Name: Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Erfahren Sie Calcium-Imaging bei frei verhaltendem Caenorhabditis elegans mit kontrollierten, nicht lokalisierten Vibrationen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung neuronaler Calciumströme während Verhaltensantworten.

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Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Stämme. Diese Veröffentlichung wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant Nr. JP18H02483), zu innovativen Bereichen des Projekts "Science of Soft Robot" (Förderkennzeichen JP18H05474), die PRIME der Japan Agency for Medical Research and Development (Fördernummer 19gm6110022h001) und die Shimadzu-Stiftung.

1. Kultivierung von Würmern bis zur Kalziumbildgebung
<ol><li>Übertragen Sie vier Tage vor einem Calcium-Imaging-Experiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf eine neue Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) -Platte (Table of Materials), auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster (ca. 4 mm x 4 mm) mit einem Zellstreuer gestreift sind, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt12.</li>
	<li>Inkubieren Sie diese NGM-Platte für 4 Tage bei 20 °C in einem Inkubator (Table of Materials).</li>
</ol>2. Hardware-Setup
<ol><li>Bereiten Sie ein Mikroskop vor, das mit einem piezoelektrischen Gerät zur Stimulation13, einem 2-fachen Objektiv, einer Hochgeschwindigkeits-sCMOS-Kamera, einer Bildaufteilungsoptik, einem motorisierten X-Y-Tisch, einer LED-Lichtquelle für die Anregung und einem Computer ausgestattet ist (Abbildung 1). Zu den wesentlichen Spezifikationen der sCMOS-Kamera gehören 2560 x 2160 aktive Pixel, 6,5 μm groß, mit einer 10-Tap-Kameraverbindung als Schnittstellenoption. Zu den wichtigsten Spezifikationen der motorisierten X-Y-Stufe gehören ein Verfahrbereich von 110 mm x 75 mm, eine maximale Geschwindigkeit von 250 mm/s, eine maximale Beschleunigung von 2.000 mm/sund eine unidirektionale Wiederholbarkeit von 0,25 μm.</li>
	<li>Schalten Sie den Computer und den motorisierten X-Y-Stagecontroller ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Verstärker ein und stellen Sie den Lautstärkeregler auf 10 und den Bass- und Höhenregler auf 8. </li>
	<li>Um GCaMP und TagRFP anzuregen, schalten Sie die 488 nm und 560 nm Lichter der LED-Lichtquelle ein. Stellen Sie die Messgeräte von 470 nm und 550 nm der Steuerkapsel in der Lichtquelle auf 5% ein, damit die Intensität des LED-Lichts für die Bildgebung geeignet ist. HINWEIS: Bei dieser LED-Intensität findet während der Aufnahme kein Photobleaching der GCaMP- und TagRFP-Fluoreszenz statt.</li>
</ol>3. Software-Setup für die Kalziumbildgebung
<ol><li>Laden Sie drei Softwarepakete in Windows herunter und installieren Sie sie: Mausmakrosoftware, Software zur Steuerung der Schwingungseigenschaft, Software zum Ausführen von Tracking-Software und Software zur Datenanalyse (Table of Materials).</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Tracking-Softwaredatei.</li>
	<li>Drücken Sie die Taste Ausführen , und warten Sie 5 Minuten, bis die Software stabilisiert ist (Abbildung 2A).</li>
	<li>Geben Sie die Informationen zur Belichtungszeit und zum Binning an. 0,033 s Belichtungszeit mit 2 x 2 Binning sorgen für eine flüssige Bildaufnahme (Abbildung 2B). HINWEIS: Es wird nur jedes 10. aufgenommene Bild angezeigt, um die Speicherlast zureduzieren.</li>
	<li>Geben Sie die Informationen für die Bildaufnahme an (Abbildung 2C). Wenn beispielsweise 500 Bilder zweimal mit einem Intervall von 10 s aufgezeichnet werden, geben Sie 1.000 in das Feld Bilder insgesamt, 500 in das Feld Bilder und 10 in das Feld Intervall (s) ein.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).</li>
