung von Sca1-Stammzellen (ASCs) mithohem Fettgehalt durch immunomagnetische Zelltrennung.

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch &gt;90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.

Effiziente Isolierung von fett-abgeleiteten Stammzellen und Adipozyten aus schweine-fetthaltigem Gewebe

Lernen Sie die Isolierung adipogener und fibro-inflammatorischer Stromazell-Subpopulationen aus murinem intraabdominalem Fettgewebe mittels FACS oder immunomagnetischer Bead-Separation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung funktionell und molekular unterschiedlicher Zelltypen.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

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