Name: Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Lernen Sie die Implantation von osmotischen Pumpen und Hirnkanülen zur Etablierung eines pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3-Dystonie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Bewegungsstörungen durch chronische Arzneimittelgabe.

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Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF DysTract to C.W.I.) und vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Universität Würzburg (Z2-CSP3 bis L.R.) unterstützt. Die Autoren danken Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger und Heike Menzel für ihre technische Unterstützung sowie Helga Brünner für die Tierpflege.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den geltenden internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Die Kommunen der Regierung von Unterfranken, Würzburg, genehmigten alle Tierversuche.
1. Grundierung von osmotischen Pumpen
HINWEIS: Dieser Schritt muss mindestens 48 h vor der Operation durchgeführt werden. ALZET osmotische Pumpen müssen vorgefüllt werden, um sicherzustellen, dass die Pumprate vor der Implantation einen stabilen Zustand erreicht.
<ol><li>Bereiten Sie die gewünschte Lösung für chronische Perfusion im Voraus. Stellen Sie sicher, dass das Lösungsmittel und das Mittel mit den osmotischen Pumpen und Kathetern kompatibel sind. Für das hierin vorgesehene Projekt eine 10-fache Lagerlösung von Ouabain (bei -20 °C gelagert) bei Raumtemperatur und Wirbel für 10 s auftauen. VORSICHT: Ouabain ist giftig: Es sollte nur mit Handschuhen behandelt und nur unter einer sterilen Kapuze geöffnet werden, um einEinatmen zu vermeiden.</li>
	<li>Schalten Sie die sterile Kapuze ein; desinfizieren Sie die Kapuze sowie alle Notwendigen Instrumente und Materialien, bevor Sie sie unter die Haube legen.</li>
	<li>Tragen Sie vor der Handhabung der osmotischen Pumpen chirurgische Handschuhe an. Die für die Pumpen des Striatums und des Kleinhirns vorgesehene Ouabain-Lösung separat vorbereiten. HINWEIS: Beachten Sie, dass die Konzentration der Lösung in der Pumpe für das Striatum im Vergleich zur Konzentration der Lösung in der für das Kleinhirn vorgesehenen Pumpe verdoppelt werden muss. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Pumpe für das Striatum mit einer Doppelkanüle verbunden ist, die Durchflussrate ist jedoch die gleiche wie bei der Pumpe des Kleinhirns, die mit einer einzigen Kanüle verbunden ist.</li>
	<li>Berechnen Sie die benötigte Lösungsmenge mit der folgenden Formel: Massenlieferrate (ko) = Volumenlieferrate (Q) x Konzentration des Mittels im Fahrzeug (Cd) Für das vorliegende Projekt wurden die osmotischen Pumpen mit einer Ouabainlösung in einer Konzentration von 11,2 ng/h oder 0,9% Saline für die Kontrollgruppe grundiert und gefüllt.</li>
	<li>Vortex sowohl Ouabain-Lösungen für 10 s und sterile Filter (d.h. 0,22 m Spritzen-Endfilter) sie in separaten, neuen Mikrozentrifugen-Rohren, mit einem anderen Filter für jede Lösung.</li>
	<li>Wiegen Sie die leeren osmotischen Pumpen zusammen mit dem Strömungsmoderator (ca. 0,4 g).</li>
	<li>Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer 27 G Füllkanüle (vorzugsweise mit einer stumpfen Spitze) mit sterilgefilterter Ouabain-Lösung oder Fahrzeuglösung.</li>
	<li>Holen Sie alle Luftblasen aus der Spritze, halten Sie die osmotische Pumpe in einer aufrechten Position, legen Sie die Kanüle den ganzen Weg in die Pumpe und langsam füllen Sie das Reservoir, bis überschüssige Lösung auf der Oberseite erscheint (vermeiden Sie eine schnelle Füllung, da dies zu Luftblasen in der Pumpe führen kann). Als Nächstes fügen Sie den Durchflussmoderator in die Pumpe ein (überschüssige Lösung sollte oben angezeigt werden).</li>
	<li>Ziehen Sie den Strömungsmoderator heraus (ca. 5 mm), nehmen Sie vorsichtig den weißen Flansch mit der Schere ab und verbinden Sie ein Stück Vinylschlauch mit dem Strömungsmoderator. Stellen Sie sicher, dass der Katheter eine Länge von ca. 2 cm hat, um eine angemessene Beweglichkeit des Tieres zu ermöglichen.</li>
	<li>Wiegen Sie die gefüllte osmotische Pumpe noch einmal, um sicherzustellen, dass der Gewichtsunterschied zwischen gefüllter und leerer Pumpe mit dem erwarteten Gewicht der geladenen Lösung übereinstimmen deiner. HINWEIS: Bei den meisten wässrigen Lösungen entspricht dieses Gewicht dem Volumen in Mikrolitern. Entspricht das Gewicht nicht dem erwarteten Volumen, kann Luft in der Pumpe eingeschlossen werden, die geleert und nachgefüllt werden muss.</li>
	<li>Für die Grundierung der Pumpen zwei 2 ml Mikrozentrifugenrohre, ein Rohr für das Striatum und eines für das Kleinhirn vorbereiten.</li>