	<li>Teilen Sie das Fluoreszenzbild mithilfe der Bildaufteilungsoptik und die beiden Bilder auf (GCaMP-Kanal, 500-525 nm (Abbildung 2E); TagRFP-Kanäle, 584-676 nm (Abbildung 2F)) werden auf zwei Hälften der sCMOS-Kamera projiziert. Kalibrieren Sie die Koordinaten der GCaMP- und TagRFP-Kanäle (Abbildung 2G). Speichern Sie die Softwareeinstellungen.</li>
	<li>Legen Sie das Verzeichnis fest, um die Datendatei auszugeben (Abbildung 2H).</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Mausmakro-Systemsoftware (Abbildung 3A) und stellen Sie die Schwingungseigenschaften ein (Abbildung 3B). Lesen Sie die Assay.txt Datei mit dem Mausmakrosystem, sodass der Mauszeiger basierend auf den Koordinaten und dem Zeitplan in dieser Datei gesteuert wird (Abbildung 3A). Legen Sie die Koordinaten des Mauszeigers fest (Magenta-Quadrate in Abbildung 3A) und warten Sie nach dem Start der Aufzeichnung bis zur Stimulation (Magenta in Abbildung 3A). Stellen Sie die Frequenz- und Amplitudenwerte in der Software zur Schwingungsdämpfung ein (Abbildung 3B).</li>
</ol>4. Vorbereitung von Würmern für die Kalziumbildgebung
<ol><li>Übertragen Sie einen einzelnen Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP ausdrückt, von der inkubierten Platte auf eine neue frische NGM-Platte, auf der E. coli OP50 gestreift wurde.</li>
	<li>Befestigen Sie die NGM-Platte mit transparentem Klebeband am piezoelektrischen akustischen Wandler (Abbildung 4). Drücken Sie die Platte nicht auf den Aktuator, da dies die Schwingungsfrequenz verändert.</li>
</ol>5. Calcium-Bildgebung unter Kontrolle spezifischer Schwingungseigenschaften
<ol><li>Aktivieren Sie die Schaltfläche "Erfassung" (Abbildung 2D).</li>
	<li>Finden Sie den Wurm unter hellem Licht und Anregungslicht (488 nm und 560 nm).</li>
	<li>Stellen Sie den Zoomwert der Mikroskopie auf 2,5x ein. Das Sichtfeld beträgt 1,1 mm x 1,1 mm bei einer Auflösung von 2,6 μm/Pixel.</li>
	<li>Schalten Sie das helle Licht aus und dann die Homing-Taste (Abbildung 2I), um den fluoreszierenden Fleck eines Wurms zu verfolgen. Diese Homing-Taste startet die Bewegung der X-Y-Stufe, um den maximalen Intensitätsbereich des Wurms in der Mitte des Sichtfeldes im TagRFP-Bild zu halten. HINWEIS: In Bezug auf den flp-18-Promotor ist die Fluoreszenzintensität der AVA-Neuronen am stärksten und die von anderen Neuronen sind schwach oder werden nicht erkannt. Daher ist das niedrige Vergrößerungssystem für die Verfolgung nicht erforderlich und die Bühne bewegt sich während der gesamten Aufnahme.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Werte der Intensitätsbalken in Abbildung 2E und 2F ungefähr 1.000 betragen. Wenn dies nicht der Fall ist, stimmen Sie die Messgeräte 470 nm und 550 nm des Steuerpods in der Lichtquelle ab.</li>
	<li>Drücken Sie die Taste Ausführen im Mausmakrosystem, um die Steuerung des Mauszeigers gemäß einem in Abbildung 3A beschriebenen Zeitplan zuzulassen. Dies beginnt mit der Tracking-Software aufzuzeichnen und stimuliert durch Wellen-Gen-Software, während der Wurm verfolgt wird.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die BMP-Ausgabedatei ordnungsgemäß erstellt wurde.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Erstellen Sie einen Ordner auf dem Desktop und nennen Sie ihn CalciumImaging.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Ordner im CalciumImaging-Ordner und nennen Sie ihn CIResult für die Ausgabeergebnisdateien.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Datei DualViewImaging.nb , die in der Datenanalysesoftware für Windows geschrieben wurde.</li>
	<li>Fügen Sie den Dateipfad in den CIResult-Ordner ein (z. B. DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Abbildung 5).</li>
	<li>Fügen Sie den Dateipfad in den Ordner ein, der die BMP-Datei enthält (z. B. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Abbildung 5), wobei XXX den Ordnernamen einschließlich der BMP-Dateien bezeichnet.</li>
