Photodiodenbasierte optische Bildgebung zur Aufzeichnung der Netzwerkdynamik mit Einzelneuronauflösung bei nicht-transgenen Wirbellosen

Dieser Artikel enthält eine detaillierte Beschreibung, wie ein Photodiodenarray und spannungsempfindliche Farbstoffe verwendet werden, um Aktionspotentiale von einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig aufzuzeichnen. Im Vergleich zur Kalziumbildgebung der neuronalen Aktivität, die indirekt ist, zeichnen die spannungsempfindlichen Farbstoffe, die wir verwenden, Aktionspotentiale direkt auf, ähnlich wie scharfe Elektrodenaufzeichnungen, jedoch über viele Neuronen gleichzeitig. Unser optischer Bildgebungs-Workflow kann angepasst werden, um die Netzwerkaktivität mit einer Auflösung von einzelnen Neuronen und Einzelaktionspotentialen in einer Vielzahl von nicht-transgenen Wirbellosen- und sogar Wirbeltiersystemen schnell sichtbar zu machen.

Darüber hinaus wird Evan Hill aus meinem Labor die Verfahren in unserem Protokoll demonstrieren. Beginnen Sie damit, ein 40 Gramm schweres Tier von Aplysia californica zu betäuben und es mit der Bauchseite nach oben in eine mit Wachs ausgekleidete Sezierschale zu stecken. Machen Sie mit einer Präparierschere einen zwei bis drei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie entlang der vordersten Ausdehnung des Fußes und stecken Sie die Flügel des Fußes auf beiden Seiten des Schnitts fest, um einen Teil des Zentralnervensystems und der bukkalen Masse freizulegen.

Verwenden Sie eine Pinzette und eine Präparierschere, um die bukkale Masse vorsichtig zu präparieren, wodurch die Hirnganglien freigelegt werden, und durchtrennen Sie die Nerven, die den Körper des Tieres innervieren, um das Zentralnervensystem herauszuschneiden, so dass ein großer Teil des Nervs stimuliert werden muss. Verwenden Sie winzige Stifte, um das Zentralnervensystem in einer mit Kochsalzlösung gefüllten, mit Elastomer ausgekleideten Schale zu positionieren, und perfundieren Sie die Schale mit Kochsalzlösung, die durch ein Peltier-Kühlgerät geleitet wird, um die Zubereitungstemperatur auf 15 bis 16 Grad Celsius zu halten. Entfernen Sie mit der Pinzette und der Mikrodissektionsschere überschüssiges Bindegewebe von den Nerven und präparieren Sie einen oberflächlichen Teil der Hülle am Ganglion oder den Ganglien, die abgebildet werden sollen.

Tauchen Sie dann das gereinigte Zentralnervensystem 20 Sekunden lang in eine Lösung von 0,5 % Glutaraldehyd in Kochsalzlösung, bevor Sie das Zentralnervensystem wieder in die mit Kochsalzlösung durchblutete, mit Elastomer ausgekleidete Schale zurückbringen, um überschüssiges Glutaraldehyd abzuspülen. Um eine Arbeitslösung aus spannungsempfindlichem Farbstoff herzustellen, fügen Sie 500 Mikroliter Kochsalzlösung zu einem zuvor hergestellten festen Aliquot von RH 155 hinzu, um eine endgültige Farbstoffkonzentration von 0,3 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Und verwenden Sie einen tragbaren Mikrospender, um 200 Mikroliter Lösung in ein Stück Polyethylenschlauch mit einem ähnlichen Durchmesser wie das zu färbende Ganglion zu füllen.