	<li>Untertauchen Sie die Pumpen in die Mikrozentrifugenrohre, die auf halbem Weg mit 0,9% Salinelösung gefüllt sind. Tauchen Sie das offene Ende des Katheters nicht unter. Setzen Sie die Mikrozentrifugenrohre für 48 h bei 37 °C in einen Thermocycler, um sicherzustellen, dass die Pumpe vor der Implantation eine konstante Pumprate erreicht und die Katheter vorgefüllt werden.</li>
</ol>2. Kanülen- und osmotische Pumpenimplantation
<ol><li>Die Maus (männlich, C57Bl/6N, 11-12 Wochen alt) in eine Kammer für inhalative Anästhesie legen; den Durchfluss von Isofluran auf 2-3% und den Sauerstoffdurchfluss auf 2 L/min einstellen.</li>
	<li>Nachdem die Maus nach zugelassenen Protokollen tief beästhesiert ist, rasieren Sie die Oberseite des Kopfes des Tieres, den Rückenhals und das proximale Drittel des Rückens.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und setzen Sie die Anästhesie mit Isofluran über eine Mausanästhesiemaske für das stereotaktische Instrument (Isofluran-Durchflussrate 1,5-2%, 2 L/min Sauerstoff) fort.</li>
	<li>Mit Gummispitzen oder nicht gebrochenen Ohrbügeln, fixieren Sie den Kopf des Tieres in den stereotaktischen Rahmen, wobei Sie darauf achten, dass der Kopf nivelliert wird.</li>
	<li>Um Unterkühlung zu vermeiden, legen Sie ein Heizkissen unter das Tier, legen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Schützen Sie die Augen des Tieres vor dem Austrocknen, indem Sie einen Tropfen ophthalmologische Salbe auf jedem Auge verwenden.</li>
	<li>Tragen Sie ein Schmerzmittel wie Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht) vor Beginn der Operation subkutan auf.</li>
	<li>Mit einer Spritze subkutan injizieren bis zu 0,2 ml Bupivacain 0,25% und warten Sie 30 s, bis die Lokalanästhesie wirksam wird.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die rasierten Bereiche gründlich mit einem Antiseptikum, wie Octenidindihydrochlorid.</li>
	<li>Nach gründlicher Desinfektion des Operationsbereichs, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt an der Oberseite des Kopfes zu platzieren und verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt bis zu den vorderen Gliedmaßen fortzusetzen. Den Schädel mit Hilfe von Bulldoggenklemmen aussetzen und das Periost mit einem sterilen, mit Baumwolle gekippten Applikator abwischen.</li>
	<li>Richten Sie entweder einen Stift oder die Spitze einer kanüle in schwarzer Tinte mit Bregma befleckt und verwenden Sie die entsprechenden Koordinaten, um die drei Einstiegspunkte für die Hirnkanülen auf dem Schädel zu markieren (Koordinaten für die bilateralen Löcher, die für die Durchblutung der Basalganglien benötigt werden: vorder/posterior: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1,50 mm (+ Anzeige der rechten Seite, - die linke Seite relativ zur Bregma); Koordinaten für das Loch an der Mittellinie des Kleinhirns: vorder/posterior: - 6,90 mm). Als nächstes bohren Sie sorgfältig die Löcher für die Doppelkanüle, die für die Basalganglien und die für das Kleinhirn vorgesehene Einzelkanüle bestimmt ist (Abbildung 1A).</li>
	<li>Bohren Sie ein viertes Loch für eine kleine Schraube zwischen dem Striatum und dem Kleinhirn. Diese Schraube wird schließlich in Zahnzement eingebettet und bieten zusätzlichen Halt für die Kanülen. Mit feinen Zangen und einem Schraubenzieher, bringen Sie die Schraube vorsichtig in das kleine Loch, bis es fest im Schädel befestigt ist. Implantieren Sie die Schraube nicht zu tief, da dies das Hirngewebe schädigt. HINWEIS: Es wird empfohlen, die osmotische Pumpenimplantation fortzusetzen, bevor Sie die osmotischen Kanülen einsetzen. Dadurch wird vermieden, dass bei der Implantation der Pumpen versehentliche Schäden an den Kanülen verursacht werden.</li>
	<li>Um eine kleine Tasche für die osmotische Pumpe auf jeder Seite des Tieres zurück zu schaffen, verwenden Sie Gewebezange, um die subkutanen Gewebeschichten zu trennen. Bewegen Sie die Zange auf ein Hinterbein und öffnen Sie die Zange leicht, um die subkutane Tasche zu erweitern. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite, zuerst entfernen Sie die Zange aus dem Schnitt und schieben Sie sie dann sanft in Richtung des zweiten Hinterbeins. HINWEIS: Die Tasche sollte es der Pumpe ermöglichen, leicht hineinzurutschen, aber sie sollte nicht zu viel Platz haben, um sich unter der Haut zu bewegen.</li>
	<li>Mit Hilfe von Gewebezangen nehmen Sie die erste Pumpe zusammen mit dem angeschlossenen Schlauchstück und schieben Sie sie in eine subkutane Tasche. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit der zweiten Pumpe.</li>
	<li>Mit einem Minipumpenhalter, führen Sie eine einzelne osmotische Kanüle mit einer benutzerdefinierten Länge von 3,0 mm in das Loch in der Mittellinie des Kleinhirns gebohrt. Lösen Sie den Kanülenkopf sorgfältig und fixieren Sie die Kanüle sowie die kleine Schraube mit Zahnzement, wobei darauf geachtet wird, das Verbindungsstück für die Schläuche der osmotischen Pumpe nicht zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement, der die Kanüle umgibt, vollständig getrocknet ist, bevor Sie mit der Operation fortfahren.</li>