	<li>Drücken Sie gleichzeitig die Umschalttaste und die Eingabetaste , um eine automatische Analyse zu starten. Diese Analyse verwendet den Wert eines maximalen Intensitätsbereichs des Sichtfelds im TagRFP-Bild (siehe die Legende von Abbildung 6 für ein detailliertes Berechnungsverfahren im Programm).</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die folgenden Ausgabedateien im CIResult-Ordner ordnungsgemäß erstellt wurden. XXX-GCaMP.tif (Bilddatei mit Spuren von GCaMP-Intensitäten für alle Bilder) XXX-GCaMP.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die die GCaMP-Intensitäten in allen Bildern auflistet) XXX-TagRFP.tif (Bilddatei, die Spuren der Intensitäten von TagRFP für alle Bilder veranschaulicht) XXX-TagRFP.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die TagRFP-Intensitäten in allen Bildern auflistet) XXX-Ratio.tif (Bilddatei, die Spuren des Verhältniswerts für alle Bilder veranschaulicht) XXX-Ratio.xls (Tabellenkalkulationsdatei, die den Verhältniswert in allen Bildern auflistet)</li>
</ol>

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<li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Im Allgemeinen erfordert die Quantifizierung der neuronalen Aktivität die Einführung einer Sonde und / oder Einschränkungen der Körperbewegung von Tieren. Für Studien des mechanosensorischen Verhaltens stellen jedoch die invasive Einführung einer Sonde und der Fesseln selbst mechanische Reize dar. C. elegans bietet ein System, um diese Probleme zu umgehen, weil seine Eigenschaften transparent sind und weil es einen einfachen, kompakten neuronalen Schaltkreis hat, der nur 302 Neuronen umfasst. Durch die Kombinati...

Tiere sind oft nicht lokalisierten mechanischen Reizen wie Vibrationen oder akustischen Wellenausgesetzt 1,2. Da diese Reize die Homöostase, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, müssen Tiere ihr Verhalten ändern, um mit ihnen fertig zu werden 3,4,5. Die neuronalen Schaltkreise und Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, sind jedoch kaum verstanden.
Mechanosensorisches Verhalten im Fadenwurz, Caenorhabditis elegans, ist ein einfaches Verhaltensparadigma, bei dem Würmer normalerweise ihr Verhalten von der Vorwärtsbewegung zu einer Rückwärtsfluchtreaktion ändern, wenn sie auf nichtlokalisierte Schwingungen stoßen6. Der neuronale Schaltkreis, der diesem Verhalten zugrunde liegt, besteht hauptsächlich aus fünf sensorischen Neuronen, vier Paaren von Interneuronen und mehreren Arten von Motoneuronen 7,8. Darüber hinaus gewöhnen sich Würmer an solche mechanischen Reize nach dem Training im Abstand mit wiederholter Stimulation 9,10,11. Daher stellt diese einfache Verhaltensreaktion ein ideales System dar, um neuronale Mechanismen zu untersuchen, die sowohl dem nicht lokalisierten Schwingungsverhalten als auch dem Gedächtnis zugrunde liegen. Ein Protokoll für die Kalziumbildgebung bei sich frei verhaltenden Würmern unter dem Einfluss von nicht lokalisierten Schwingungen wird veranschaulicht. Im Vergleich zu zuvor gemeldeten Systemen ist dieses System insofern einfach, als es keine zusätzliche Kamera für die Verfolgung benötigt. Es ermöglicht uns jedoch, die Frequenz, Verschiebung und Dauer der nicht lokalisierten Schwingung zu ändern. Da die Aktivierung der AVA-Interneuronen die Rückwärtsfluchtreaktion induziert, wurden Würmer, die GCaMP, einen Kalziumindikator, und TagRFP, ein calciuminsensitives fluoreszierendes Protein, unter der Kontrolle eines AVA-spezifischen Promotors mitexprimieren, als Beispiel verwendet (siehe Tabelle der Materialien für Details). Das Protokoll demonstriert die Aktivierung von AVA-Neuronen, wenn ein Wurm von der Vorwärts- zur Rückwärtsbewegung wechselt. Dieses Protokoll erleichtert das Verständnis des neuronalen Schaltkreismechanismus, der dem mechanosensorischen Verhalten zugrunde liegt.

