Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Dieser Artikel beschreibt ein halbautomatisches, mikroskaliertes ChIP-Seq-Protokoll von DNA-Regionen, die mit einer spezifischen Histonmodifikation (H3K27ac) unter Verwendung einer ChIP-Liquid-Handler-Plattform assoziiert sind, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung mittels Tagmentation. Das Verfahren umfasst eine Kontrollbewertung für Qualitäts- und Quantitätszwecke und kann auf andere Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren angewendet werden.

Dieses Protokoll ist insofern von Bedeutung, als es eine Hochdurchsatz-ChIP-Seq-Analyse von Primärproben ermöglicht, um die cis-regulatorischen Mechanismen und ihre Auswirkungen auf die Krankheit besser zu verstehen. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Reproduzierbarkeit der Daten und die drastische Reduzierung der praktischen Laborzeit. Für die Chromatinscherung fügen Sie 70 Mikroliter frischen, vollständigen Lysepuffer bei Raumtemperatur zu einem Glycin-fixierten, schockgefrorenen und aufgetauten Zellpellet von Interesse hinzu, für eine einminütige Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von einer einminütigen Resuspension ohne Blasen.

Inkubieren Sie die Probe eine weitere Minute lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Zellen auf Eis legen. Übertragen Sie das resuspendierte Pellet in ein 0,65-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung auf Eis, bevor Sie das Röhrchen auf den Röhrchenhalter eines Ultraschallgeräts laden. Füllen Sie alle Lücken mit Waagenröhrchen mit 70 Mikrolitern Wasser und lassen Sie die Zellen etwa eine Minute lang im Wasserbad stabilisieren, bevor Sie mit der Beschallung beginnen.

Nehmen Sie nach drei Zyklen die Proben aus dem Ultraschallgerät, um sie sanft zu wirbeln, und drehen Sie die Röhrchen, bevor Sie sie wieder in den Halter einsetzen. Für die Histonmodifikation fügen Sie 100 Mikroliter vollständigen tC1-Puffer zu jedem Röhrchen mit zwei Chip-Achtröhrchenstreifen hinzu und überführen Sie 20 Mikroliter von jeder der 16 gemeinsam genutzten Chromatinproben in einzelne Röhrchen der Chip-Achtröhrchenstreifen. Waschen Sie die Chromatinröhrchen mit 80 Mikrolitern vollständigem tC1-Puffer und poolen Sie die Waschungen in den entsprechenden Röhrchen der Chip-Achtröhrchenstreifen, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern Lösung pro Röhrchen zu erhalten.

Geben Sie das entsprechende Volumen des Antikörpers zu 500 Mikrolitern TBW1-Puffer und wirbeln Sie schnell vor und pulsieren Sie. Geben Sie dann 70 Mikroliter tBW1 und 30 Mikroliter Antikörperlösung in jedes Röhrchen eines neuen Chipstreifens mit acht Röhrchen. Als nächstes wird ein Behälter mit Protein-A-Bead-Lösung gründlich vortexen und fünf Mikroliter Beads pro 0,5 Mikrogramm Antikörper in einen neuen Röhrchenstreifen gegeben.

Schleudern Sie den Streifen mit den Perlen und füllen Sie die letzte Reihe des Chip-Liquid-Handlers mit beschrifteten, leeren Streifen mit acht Chips. Befolgen Sie dann die Programmvorgaben des Chips 16-I pure 200 D für die Platzierung der restlichen Streifen und laden Sie die Puffer in die richtigen Positionen. Nach der Sequenzierung fangen Sie die Kügelchen in einem Streifenmagneten mit acht Röhrchen ein und übertragen Sie 25 Mikroliter Tagmentationspuffer auf jedes Röhrchen.

Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Magneten genommen haben, mischen Sie vorsichtig, bis die Raupenlösungen homogen sind, bevor Sie die wieder verschlossenen Röhrchen für drei Minuten in einen vorgeheizten ThermoMixer geben. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Chip-Acht-Röhrchen-Streifen in der letzten Reihe des Chip-Liquid-Handlers und fügen Sie jeder Probe zwei Mikroliter Rnase A hinzu. Dann die neu verschlossenen Röhrchen pulsierend drehen und vorsichtig mischen, bis die Bead-Lösungen homogen sind.