	<li>Bevor Sie eine Doppelkanüle mit einem Mittel-Zu-Mitte-Abstand von 3,0 mm und einer Sonderlänge von 4,0 mm in die bilateral gebohrten Löcher oberhalb der Basalganglien einsetzen, befestigen Sie zwei kurze Stücke Vinylschläuche (0,5 cm) an den beiden Verbindungsstücken der Doppelkanüle. Verbinden Sie die Vinylschläuche mit einem Bifurkationsadapter und füllen Sie das gesamte Schlauchsystem einschließlich Adapter und Kanüle sorgfältig mit Ouabain-Lösung oder Fahrzeug (Raumtemperatur, vorher steril gefiltert). Dies kann am besten mit einer 1 ml Spritze und einer 27 G Füllkanüle geschehen, die in das einzelne hintere Ende des Bifurkationsadapters eingeführt wird (Abbildung 1B).</li>
	<li>Mit einem Minipumpenhalter die Doppelkanüle vorsichtig in die beidseitigen Löcher einlegen. Verwenden Sie eine Klemme, um den Kanülenkopf zu lösen und die Doppelkanüle mit Zahnzement zu fixieren.</li>
	<li>Schließen Sie die Katheter der osmotischen Pumpen an den Bifurkationsadapter bzw. die einzelne Kanüle an. Stellen Sie sicher, dass die Katheter die Verbindungsstücke der Kanülen fest im Griff haben. HINWEIS: Beide Pumpen haben eine gleiche Durchflussrate, also seien Sie vorsichtig, die osmotische Pumpe mit der doppelkonzentrierten Lösung an den Bifurkationsadapter anzuschließen, um sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration sowohl die Basalganglien als auch das Kleinhirn erreicht.</li>
	<li>Schließen Sie den Schnitt auf dem Rücken der Tiere mit Stichen so weit wie möglich in Richtung des Schädels, wobei Sie darauf achten, die Haut nicht zu überdehnen (Abbildung 1C).</li>
	<li>Subkutan 0,5 ml 0,9% Saline, die Körpertemperatur haben sollte, in eine Hautfalte auf jeder Seite des Rückens der Tiere, um eine Austrocknung der Mäuse zu vermeiden, vorsichtig vermeiden die Pumpen.</li>
</ol>3. Motor Herausforderung
<ol><li>Unterwerfen Sie ouabain- oder fahrzeugdurchlässige Mäuse herausfordernden motorischen Aufgaben als eine Form der leichten Stressexposition 4 h nach der Operation und wiederholen sich danach alle 24 h, um Dystonie-ähnliche Bewegungen zu induzieren. Dies schließt keine Verhaltenscharakterisierung ein. sein Zweck ist es, einen höheren Stresspegel im Vergleich zu normalen Käfighaltung zu induzieren.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf eine 50 cm grobe Holzstange mit einem Durchmesser von 1 cm, Nase nach unten. Stellen Sie sicher, dass die Stange bei Stürzen in einen großen Käfig mit ausreichend Bettwäsche gelegt wird. Es ist nicht notwendig, die Zeit des Abstiegs zu messen, aber achten Sie auf unfreiwillige Hyperextensions der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine von Ouabain-perfundierten Tieren beim Abstieg der Stange präsentiert. Lassen Sie Mäuse den Pol dreimal absteigen und lassen Sie 2 min Erholung zwischen absteigen. HINWEIS: Ouabain-perfused Mäuse sollten erste Symptome wie Bradykinesia 4 h nach der Operation präsentieren. Jedoch, 24 h nach der Operation Mäuse sollten beginnen, unwillkürliche Hyperextensions der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine als Zeichen der Dystonie-ähnliche Bewegungen während des Abstiegs präsentieren.</li>
	<li>Legen Sie für die zweite Motoraufgabe Mäuse wie beim Rotarod-Leistungstest auf die rotierende Stange. Das Rotarod-Gerät wird nicht als Maß für die Latenz verwendet, um zu fallen, das Ziel ist es, Mäuse zwangsweise zu betätigen. Legen Sie die Mäuse dreimal auf den rotierenden Stab und lassen Sie 2 min Erholung zwischen den Tests zu. HINWEIS: Um die Belastungsexposition zu erhöhen, verwenden Sie ein beschleunigendes Rotarod-Gerät. Für das hier beschriebene Projekt beschleunigt die Stange über einen festgelegten Zeitraum von 300 Sek. von 5 auf 50 Umdrehungen pro Minute.</li>
	<li>Lassen Sie die Tiere 30 min zwischen dem Stabtest und dem Rotarod-Leistungstest erholen und noch einmal 30 min, bevor sie für Dystonie-ähnliche Bewegungen punkten, wie unter Protokollschritt 4 beschrieben. Zwischen den sich wiederholenden Spannungsexpositionen können sich Mäuse für 24 h-Intervalle erholen.</li>
</ol>4. Scoring-Systeme zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen
HINWEIS: Der Experimentator sollte für die analysierte Gruppenzuweisung geblendet werden, um Verzerrungen zu verhindern. Die Verhaltenstests, die verwendet werden, um den Phänotyp der Mäuse zu charakterisieren, sind zwei Bewertungssysteme: eine Dystonie-Bewertungsskala mit abnormalen, dystonieähnlichen Bewegungen und eine Verhaltensbewertung mit dem Schwanzsuspensionstest. Bewerten Sie die Dystonie-ähnlichen Bewegungen nach einer Erholungszeit von 30 min nach der Exposition gegenüber leichtem Stress.