<table><tbody><tr><td>Data Anaylsis Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DualViewImaging.nb</td><td>author</td><td></td><td>Für die Analyse der erfassten Daten</td></tr><tr><td>Mathematica12</td><td>Wolfram</td><td></td><td>Für die Ausführung der Datenanalysesoftware DualViewImaging</td></tr><tr><td>Escherichia coli und C. elegans Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>Futter für C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>KG1180</td><td>Lichtunempfindlicher</td></tr> <tr><td>Mutantlite-1(ce314) Stamm, der NLS-GCaMP-NLS und TagRFP exprimiert, unter der Kontrolle des AVA-specirischen Promotors</td><td>, Autor</td><td>ST12</td><td>lite-1(ce314) Mutante, die die Gene NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nukleäres Lokalisationssignal) und TagRFP exprimiert, unter der Kontrolle der flp-18-Promotor als extrachoromosomales Array</td></tr><tr><td>Laser-Doppler-Vibrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lase Doppler-Vibrometer</td><td>Polytec Japan</td><td>IVS-500</td><td>Zur Quantifizierung von Frequenz und Verschiebung, die vom akustischen Wandler erzeugt</td></tr> werden<tr><td>Maus-Makrosystem</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay.txt</td><td>Autor</td><td></td><td>Skript zur zeitlichen und speziellen Steuerung von Mauscursol in Windows</td></tr><tr><td>HiMacroEx</td><td>Vector</td><td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td><td>Kostenloser Download von Software zur Steuerung des Mauszeigers basierend auf einem Skript</td></tr><tr><td>Nematoden Wachstumsmedienplatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar gereinigt, Pulver</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td>Für Zubereitung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td>Zur Vorbereitung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Wako</td><td>036-00485</td><td>Zur Vorbereitung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Wako</td><td>034-03002</td><td>Zur Herstellung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>di-Photassiumhydrogenphosphat</td><td>Nakarai tesque</td><td>28727-95</td><td>Zur Herstellung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>LB Brühe, Lennox</td><td>Nakarai tesque</td><td>20066-95</td><td>Zur Kultivierung von E. coli OP50</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat wasserfrei</td><td>TGI</td><td>M1890</td><td>Zur Herstellung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Nakarai tesque</td><td>28720-65</td><td>Zur Herstellung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Nakarai tesque</td><td>31320-05</td> Zur <td>Herstellung von NGM-Platten</td></tr><tr><td>Petrischalen (60 mm)</td><td>Nunc</td><td>150270</td><td>Für die Vorbereitung von NGM-Platten</td></tr><tr><td><stark>nicht lokalisiertes Vibrationsgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>LEPY</td><td>LP-A7USB</td><td>Für die Stimulation mit kontrollierbarer</td></tr><tr><td>Vibration Akustischer Wandler</td><td>MinebeaMitsumi</td><td>LVC25</td><td>Für die Stimulation mit steuerbarer</td></tr><tr><td>Vibration WaveGene Ver. 1.5</td><td>Thrive</td><td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td><td>Kostenloser Download von Software zur Steuerung der Schwingungseigenschaft</td></tr><tr><td><stark>nichtinvasive Calcium-Bildgebung</stark></td>2-Kanal-Tischgerät 3-phasiger bürstenloser DC-Servoregler <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>BBD202</td><td>Kompatibler Controller für MLS203-1-Tische</td></tr><tr><td>479/585 nm BrightLine Dualband-Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-479/585-25</td><td>Für die Aufnahme von Zweikanalbildern (GCaMP und