Für eine Aufreinigung der markierten DNA-Fragmente werden 100 Mikroliter der D-vernetzten DNA-Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und die Röhrchen mit 100 Mikrolitern DNA-Bindungspuffer pro Röhrchen gewaschen. Die Waschgänge werden in den entsprechenden Röhrchen gepulst und die Proben auf Säulen geladen. Setzen Sie die Säulen in neue 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen ein und geben Sie neun Mikroliter 55 Grad Celsius Tris-EDTA-Puffer direkt in die Säulenmatrizen.

Nach einer Minute zentrifugieren Sie die Säulen und überführen die neun Mikroliter Eluat aus jeder Säule in einen neuen Streifen mit acht Röhrchen auf Eis. Eluieren Sie die DNA-Fragmente erneut wie gezeigt, jedoch mit acht Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer, und poolen Sie das Eluat mit der zuvor geernteten DNA-Fragmentlösung. Um die gereinigten DNA-Fragmentproben zu amplifizieren, mischen Sie die Proben mit einer Mehrkanalpipette und führen Sie ein Amplifikationsprogramm mit der entsprechenden Anzahl von Zyklen durch.

Verwenden Sie nach der Verstärkung einen Plattenmagneten, um die Kügelchen einzufangen, und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 Mikrolitern frischem 80%igem Ethanol pro Waschgang, ohne das Kügelchen zu beschädigen. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und lassen Sie die Kügelchen 10 Minuten lang trocknen oder bis Risse in den Kügelpellets auftreten.

Geben Sie 40 Mikroliter vorgewärmtes Wasser zu jeder getrockneten Probe und verschließen Sie die Platte, bevor Sie sie gründlich vortexen und kurz pulsieren. Quantifizieren Sie dann die DNA mit einem Fluoreszenz-quantifizierenden Assay gemäß Standardprotokollen. Messungen der Größe von gescherten Chromatinfragmenten zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit, wobei mehr als 70 % der Proben zwischen 100 und 500 Basenpaare über 14 Zyklen beobachtet wurden.

Wie dargestellt, ist der Zyklus, bei dem die Intensität der markierten Probe die Hälfte des durchschnittlichen Maximums beträgt, optimal für die Zyklusbestimmung. Die besten Sequenzierungsdaten werden erhalten, wenn mehr als 85 % der DNA-Fragmente zwischen 200 und 1000 Basenpaare liegen. In diesen repräsentativen Anreicherungsspuren für vier Genloci zeigen die einzelnen Spuren für jede Probe eine hohe Kartierungsqualität und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis.

Die ersten beiden Loci beherbergen gut exprimierte Gene in diesen Zelltypen, während die Gene in den letzten beiden Loci nicht exprimiert werden und als Hintergrundkontrolle dienen. Für die Mehrzahl der paarweisen Vergleiche zeigen die Pearson-Korrelationsindizes eine Korrelation von mehr als 90%, was auf ein hohes Maß an Konsistenz zwischen den biologischen Replikaten hindeutet. Während zelltypspezifische Loci in den entsprechenden Zellen eine hohe Anreicherung aufweisen, zeigt ein Housekeeping-Gen eine sehr konsistente Histonmodifikation.

Korrelationsanalysen zwischen ChIP-Seq-Datensätzen, die aus Proben mit weniger als 100.000 Zellen durchgeführt wurden, zeigen immer noch eine hohe Reproduzierbarkeit und Korrelation bis hinunter zu 10.000 Zellen. Es gibt jedoch einen erhöhten Hintergrund, da die Zellzahlen reduziert werden, sowie eine Abnahme ihrer Korrelationskoeffizienten. Die richtige Lyse der Zellen ist für die Generierung qualitativ hochwertiger Daten unerlässlich, da wir festgestellt haben, dass eine unvollständige Zelllyse den Rest des Protokolls beeinflusst.

Mit dieser Methode können viele verschiedene Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren an verschiedenen Zelltypen getestet werden, um unser Verständnis von cis-regulatorischen Elementen zu verbessern.