<ol><li>Dystonie-Bewertungsskala HINWEIS: Aufgrund des Fehlens vordefinierter Verhaltensaufgaben wurde die Dystonie-Bewertungsskala als beobachterbasiertes Bewertungssystem etabliert, ähnlich wie die klinische Bewertungsskala menschlicher Dystonie. Es ist eine modifizierte Version der Dystonie-Bewertungsskala, die von Calderon et al.13verwendet wird.<ol>
<li>Zeichnen Sie Haltung und Gang von Tieren über einen Zeitraum von 4 min auf, nachdem Tiere in eine Plastik- oder Holzkiste gelegt wurden.</li>
		<li>Ergebnis für Häufigkeit und Verteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen von 0 bis 4 Punkte: (0) normales motorisches Verhalten; (1) abnormes motorisches Verhalten, keine Dystonie-ähnliche Bewegungen; (2) leichte motorische Beeinträchtigung mit leichten fokalen Dystonie-ähnlichen Bewegungen; (3) mäßige motorische Beeinträchtigung mit schweren fokalen Dystonie-ähnlichen Bewegungen; (4) schwere Beeinträchtigung mit anhaltenden, generalisierten Dystonie-ähnlichen Bewegungen (Abbildung 2). Betrachten Sie die folgenden Bewegungen oder Haltungen als Dystonie-like: Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, breite Haltung oder Hyperextension der Hinterbeine sowie Kyphose. Betrachten Sie Dystonie als Fokale für den Fall, dass ein einzelner Körperteil betroffen ist und als verallgemeinert, falls der Rumpf und mindestens zwei andere Körperteile betroffen sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schwanzfederungstest HINWEIS: Der Schwanzsuspensionstest wird häufig verwendet, um das Umklammern der Hinterbeine zu beobachten und zu bewerten. Dies ist jedoch ein sehr unspezifischer Phänotyp, der auf eine motorische Beeinträchtigung hinweist. Das folgende Protokoll schlägt ein Bewertungssystem vor, das speziell für Dystonie-ähnliche Bewegungen spezifisch ist. Aufgrund der Verallgemeinerung der Dystonie bei DYT/PARK-ATP1A3-Patienten sollten Dystonie-ähnliche Bewegungen in vorderen Gliedmaßen, Rumpf und Hinterbeinen beurteilt werden. Ein neu entwickeltes Punktesystem von 0-8 Punkten wurde entwickelt, eine Gesamtpunktzahl < 2 deutete darauf hin, dass keine Dystonie-ähnlichen Bewegungen vorhanden waren (Abbildung 3).<ol>
<li>Nehmen Sie die Maus am Schwanz in der Nähe ihrer Basis und heben Sie das Tier nach oben. Zeichnen Sie ein 2-min-Video des Schwanzsuspensionstests auf und weisen Sie eine Punktzahl in einer anschließenden, gründlichen Analyse der Aufnahme zu.</li>
		<li>Score die vorderen Gliedmaßen von 0 bis 4 Punkte, wo wiederholte oder anhaltende tonische Rückzug von einem oder beiden vorderen Gliedmaßen, sowie eine Hyperextension kombiniert mit Kreuzung der vorderen Gliedmaßen, wurden als Dystonie-like klassifiziert: (0) keine abnormalen Bewegungen; (1) reduzierte Bewegung der vorderen Gliedmaßen mit Hyperextension der Pfoten, die 50 % der aufgezeichneten Zeit gesehen werden; (2) leichte Dystonie-ähnliche Bewegungen der vorderen Gliedmaßen < 50% der aufgezeichneten Zeit; (3) leichte dystonieartige Bewegungen der vorderen Gliedmaßen(n) 50 % der aufgezeichneten Zeit oder schwere < 50 % der aufgezeichneten Zeit; (4) schwere Dystonie-ähnliche Bewegungen der vorderen Gliedmaßen(n) 50 % der aufgezeichneten Zeit. HINWEIS: Hindlimb-Umklammern ist eine abnorme Bewegung, die nicht als Dystonie-ähnlich bewertet werden sollte.</li>
		<li>Erzielen Sie die Hinterbeine von 0 bis 3 Punkten, wobei das Zurückziehen und Klammern der hinteren Gliedmaßen sowie die anhaltende Hyperextension als Dystonie-ähnlich bewertet wurden: (0) keine abnormalen Bewegungen; (1) verminderte Bewegung der Hinterbeine mit Hyperextension der Pfoten, die 50 % der aufgezeichneten Zeit beträgt; (2) Dystonie-ähnliche Bewegungen eines Hinterteils; (3) Dystonie-ähnliche Bewegungen beider Hinterbeine.</li>
		<li>Bei Abschaltverzerrungen > 80% der aufgezeichneten Zeit wird der Punktzahl ein zusätzlicher Punkt hinzugefügt.</li>
		<li>Legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses pharmakologische Mausmodell DYT/PARK-ATP1A3 ermöglicht die detaillierte Analyse inspurenrebraler struktureller und neurochemischer Veränderungen, die ausschließlich durch Hemmung der Natrium-Kalium-Ionenpumpe in den Basalganglien und Kleinhirn sowie Veränderungen im Zusammenhang mit der Stressexposition induziert werden. Bei Mäusen können maximal zwei osmotische Pumpen subkutan implantiert werden. Wir stellen hierin eine Methode vor, die die chronische Medikamentenabgabe an mehrere Gehirnstrukturen detailliert aufführt, indem wir eine Doppelkanüle implementieren, die zusätzlich zu einer einzigen Kanüle mit einem Bifurkationsadapter verbunden ist. Diese Methode kann für jede Anwendung verwendet werden, bei der mehrere Gehirnstrukturen gleichzeitig und chronisch durchsetzt werden müssen.
