Name: GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie eine gentechnikfreie Methode zur Erzeugung neuronaler Zellen aus peripheren Blutzellen. Diese Technik ermöglicht die sichere Herstellung autologer Stammzellen für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.
Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.

Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt.
1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen.</li>
	<li>Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokoll.</li>
	<li>Isolieren Sie PBMNCs durch Dichtegradientenmedien. Verwenden Sie 10 ml Medium mit 25 ml 1:1 Blut, verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS), und Zentrifuge bei 300 x g für 30 min.</li>
	<li>Isolieren Sie die Interphasenschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit 5 ml sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min. Wiederholen Sie es zweimal.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der Zellen nach Standardmethoden mit einer Zählkammer.</li>
</ol>2. Aktivierung des humanen GPI-verankerten Glykoproteins durch Antikörpervernetzung auf der Oberfläche von PBMNCs
<ol><li>Die 6 x 106 mononukleären Zellen (MNCs) werden in 15 ml Röhrchen eingelegt und eine Antikörpervernetzung durchgeführt, indem die Zellen mit humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörpern (30 μg/ml) für 30 min in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) bei 37 °C inkubiert werden.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Inkubationsmedium durch das modifizierte Dulbecco-Medium von Iscove, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.</li>
	<li>Züchten Sie die Zellen in 15 ml Polystyrolröhrchen, legen Sie die Röhrchen für 8-10 Tage in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 (ohne Schütteln). Fügen Sie auf D5 zusätzliche 1-2 ml Iscove-Medium hinzu, ergänzt mit 10% FBS, zu jeder 15-ml-Röhre.</li>
</ol>3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen
<ol><li>Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler (18 μL Zellsuspension + 2 μL Fluoreszenzfarbstoff) oder in einer Zählkammer.</li>
	<li>Zentrifugen kultivierte Zellsuspension (5-7 x10 6) bei 300 x g für 10 min und den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteur-Pipette absaugen.</li>
	<li>Suspendieren Sie das Zellpellet in 90 μL vorgekühltem PBS pH 7,2, 0,5% BSA und 2 mM EDTA.</li>
	<li>CD45-positive magnetische Perlen in Nanogröße (80 μL) in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 ml PBS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min hinzufügen.</li>
	<li>Suspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS-Puffer.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 500 μL vorgekühltem PBS-Puffer und legen Sie sie in das Magnetfeld.</li>
	<li>Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie mit 500 μL PBS-Puffer (zweimal) und dem Zentrifugenstrom mit CD45-negativzellen. Sammeln Sie sie in Iscoves Medium, ergänzt mit 1% BSA.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer.</li>
</ol>4. Vorbereitung von Zellkulturschalen zur neuronalen Differenzierung neu erzeugter Stammzellen
<ol><li>Beschichten Sie die Kulturgefäße mit Poly-L-Ornithin und Laminin, um neuronale Zellen zu züchten.</li>
	<li>Legen Sie die Glasdeckschichten in 4-Well-Platten und beschichten Sie sie mit 1:5 verdünntem Poly-L-Ornithin (0,1 mg/ml in ddH2O) in ddH2O. Legen Sie die Deckrutsche für 1 h in einen 37 °C-Inkubator. Anschließend mit ddH2O waschen.</li>
	<li>Laminin langsam auftauen (0,5-2,0 mg / ml) und oben auf den Abdeckeln hinzufügen. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 2 h.</li>