TagRFP)</td></tr><tr><td>505/606 nm BrightLine Dual-Edge Standard Epi-Fluoreszenz dichroitischer Strahlteiler</td><td>Semrock</td><td>FF505/606-DI01-25x36</td><td>Für die Aufnahme von Zweikanalbildern (GCaMP und TagRFP)</td></tr><tr><td>512/25 nm BrightLine Singleband-Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-512/25-25</td><td>Für die Aufnahme von Zweikanalbildern (GCaMP und TagRFP)</td></tr><tr><td>630/92 nm BrightLine Singleband-Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-630/92-25</td><td>Für die Aufnahme von Zweikanalbildern (GCaMP und TagRFP)</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Precision T7600</td><td>Windows7 mit Intel Xeon CPU ES-2630 und 8 GB RAM</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-X-Y-Motortisch</td><td>Thorlabs</td><td>MLS203-1</td><td>Schneller XY-Scanning-Tisch</td></tr><tr><td>Bildaufteilungsoptik</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>A12801-01</td><td>Zur Aufnahme von Zweikanalbildern (GCaMP und TagRFP), die mit W-VIEW GEMINI Bildaufteilungsoptik</td></tr><tr>erzeugt werden<td>LED-Lichtquelle</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td>Zur Erzeugung von Anregungslicht von 470 nm und 560 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla</td><td></td></tr><tr><td>x 2 Objektiv</td><td>Olympus</td><td>MVPLAPO2XC</td><td>Arbeitsabstand 20 mm und numerisch aperture 0,5</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKDK66</td><td>Plasmid-Autor</td><td>pKDK66</td><td>Co-Injektionsmarker</td></tr><tr><td>pTAK83</td><td>Plasmid-Autor</td><td>pTAK83</td><td>Plasmid für die Expression von TagRFP unter der Kontrolle des flp-18-Promotors</td></tr><tr><td>pTAK144 Plasmid-Autor</td><td></td><td>pTAK144</td><td>Plasmid zur Expression von NLS-GCaMP5G-NLS unter der Kontrolle von&nbsp; die flp-18</td></tr> <tr><td>PromotorTracking-Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homingback.vi</td><td>Autor</td><td></td><td>SubVi-Datei zur Verfolgung eines fluoresenten Spots eines Wurms durch Rückkopplungssteuerung der sCMOS-Kamera und des motorisierten x-y-Tisches</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>Nationale Instrumente</td><td></td><td>Zum Ausführen der Tracking-Software</td></tr><tr><td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td><td>Autor</td><td></td><td>Zur Verfolgung eines fluoresenten Spots eines Wurms durch Rückkopplungssteuerung der sCMOS-Kamera und des x-y-Motortisches</td></tr></tbody></table>

kalziumbildgebung bei frei verhaltender caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter schwingung

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nicht lokalisierte mechanische Kräfte wie Schwingungen und akustische Wellen beeinflussen eine Vielzahl biologischer Prozesse von der Entwicklung bis zur Homöostase. Tiere bewältigen diese Reize, indem sie ihr Verhalten ändern. Das Verständnis der Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, erfordert eine Quantifizierung der neuronalen Aktivität während des interessierenden Verhaltens. Hier berichten wir über eine Methode zur Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von Caenorhabditis elegans mit nicht lokalisierten Schwingungen spezifischer Frequenz, Verschiebung und Dauer. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingungen unter Verwendung eines akustischen Wandlers und die Quantifizierung evozierter Kalziumreaktionen bei Einzelzellauflösung. Als Beweis für das Prinzip wird die Calciumreaktion eines einzelnen Interneurons, AVA, während der Fluchtreaktion von C. elegans auf Vibration demonstriert. Dieses System wird das Verständnis neuronaler Mechanismen erleichtern, die Verhaltensreaktionen auf mechanische Reize zugrunde liegen.