Wir präsentieren ein Mausmodell einer seltenen Bewegungsstörung, bei der Patienten nach der Exposition gegenüber Stress dauerhafte Symptome entwickeln. Diese vermutete Gen-Umwelt-Interaktion ist immer noch nicht gut verstanden, könnte aber einen der wichtigsten Pathomechanismen in der DYT/PARK-ATP1A3-Entwicklung darstellen. Verschiedene Methoden, um Mäuse Stress auszusetzen, wurden in der Vergangenheit veröffentlicht und umfassen elektrische Fußschläge, Zurückhaltung, kalte oder warme Umgebung und die Exposition gegenüber verschiedenen Gerüchen11,12,13. In dem Bestreben, Mäuse einem milden Stressfaktor mit translationarischem Wert auszusetzen, beschreiben wir hier die sich wiederholende Unterwerfung von Mäusen unter herausfordernde motorische Aufgaben. Für den Pole-Test ergaben Ouabain-perfundierte Tiere eine unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine. Diese Bewegungen waren den Dystonie-ähnlichen Bewegungen, die während der 4-min-Videoaufzeichnung der Tiere beobachtet wurden, sowie dem Schwanzsuspensionstest sehr ähnlich. Die Anwendung von leichtem Stress in Form von herausfordernden motorischen Aufgaben könnte sich in anderen Mausmodellen als nützlich erweisen, die motorische Symptome oder Neurodegeneration zeigen, wo Gen-Umwelt-Wechselwirkungen den Grad des Krankheitsverlaufs massiv beeinflussen.
Es gibt einen allgemeinen Mangel an vordefinierten Verhaltensaufgaben sowie Bewertungsskalen, um abnorme Bewegungen und Haltungen bei Mäusen zu klassifizieren. Die meisten verfügbaren motorischen Aufgaben zeigen unspezifische Anomalien, wie z. B. das Umklammern von Hinterbeinern, das in vielen Mausmodellen von Bewegungsstörungen mit Neurodegeneration18,19bekannt ist. Für die richtige Charakterisierung eines Phänotyps ist es jedoch notwendig zu analysieren, ob das Mausmodell die wichtigsten Merkmale der Krankheit rekapituliert. Hierin stellen wir die modifizierte Version einer Dystonie-Bewertungsskala vor, die zuvor für die Beurteilung von motorischen Behinderungen in Dystonie-Mausmodellen15,16verwendet wurde. Zusätzlich haben wir ein beobachterbasiertes Bewertungssystem für den Schwanzsuspensionstest entwickelt, das ähnlich wie die klinischen Bewertungsskalen menschlicher Dystonie etabliert wurde. Beide Bewertungsskalen zeigen eine deutlich höhere Punktzahl bei ouabain-perfused, gestressten Mäusen im Vergleich zu Ouabain-perfused, nicht-gestressten Tieren sowie fahrzeugdurchlässigen Tieren. Die Nachteile eines beobachterbasierten Bewertungssystems sind die notwendige Schulung von Bewertern, um eine konsistente Bewertung zu gewährleisten und die Variabilität der Beobachter zu verringern, sowie die Gefahr einer möglichen Verzerrung des Bewerters, wenn sie nicht vollständig für die analysierte Gruppe geblendet wird. Beobachter-basierte Bewertungssysteme stellen jedoch nach wie vor eine leicht zugängliche Methode zur Charakterisierung eines Phänotyps dar und können an das analysierte Mausmodell angepasst werden, wie es im vorliegenden Projekt zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen der Fall ist. Um eine konsistente Bewertung zwischen verschiedenen Ratern zu gewährleisten, sollten Schulungsvideos zur Verfügung gestellt werden. Um mögliche Verzerrungen zu reduzieren, wird empfohlen, dass verschiedene Rater die gleichen Videoclips bewerten und dass die einzelnen Partituren gemittelt werden. Beide in dieser Arbeit erwähnten Bewertungssysteme zeichnen das Vorhandensein von Dystonie-ähnlichen Bewegungen bei Tieren auf. Die Bewertungsskalen können an die spezifischen Anforderungen innerhalb eines Projekts angepasst werden, wie zuvor von Ip et al. durchgeführt, wo nur die Hinterbeine für Dystonie-ähnliche Bewegungen in einem Mausmodell für Dystonie 1 (DYT-TOR1A)20bewertet wurden. Die Bewertungsskala kann durch andere zuvor veröffentlichte Bewertungssysteme ergänzt werden, die beispielsweise den Grad der Bradykinesie bei Nagetieren bewerten, wie es mit dem Lokomotion-Behinderungs-Score von Calderon et al.13der Fall ist.