Platzieren Sie mit einem Mikromanipulator vorsichtig das Ende des Rohrs über dem Zielganglion und senken Sie das Rohr ab, bis es eine feste Abdichtung über dem Ganglion bildet. Drehen Sie den Applikatorknopf des Mikrodispensers eine Stunde lang alle fünf Minuten, um mehr Farbstoff auf das Ganglion zu drücken, und überprüfen Sie die Probe nach 30 Minuten, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Färbung stattfindet. Halten Sie nach dem Färben das Licht gedimmt, platzieren Sie ein geeignetes Puffermaterial links und rechts von der Stelle, an der das Präparat in der salzhaltigen Bildgebungskammer platziert werden soll, und tauchen Sie dann das zentrale Nervensystem in die Kammer ein.

Drücken Sie ein entsprechend großes Stück Deckglas über das Gewebe und drücken Sie fest auf das Deckglas, um das Gewebe abzuflachen, ohne die Neuronen zu beschädigen. Stellen Sie dann die Bildgebungskammer unter ein Präpariermikroskop. Wenn Sie einen Nerv stimulieren, um ein fiktives motorisches Programm auszulösen, schmelzen Sie vorsichtig ein Segment eines PE100-Polyethylenschlauchs über einer Flamme, während Sie vorsichtig an beiden Enden des Schlauchsegments ziehen, und schneiden Sie die resultierende Verjüngung an der gewünschten Stelle ab.

Befestigen Sie als Nächstes ein Stück dickwandigen flexiblen Polymerschlauch am hinteren Ende einer Saugelektrode aus Polyethylen. Erzeugen Sie dann mit einem Mundteil einen Unterdruck und ziehen Sie ein kleines Volumen Kochsalzlösung durch das sich verjüngende Ende der Saugelektrode. Ziehen Sie das Ende des zu stimulierenden Nervs unter dem Mikroskop in die Elektrode und bestätigen Sie, dass die Kochsalzlösung in der Elektrode keine Blasen enthält, die die elektrische Leitung unterbrechen könnten.

Um das Ganglion abzubilden, bewegen Sie die Kammer zum Bildgebungsrigg und leiten Sie die Kochsalzperfusion durch die Aufnahmekammer ein. Platzieren Sie einen Temperaturfühler in der Nähe des Präparats und stellen Sie die Temperatur entsprechend der abzubildenden Spezies ein. Legen Sie einen chloridierten Silberdraht in die Saugelektrode, stellen Sie sicher, dass er die Kochsalzlösung in der Elektrode berührt, und legen Sie einen Silbersilberchloriddraht in die Badesalzlösung in der Nähe der Saugelektrode.

Senken Sie die Wasser-Tauchlinse in die Kochsalzlösung ab und schließen Sie die Basisblende. Heben oder senken Sie den Kondensor der Unterstufe und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Ränder der Blende scharf fokussiert sind, um eine Kohler-Beleuchtung zu erzeugen. Fokussieren Sie sich auf den Bereich des abzubildenden Präparats und machen Sie mit der parfokalen Digitalkamera ein Bild des interessierenden Ganglions.

Stellen Sie den Verstärkungsschalter des Bedienfelds auf 1X und klicken Sie auf die Taste für die Intensität des Ruhelichts, um die durchschnittliche Intensität des Ruhelichts der Dioden zu überprüfen. Stellen Sie den Spannungspegel ein, der von einem Stimulator an die Stromversorgung der LED-Lampe gesendet wird, und überprüfen Sie so lange die durchschnittliche Intensität des Ruhelichts, bis sie im gewünschten Bereich liegt. Stellen Sie dann den Gain-Schalter des Bedienfelds für die Aufnahme auf 100X und überprüfen Sie, ob die Feder oder der Lufttisch schwebt.

Legen Sie bei gedimmtem Licht die Dateidauer, den Pfad und den Namen in der Imaging-Software fest und klicken Sie auf Daten übernehmen, um Dateien bis zur Kapazität des verfügbaren RAM des Computers zu erfassen. Achten Sie darauf, während der Aufnahme ruhig zu bleiben, da kleine Vibrationen große Artefakte in die optischen Aufzeichnungsdaten einbringen können. Um die Daten unmittelbar nach der Erfassung anzuzeigen, verwenden Sie die Überlagerungsfunktion, um die von allen 464 Dioden gesammelten Daten über das Ganglienbild zu legen, und klicken Sie auf eine der in der Software dargestellten Dioden, um die aufgezeichneten Daten auf einem separaten Trace-Bildschirm zu erweitern.