	<li>Vorbereiten des neuronalen Induktionsmediums N2, bestehend aus 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-Ergänzung, 400 μL nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), basische FGF-Lösung bei 20 ng/ml Endkonzentration (hergestellt aus 100 μg/ml Stammlösung) und Heparin bei 2 ng/ml Endkonzentration.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Laminin durch Pipettieren und fügen Sie dem Kulturschalen neuronales Medium N2 hinzu.</li>
</ol>5. Kultivierung neuronaler dedifferenzierter Blutzellen
<ol><li>Kultur BD-abgeleitete CD45-negative Zellen auf Laminin/Ornithin-beschichteten Glasabdeckungen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in N2-Medium, um eine neuronale Differenzierung von neu BD-erzeugten Zellen einzuleiten.</li>
	<li>Kulturzellen weiter in neuronalem Differenzierungsmedium bestehend aus 48 ml neurobasalem Medium, 500 μL L-Glutamin, 1 ml B27-Ergänzung, 500 μL NEAA, 50 μL rekombinantem humanem Glia-abgeleitetem neurotrophen Faktor (GDNF) bei 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL rekombinantem neurotrophen Faktor (BDNF) des menschlichen Gehirns bei 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL Ascorbinsäurelösung 2,9 g/50 ml in PBS. Legen Sie die Platten in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.</li>
</ol>6. Immunfluoreszenzmikroskopische Analyse von blutabgeleiteten Nervenzellen
<ol><li>Kulturieren Sie die Zellen wie oben beschrieben für 16 Tage und entfernen Sie die Medien.<ol>
<li>Inkubieren Sie mit vorgewärmten Fixiermitteln, bestehend aus 75 ml sterilem Wasser, 4 g Paraformaldehyd. Fügen Sie nach Bedarf 10 N NaOH hinzu und rühren Sie um, bis die Lösung klar ist. Dann fügen Sie 10 mL 10x PBS, 0,5 mlMgCl2, 2 mL 0,5 M EGTA und 4 g Saccharose hinzu. Titrieren Sie auf pH 7,4 mit 6 N HCl und bringen Sie auf 100 ml steriles Wasser für 15 minuten, nach Marchenko et al.7.</li>
		<li>Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 3 Mal für jeweils 5 min. Sofort eine frisch hergestellte 0,3% Triton X-Lösung hinzufügen und die Zellen für 5 min permeabilisieren. 3 Mal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung von PBS und 5% BSA hinzufügen.</li>
		<li>Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für 1 Stunde.</li>
		<li>Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung von Antikörpern in 1% BSA / PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit Antikörperverdünnungen auf der Rockerplatte für 1,5 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS für jeweils 5 min, inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Abdecklappen mit Montagemedien zur Visualisierung auf einem Mikroskop. HINWEIS: Direkt markierte Antikörper, die in diesem Experiment verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Transmissionselektronenmikroskopische Analyse neu erzeugter Zellen
<ol><li>Säen Sie die Zellen für TEM in 8-Well-Kammerobjektträgern.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen in 3,5% Glutaraldehyd für 1 h bei 37 °C, postfixieren Sie in 2% OsO4 für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur und färben Sie sie in 2% Uranylacetat im Dunkeln bei 4 °C für 2 h 30 min.</li>
	<li>Zum Schluss die Zellen in destilliertem Wasser abspülen, in Ethanol dehydrieren und über Nacht in Epoxidharz einbetten. Am nächsten Tag werden die Proben für 72 h zur Harzhärtung in einen 70 °C-Ofen überführen.</li>
	<li>Lösen Sie die eingebetteten Zellkulturen vom Kammerschieber und kleben Sie sie auf Aralditblöcke.</li>
	<li>Schneiden Sie serielle halbdünne Abschnitte (1,5 μm) mit einer Maschine, montieren Sie sie auf Glasobjektträger und färben Sie sie leicht mit 1% Toluidinblau.</li>
	<li>Ausgewählte halbdünne Abschnitte auf Aralditblöcke kleben und durch wiederholtes Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen vom Glasobjektträger lösen.</li>
	<li>Bereiten Sie ultradünne Abschnitte (0,06-0,08 μm) mit einer Maschine vor und kontrastieren Sie sie mit Bleicitrat.</li>
	<li>Erhalten Sie Mikroaufnahmen mit dem Elektronenrinnenmikroskop mit Digitalkamera.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