Die Vorteile einer kontinuierlichen Medikamentenabgabe direkt ins Gehirn sind zahlreich. Wiederholte und häufige Injektionen, die einen unnötigen Stressfaktor für Tiere darstellen, können vermieden und eine konstantere intracerebrale Konzentration des Medikaments erreicht werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn systemisch verabreichte Medikamente nicht leicht in die Blut-Hirn-Schranke eindringen. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Medikamentenabgabe über osmotische Pumpen die lokalisierte Abgabe von Substraten, die ansonsten systemweite Nebenwirkungen haben würden. Die Medikamente können gezielt an die gewünschten Hirnstrukturen abgegeben werden, so kann die resultierende Wirkung direkt nachverfolgt werden. Dies kann für eine Reihe von Anwendungen verwendet werden, wie die Untersuchung von therapeutischen Wirkungen sowie die Untersuchung von Pathomechanismen. Diese letzte Anwendung wurde im Projekt hierin verwendet, um ein pharmakologisches Mausmodell für Dystonie zu erstellen.
Die Analyse und das Verständnis von dystonischen Syndromen, die die dritthäufigste Bewegungsstörung darstellen, wurden stark durch die Tatsache eingeschränkt, dass genetische Tiermodelle den Krankheitsphänotyp, der sowohl bei kranken Menschen als auch in der Pathophysiologie vorkommt, weitgehend nicht reproduzieren. Dieses Problem beschränkt sich nicht auf dystonische Syndrome, sondern betrifft in der Tat viele transgene Nagetiermodelle im Bereich der Bewegungsstörungen1,2. Der Grund für das Fehlen eines Phänotyps in transgenen Nagetiermodellen könnte auf hochwirksamenKompensationsmechanismen3 basieren. Im Falle von Dystonie ist die Krankheit durch unwillkürliche Muskelkontraktionen gekennzeichnet, die verdrehende Bewegungen und abnorme Haltungenverursachen 4. Die Untersuchung der sekundären Ursachen (d.h. Hirnverletzungen) von dystonischen Symptomen hat dazu beigetragen, die Strukturen zu identifizieren, die an der Manifestation dieser motorischen Anomalien beteiligt sind, wie die Basalganglien5. Hirnbildgebungsstudien von erblichen Formen der Dystonie haben funktionelle Anomalien in fast allen Hirnregionen gezeigt, die für die motorische Steuerung und sensorimotorische Integration verantwortlich sind6,7. Nagetiermodelle sind jedoch immer noch notwendig, um das Verständnis der neuronalen Funktionsstörungen auf molekularer und großflächiger Netzwerkebene sowie für die Entwicklung therapeutischer Optionen zu vertiefen. Hier bieten pharmakologische Mausmodelle die Möglichkeit, die klinischen und pathologischen Merkmale einer Krankheit präziser zu replizieren.
Schnelleinfalldystonie-Parkinsonismus (DYT/PARK-ATP1A3; EPEP; DYT12) ist eine der erblichen Formen der Dystonie. Es wird durch Funktionsverlustmutationen im ATP1-3-Gen verursacht, das für die Untereinheit 3 der Na+/K+-ATPase8kodiert. Darüber hinaus wird anerkannt, dass Genmutationsträger jahrelang frei von Symptomen sein können, bevor sie nach der Exposition gegenüber einem stressigen Ereignis eine akut generalisierte Dystonie und Parkinsonentwickeln entwickeln. Tatsächlich ist die Penetranz von DYT/PARK-ATP1A3 unvollständig und belastende Ereignisse, die als Auslöser fungieren, reichen von körperlicher Überanstrengung und extremen Temperaturen bis hin zu übermäßigem Alkoholkonsum und Infektionen9,10. Um DYT/PARK-ATP1A3 zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu finden, wurde mehrfach versucht, die stressabhängige Krankheitsentwicklung in Nagetiermodellen nachzuahmern. Abgesehen von dem bestehenden genetischen DYT/PARK-ATP1A3-Mausmodell, bei dem vorübergehende abnormale und krampfartige Bewegungen durch Unterkühlung induziert wurden, haben alle veröffentlichten genetischen Mausmodelle für DYT/PARK-ATP1A3 keine dystonischen Symptome1,11,12erzeugt. Calderon et al. hatten zuvor gezeigt, dass die bilaterale Blockierung der Untereinheit 3 in den Basalganglien und im Kleinhirn über das Herzglykosid-Ouabain bei Wildmäusen zu einer leichten Gangstörung führt13. Die zusätzliche Exposition gegenüber elektrischen Fußschocks in einer warmen Umgebung führte zu einem dystonischen und bradykinetischen Phänotyp, was zeigt, dass chronische und gezielte Perfusion von Ouabain gefolgt von Stress den DYT/PARK-ATP1A3-Phänotyp erfolgreich imitiert.
Jedoch, Exposition der Tiere zu elektrischen Fußschocks in einer warmen Umgebung von 38-40 °C über einen Zeitraum von zwei Stunden induziert Schmerzen und Angst bei Tieren, die verwirrende Faktoren darstellen, insbesondere für die Beurteilung von Veränderungen im Katecholamin-System im Zusammenhang mit der Entwicklung von Dystonie. So beschreiben wir hierin eine andere Art von Stressparadigma mit hohem Translationswert, was auf die Tatsache zurückgeht, dass leichte bis mäßige Bewegung als Auslöser bei DYT/PARK-ATP1A3-Patienten beschrieben wurde9. Darüber hinaus ist repetitive Übung ein bekannter Auslöser für fokale Dystonie14. Mäuse wurden immer wieder anspruchsvollen motorischen Aufgaben unterzogen, die aus drei Absteigen eines Holzpfahls ("Poltest") und drei Läufen auf einem Rotarod-Gerät ("Rotarod-Leistungstest") bestanden. Die Platzierung der Tiere auf der Oberseite eines 50 cm großen Holzpfahls wurde verwendet, um die Tiere zum Abstieg zu zwingen, das Rotarod-Gerät wurde eingesetzt, um Mäusen Zwangsaktivität zu unterwerfen, indem sie sie auf eine rotierende Stange legten.