Hier wird ein Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP unter Kontrolle des AVA-Interneuron-spezifischen Promotors exprimiert, als Beispiel für die Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von C. elegans verwendet. GCaMP- und TagRFP-Kanaldaten wurden als eine Reihe von Bildern, von denen einige in Abbildung 6 dargestellt sind, und als Film (Supplemental Movie 1) erhalten. Die Verschiebung der Petriplatte, die durch unser nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert wi...

Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Unser System ermöglicht es Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nicht skalierter Verschiebung hervorzurufen und den Kalziumstrom während der Reaktionen der Reizstoffe auf die Schwingungen zu quantifizieren. Als Hauptvorteil dieser Technik können wir die neuronalen Mechanismen, die zugrunde liegenden Verhaltensmechanismen, nichtinvasiv untersuchen. Bereiten Sie ein neues Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Platte vor, auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster mit einem Zellstreuer gestreift ist, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt.Übertragen Sie vier Tage vor einem Kalzium-Bildgebungsexperiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf die Platte und legen Sie die Platte für vier Tage in einen 20-Grad-Celsius-Inkubator. Führen Sie Kalziumbildgebung mit einem Mikroskop durch, das mit einem akustischen Wandlergerät zur Stimulation, einem 2-fachen Objektiv, einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einer Bildaufteilungsoptik ausgestattet ist. Schalten Sie den Präzisionscomputer im motorisierten Stage Controller X Y ein.Schalten Sie dann den Verstärker ein und stellen Sie den Lautstärkeregler auf 10 in der Basis und die Höheneinsteller auf acht. Um GCaMP anzuregen und RFP zu markieren, schalten Sie die 488- und 560-Nanometer-Leuchten der LED-Lichtquelle ein. Stellen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Steuerkapsel in der Lichtquelle auf 5% ein, damit die Intensität des LED-Lichts für die Bildgebung geeignet ist.Laden Sie die folgenden Softwarepakete und Fenster herunter und installieren Sie sie. Mausmakro-Software, Software für die Schwingungsdämpfung, Software für das laufende Tracking und Software für die Datenanalyse. Doppelklicken Sie auf die Tracking-Softwaredatei, stellen Sie dann die Belichtungszeit auf 0,033 Sekunden ein und binning auf zwei mal zwei, um eine reibungslose Bildaufnahme zu gewährleisten.Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und warten Sie fünf Minuten, um die Software zu stabilisieren. Geben Sie die Informationen für die Bildaufnahme ein. Wenn Sie beispielsweise 500 Bilder ohne Intervall aufzeichnen möchten, geben Sie 500 in das Feld Bilder insgesamt, 500 in das Feld Bilder und Null in das Feld Intervalle ein.Nachdem Sie die Aufnahmetaste eingeschaltet haben, teilen Sie das Fluoreszenzbild mithilfe der Bildaufteilungsoptik auf und projizieren Sie den GCaMP-Kanal und den Tag-RFP-Kanal auf zwei Hälften der CMOS-Kamera. Kalibrieren Sie die Koordinaten des GCaMP und markieren Sie RFP-Kanäle und speichern Sie die Einstellungen. Legen Sie dann das Verzeichnis so fest, dass die Datendatei ausgegeben wird, und deaktivieren Sie die Erfassung.Lesen Sie den Assay. Textdatei mit dem Mausmakrosystem, so dass der Mauszeiger basierend auf den Koordinaten und dem Zeitplan in dieser Datei gesteuert wird und doppelklicken Sie auf die Softwaredatei zur Schwingungskontrolle. Stellen Sie die Koordinaten des Mauszeigers in der Wartezeit bis zur Stimulation nach dem Start der Aufnahme ein und stellen Sie dann die Frequenz- und Amplitudenwerte in der Software zur Schwingungskontrolle ein.