Die korrespondierende Autorin erklärt, dass sie Patentinhaberin im Zusammenhang mit Novel Human GPI-linked Protein ist und für ACA CELL Biotech mitbegründet und arbeitet. Die anderen Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzier...

Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.
Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab2. Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.
Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten3gewonnen werden, sowie iPSCs4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand5vermieden wird.
Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.
Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)6. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.
In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.

<table><tbody><tr><td>Albuminfraktion V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3-Konjugat</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen 560381</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Cell Viability Kit</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym werden nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt.</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure 2-phosphat sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum frei 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Basische FGF-Lösung</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>Dichtegradientenmedium</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>magnetische Kügelchen in Nanogröße</td></tr><tr><td>Objektträger zur Zellzählung Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym wird nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt.</td></tr><tr><td>Chamber Slides Lab-Tek</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>Epoxidharz</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Abgekündigt. Erhältlich unter: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF rekombinant human</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-Glutamin</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumzelle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-Maus</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Automatisierter Zellzähler</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym wird nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt.</td></tr><tr><td>MACS Puffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; </td><td>ulen Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada Digitalkamera</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 Wells</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS steril</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

gen-freie erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen zellen

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.

Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken.
Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzierung ...

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Die Bedeutung des Protokolls beruht auf der Signalübertragung von Membran zu Kern und wirkt sich nicht direkt auf das Genom aus, wie es bei induzierten pluripotenten Stammzellen der Fall ist. Die nicht-teratogene Natur von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen ist der Hauptvorteil der Technik, wodurch sie für eine sichere klinische Anwendung in verschiedenen Bereichen der regenerativen Medizin geeignet ist. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Anne-Kathrin Schott, Projektleiterin, und Oksana Greenacre, Laborassistentin in meinem Labor.Um PBMNCs zu isolieren, fügen Sie 25 Milliliter eins zu eins Blut, verdünnt mit PBS, zu 10 Millilitern Dichtegradientenmedien hinzu und zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 mal G für 30 Minuten. Isolieren Sie die Grenzschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit fünf Millilitern sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 mal G für 10 Minuten.Nachdem Sie den Vorgang zweimal wiederholt haben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer. Fügen Sie 6 x 10 zu den 6. mononukleären Zellen zu einem 15-Milliliter-Röhrchen hinzu und führen Sie dann eine Antikörpervernetzung dur

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung neuronaler Zellen aus pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) aus dem Blut. Die BD-PSCs werden durch die Reprogrammierung von Blutvorläuferzellen gewonnen. Die undifferenzierten BD-PSCs werden auf Zellkultursubstrat-beschichteten Deckgläsern unter Verwendung eines neuronalen Induktionsmediums und eines neuronalen Differenzierungsmediums kultiviert, wodurch die Differenzierung in Zellen mit einem neuronalen Phänotyp ausgelöst wird.

Erzeugung neuronaler Zellen aus pluripotenten Stammzellen aus dem Blut

Das Video zeigt die Erzeugung von Neuronen aus adulten humanen dermalen Fibroblasten (aHDFs). Die aHDFs werden mit Hilfe eines lentiviralen Vektors reprogrammiert, der Gene für neuronale Transkriptionsfaktoren und kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs) trägt. Die shRNAs hemmen die Expression eines neuronalen transkriptionellen Repressors, und die neuronalen Transkriptionsfaktoren aktivieren Gene, um aHDFs in Neuronen zu differenzieren. Diese reprogrammierten aHDFs werden in einem frühen und einem späten...

Generierung von Neuronen durch Reprogrammierung menschlicher dermaler Fibroblastenzellen

Quelle: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-freie Generierung von neuronalen Zellen aus dem Blut. J. Vis. Exp. (2021)Das Video demonstriert ein Protokoll zur Vorbereitung von Nervenzellen, die aus reprogrammierten peripheren Blutzellen gewonnen wurden, für die Fluoreszenzmikroskopie, wobei unterschiedliche Zelltypen und Entwicklungsstadien durch Immunfluoreszenzbildgebung dargestellt werden.

Immunfluoreszenzmikroskopie von Nervenzellen, die von peripheren Blutzellen differenziert werden 

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Direkte neuronale Umprogrammierung erzeugt Neuronen, die im Alter von der somatischen Startzelle beibehalten. Hier beschreiben wir eine einzelne Vektor-basierte Methode um induzierte Neuronen von dermalen Fibroblasten von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu generieren.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Neuronen in einem 3D-Suspensionsbioreaktor.

Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

Diese Studie beschreibt einen neuartigen Ansatz für die Etablierung von humanen Monozyten-abgeleiteten Mikroglia-ähnlichen (iMG) Zellen, die eine indirekte Beurteilung von Hirnentzündungen ermöglichen. Dies stellt ein zelluläres Modell dar, das für die Forschung nützlich sein könnte, die sich auf mögliche Entzündungen des Gehirns und damit verbundene neuropsychiatrische Erkrankungen konzentriert.

Engineering von humanen blutinduzierten Mikroglia-ähnlichen Zellen für die reverse-translationale Hirnforschung

Erfahren Sie eine gentechnikfreie Methode zur Erzeugung neuronaler Zellen aus peripheren Blutzellen. Diese Technik ermöglicht die sichere Herstellung autologer Stammzellen für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

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