Die Charakterisierung des motorischen Phänotyps eines Mausmodells für Dystonie ist aufgrund des Fehlens vordefinierter Tests und Ergebnisse besonders anspruchsvoll. Allerdings wurde in den letzten Jahren wiederholt eine Variante einer Motorbehinderungsbeurteilung verwendet, um die Schwere und Verteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen bei Nagetieren13,15,16zu bewerten. Wir stellen hierin eine modifizierte Version der Dystonie-Bewertungsskala vor, die sich bei der Bewertung des Dystonie-ähnlichen Phänotyps von Tieren als wirksam erwiesen hat, wenn sie über einen Zeitraum von vier Minuten beobachtet wird. Als zweite Methode zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen präsentieren wir ein neu entwickeltes Bewertungssystem zur Beurteilung abnormaler Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Es ermöglicht die Beurteilung der Häufigkeit und Dauer von Dystonie-ähnlichen Bewegungen und Haltungen der vorderen Gliedmaßen, Hinterbeine sowie Rumpf.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Salzlösung</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>PZN06178437</td></tr><tr><td>Alzet osmotische Pumpen</td><td>Durect</td><td>4317</td><td>Modell 1002, Durchflussmenge 0,25 &mu; L/h</td></tr><tr><td>Ankerschrauben</td><td>AgnTho's</td><td>MCS1x2</td><td>2 mm lang mit einem Gewinde von 1mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Bulldog Clamps</td><td>AgnTho's</td><td>13-320-035</td><td>gerade, 3,5 cm</td></tr><tr><td>Bupivacain 0,25% Jenapharm</td><td>mibe GmbH Arzneimittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanüle und Minipumpe Halter</td><td>Stoelting Co.</td><td>51636</td><td>für die Aufnahme von 3,4 mm Kanülenköpfen</td></tr><tr><td>Kanülenbifurkation</td><td>Kunststoffe One</td><td>21Y</td><td>maßgefertigte</td></tr><tr><td>Kanülenschläuche</td><td>Kunststoffe One</td><td>C312VT/PKG</td><td>Vinyl, 0,69 mm x 1,14 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>feine Pinzette</td></tr><tr><td>Augencreme Bepanthen</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesiemaske für Stereotaxie, Mouse</td><td>Stoelting Co.</td><td>56109M</td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit</td><td>Foredom</td><td>K.1070-2</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran CP 1 mL/ml, 250 mL</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>verschreibungspflichtig</td></tr><tr><td>Isofluran-System Dr&auml; ger Vapor 19.3</td><td>Dr. Wilfried M&uuml; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>Dentalzement, flüssig</td></tr><tr><td>Kallocryl CPGM rot</td><td>Speiko</td><td>1692</td><td>Dentalzement, rotes Pulver</td></tr> Maus <tr><td>und Neugeborene Adapter</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Adapter für Mäuse für einen herkömmlichen U-Rahmen-Nadelhalter</td></tr><tr><td></td><td>KLS Martin Group</td><td>20-526-14</td><td></td></tr><tr><td>Nicht reißende Ohrbügel und Gummispitzen f/ Maus Stereotaxic</td><td>Stoelting Co.</td><td>51649</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Osmotic Pump Connector Kanüle für Mäuse, doppelt</td><td>Kunststoff One</td><td>3280PD-3.0/SPC</td><td>28 Gauge, Länge 4,0 mm, c/c Abstand 3,0 mm</td></tr><tr><td>Osmotic Pump Connector Kanüle für Mäuse, einfach</td><td>Plastics One</td><td>3280PM/SPC</td><td>28, Gauge, benutzerdefinierte Länge 3,0 mm</td></tr><tr><td>Ouabain Oktahydrat 250 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03125-250MG</td><td>ACHTUNG: giftig</td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>Kern & Sohn</td><td>PFB 6000-1</td><td></td></tr><tr><td>Rektale Wärmesonde</td><td>Stoelting Co.</td><td>50304</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/ml, injizierbar</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofen, verschreibungspflichtig</td></tr><tr><td>Nagetierwärmer X1 mit Maus-Heizkissen</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>RotaRod Advanced</td><td>TSE Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schraubendreher-Set</td><td>AgnTho's</td><td>30090-6</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Fräser</td><td>AgnTho's</td><td>HM71009</td><td>0,9 mm &Oslash; Fräser</td></tr><tr><td>Edelstahl-Fräser</td><td>AgnTho's</td><td>HM71014</td><td>1,4 mm &Oslash; Fräser</td></tr><tr><td>StereoDrive</td><td>Neurostar</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td>Sonderanfertigung von Neurostar</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Roboter</td><td>Neurostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naht: beschichtetes Vicryl, Polyglatin 910</td><td>Ethicon</td><td>V797D</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf AG</td><td>5382000015</td><td></td></tr></tbody></table>

implantation von osmotischen pumpen und induktion von stress zur etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen mausmodells für dyt/park-atp1a3 dystonie