Übertragen Sie einen einzelnen Wurm, der sowohl GCaMP als auch Tag-RFP ausdrückt, von der inkubierten Platte auf eine frische NGM-Platte, auf der E coli OP50 gestreift wurde. Befestigen Sie die NGM-Platte mit transparentem Klebeband am akustischen Wandler. Schalten Sie für die Kalziumbildgebung die Erfassungstaste ein und finden Sie den Wurm bei 2,5-facher Vergrößerung.Stellen Sie das Sichtfeld auf 1,1 x 1,1 Millimeter mit einer Auflösung von 2,6 Mikrometern pro Pixel ein. Schalten Sie das helle Licht aus und klicken Sie auf die Homing-Taste, um den fluoreszierenden Punkt eines Wurms zu verfolgen, der die Bewegung der X-Y-Stufe einleitet, um den maximalen Intensitätsbereich des Wurms in der Mitte des Sichtfelds im Tag-RFP-Bild zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Intensitätswerte ungefähr 1000 betragen.Wenn nicht, stimmen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Kontrollkapsel in der Lichtquelle ab. Drücken Sie die Schaltfläche Ausführen im Mausmakrosystem, um die Mauszeigersteuerung zuzulassen, und überprüfen Sie, ob die BMP-Ausgabedatei ordnungsgemäß erstellt wurde. Erstellen Sie für die Datenanalyse einen Ordner auf dem Desktop und nennen Sie ihn Calcium Imaging", erstellen Sie dann einen Ordner innerhalb des Calcium Imaging-Ordners und nennen Sie ihn CI-Ergebnis für die Ausgabeergebnisdateien.Doppelklicken Sie auf das Dual-View-Imaging. MB-Datei, die in der Datenanalysesoftware geschrieben wurde, und fügen Sie die Dateipfade zum CI-Ergebnisordner in den Ordner mit der BMP-Datei ein. Drücken Sie gleichzeitig die Umschalt- und die Returntaste, um eine automatische Analyse zu starten, die den Wert eines Bereichs mit maximaler Intensität im Tag-RFP-Bild verwendet.Prüfen Sie abschließend, ob die Ausgabedateien im CI-Ergebnisordner entsprechend angelegt sind. In der repräsentativen Analyse wurden GCaMP- und Tag-RFP-Kanaldaten als eine Reihe von Bildern erhalten. Die Verschiebung der Petrischale, die durch ein nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert wurde, wurde ebenfalls quantifiziert.Die Verschiebung kann durch Einstellen des Amplitudenwertes in der Software zur Schwingungsdämpfung sowie des Lautstärkereglers und des Verstärkers gesteuert werden. Während die Frequenz durch Einstellen des Frequenzwertes in der Software reguliert werden kann. Eine transiente Kalziumreaktion von AVA-Neuronen wurde bei Stimulation mit Vibrationen mit einer Frequenz von 630 Hertz und einer Verschiebung von etwa 4,5 Mikrometern pro Sekunde beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Ava-Neuron während der Rückwärtsreaktion eines Wurms auf die nicht lokalisierte Stimulation aktiviert wurde.In unserem Verfahren können wir nur ein einzelnes Neuron quantifizieren. Dieses System kann jedoch auch mit einem biometrischen Bildgebungsverfahren kombiniert werden, um mehrere Neuronen oder sogar das gesamte Gehirn nichtinvasiv zu quantifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kalzium-Bildgebung in einzelnen Neuronen von sich benehmenden Caenorhabditis elegans unter Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Reporterproteine. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Abbildung der Wurmbewegung und der Messung der Reporterfluoreszenzverhältnisse von Neuronen erforderlich sind, um den intrazellulären Kalziumspiegel mit der neuronalen Aktivität und Verhaltensänderungen während der Eiablage zu korrelieren.

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Dendritische Stacheln sind wichtige zelluläre Merkmale des Nervensystems. Hier werden bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Struktur und Funktion von dendritischen Dornen in C. elegans beschrieben. Diese Ansätze unterstützen die Entwicklung von mutierten Screens für Gene, die die Form oder Funktion der dendritischen Wirbelsäule definieren.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Hier stellen wir Protokolle und Werkzeuge zur Visualisierung von Kalzium während der Befruchtung und der frühen Embryogenese unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumreporters vor, der in der Keimbahn des Modellfadenwurms C . elegans exprimiert wird.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Erfahren Sie Calcium-Imaging bei frei verhaltendem Caenorhabditis elegans mit kontrollierten, nicht lokalisierten Vibrationen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung neuronaler Calciumströme während Verhaltensantworten.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

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