Um eine exakte Ausrichtung der Dioden in Bezug auf die Präparation zu erreichen, geben Sie die X-, Y- und Vergrößerungsfaktoren ein, die durch einen Lochkameratest bestimmt wurden. Um die Sichtbarkeit des Aktionspotenzials zu maximieren und die Ausbeute der Neuronen für die nachfolgende Spike-Sortierung zu verbessern, setzen Sie einen Bandpass-Butterworth-Filter mit fünf und 100 Hertz-Cutoffs ein, um sowohl das niederfrequente als auch das hochfrequente Rauschen zu entfernen. Um die gefilterten optischen Daten als Textdatei für die spätere Analyse zu speichern, wählen Sie auf dem Seitenbildschirm das Feld TP-Filter aus.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Ausgabe" die Option "Seite als ASCII speichern" aus. Geben Sie dann einen entsprechenden Dateinamen in das erscheinende Dialogfeld ein. Der Hautkontakt mit seinem Seestern-Raubtier löst das Fluchtschwimmen von Tritonia diomedia aus, das aus einer rhythmischen Abfolge von Ganzkörperbeugungen besteht, die es in Sicherheit bringen.

In dieser Abbildung sind rohe und gefilterte Daten von 20 Dioden dargestellt, die die Aktivität vor, während und nach der Stimulation des dritten Pedalnervs aufzeichnen. Unmittelbar nach der Erfassung können die von allen 464 Dioden des Aufzeichnungsarrays gemessenen Signale topographisch über einem Bild der Präparation in der Bildgebungssoftware dargestellt werden. In dieser Analyse ergab die Spike-Sortierung der gefilterten Diodenspuren mit unabhängiger Komponentenanalyse (ICA) 53 einzigartige neuronale Spuren, von denen 30 hier gezeigt sind.

Ein stark aversiver Schwanzreiz nach Aplysia californica löst wiederholte Wellen einer zweiteiligen rhythmischen Fluchtreaktion aus, die aus einer Galoppperiode von mehreren Zyklen von Kopfsprüngen und Schwanzziehen, die das Tier schnell vorwärts bewegen, und einer anschließenden Krabbelperiode besteht. In dieser repräsentativen Analyse wurde nach einer Minute einer kontinuierlichen 20-minütigen optischen Aufzeichnung der Pedalnerv neun stimuliert, um die Programmsequenz des Galopp-Kraul-Motors hervorzurufen. Die probabilistischen Gaußschen räumlichen Verteilungen der Signale aller 81 aufgezeichneten Neuronen wurden auf das Ganglion kartiert.

Die Dimensionalitätsreduktion, die auf die vollständige Aufzeichnung angewendet wurde, zeigte, dass die Galopp- und Kriechphasen des Fluchtprogramms unterschiedliche Bereiche einnahmen und unterschiedliche Trajektorien im Hauptkomponentenraum bildeten. Zu den wichtigen Überlegungen bei diesem Protokoll gehören: Optimierung der Färbung, Minimierung von Vibrationen und Lenkung von genügend Licht durch die Präparation zum PDA bei gleichzeitiger Minimierung des Photobleachings des Farbstoffs. Beispiele für Post-Akquisitionsanalysen, die Einblicke in Netzwerke auf Populationsebene lieferten, sind die funktionale Ensemble-Erkennung durch Konsensus-Clustering in unüberwachten Lernalgorithmen und die Dimensionalitätsreduktion mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse.

Die Kombination aus unserem Photodiodenarray-basierten Bildgebungssystem und der Verwendung von absorbierenden spannungsempfindlichen Farbstoffen ermöglicht die Überwachung der dynamischen Netzwerkentwicklung über längere Zeiträume.