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Genetisch veränderte Mausmodelle sind mit Einschränkungen konfrontiert, insbesondere bei der Untersuchung von Bewegungsstörungen, bei denen die meisten verfügbaren transgenen Nagetiermodelle keinen motorischen Phänotyp aufweisen, der den klinischen Aspekten der menschlichen Krankheit ähnelt. Pharmakologische Mausmodelle ermöglichen eine direktere Untersuchung der Pathomechanismen und ihrer Wirkung auf den Verhaltensphänotyp. Osmotische Pumpen, die mit Hirnkanülen verbunden sind, eröffnen die Möglichkeit, pharmakologische Mausmodelle über lokale und chronische Medikamentenabgabe zu erstellen. Für die erbliche Bewegungsstörung des schnell aufgehenden Dystonie-Parkinsonismus kann die Funktionsverlustmutation in der Untereinheit 3 des Na+/K+-ATPase durch eine hochspezifische Blockade über das Glykosid-Ouabain simuliert werden. Um die Untereinheit 3 in den Basalganglien und dem Kleinhirn lokal zu blockieren, die beiden Hirnstrukturen sind, von denen angenommen wird, dass sie stark an der Pathogenese des schnell aufgehenden Dystonie-Parkinsonismus beteiligt sind, wird eine bilaterale Kanüle stereotaxisch in das Striatum implantiert und eine zusätzliche Einzelkanüle in das Kleinhirn eingeführt. Die Kanülen sind über Vinylschläuche mit zwei osmotischen Pumpen verbunden, die subkutan auf dem Rücken der Tiere implantiert werden und die chronische und präzise Abgabe von Ouabain ermöglichen. Das pharmakologische Mausmodell für schnell auftretende Dystonie-Parkinsonismus hat den zusätzlichen Vorteil, die klinischen und pathologischen Merkmale asymptomatischer und symptomatischer Mutationsträger zu rekapitulieren. Genau wie Mutationsträger des schnell aufgesetzten Dystonie-Parkinsonismus entwickeln die ouabain-perfundierten Mäuse dystonieartige Bewegungen erst nach zusätzlicher Belastung. Wir demonstrieren ein leichtes Stressparadigma und führen zwei modifizierte Bewertungssysteme für die Beurteilung eines Motorphänotyps ein.

Abbildung 4 wurde von Rauschenberger et al.17geändert. Für die Datenanalyse sowohl der Dystonie-Bewertungsskala (A) als auch des Schwanzsuspensionstests (B) wird die Gesamtpunktzahl für jeden Zeitpunkt für jedes Tier berechnet. Der Mittelwert jedes Zeitpunkts und jeder Gruppe sollte in einem entsprechenden Diagramm dargestellt werden. Die Verteilung der Werte sollte untersucht und der entsprechende statistische Test zur Bestimmung der Signifikanz angewandt werden. Bei einer ausreichenden Anzahl von Tieren kann ein motorischer Phänotyp sowohl mit der Dystonie-Bewertungsskala als auch mit der Beurteilung abnormaler Bewegungen im Schwanzsuspensionstest nachgewiesen werden. Der Dystonie-ähnliche Phänotyp wird durch den signifikant höheren motorischen Score in beiden Bewertungen in der ouabain-perfused, gestressten Gruppe im Vergleich zu Ouabain-perfused, nicht-gestressten Mäusen sowie den Kontrollmäusen nachgewiesen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Die wichtigsten chirurgischen Schritte für kanülatische und osmotische Pumpenimplantation. (A) Für die angegebenen Koordinaten müssen beidseitig Löcher für die doppelkanüle, die für die Basalganglien und für die an der Mittellinie des Kleinhirns platzierten Einzelkanüle platziert ist, gebohrt werden. Die beiden voll konstruierten osmotischen Pumpen sind auf jeder Seite des Tieres dargestellt. (B) Das Bild zeigt eine implantierte, einzelne Kanüle in das Kleinhirn, fixiert mit Zahnzement. Die Doppelkanüle für die Basalganglien sollte vor der Implantation mit dem Bifurkationsadapter verbunden und mit Ouabain vorgefüllt werden. (C) Bild des fertigen Verfahrens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Abbildung 2: Bewertung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen mit einer Dystonie-Bewertungsskala. Während eines 4 min Video wurden Dystonie-ähnliche Bewegungen basierend auf Körperverteilung und Dauer bewertet. Eine unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, eine breite Haltung oder Hyperextension von Hinterbleibssowie sowie Kyphose wurden als Dystonie-ähnlich eingestuft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Abbildung 3: Bewertung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Das neu entwickelte Scoring-System für abnorme Bewegungen während eines 2 min Schwanzsuspensionstests bewertet Dystonie-ähnliche Bewegungen in vorderen Gliedmaßen, Hinterbeinen und Rumpf von insgesamt 0-8 Punkten. Für die vorderen Gliedmaßen qualifizieren sich eine Hyperextension und Kreuzung der vorderen Gliedmaßen sowie eine tonische Flexion zum Rumpf als Dystonie-ähnlich. Für die Hinterbeine wurde die unfreiwillige Hyperextension sowie der Rückzug mit Verlängerung über die Mittellinie als Dystonie-ähnlich gewertet. Eine Verzerrung über 80% der aufgezeichneten Zeit wurde mit einem Punkt erzielt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Graphiken der Dystonie-Rating-Skala und des Schwanzsuspensionstests. (A) Die Grafik zeigt die Dystonie-Bewertungsskala für NaCl-perfused, gestresste Mäuse (gepunktete schwarze Linie), Ouabain-perfused, nicht-stressed Mäuse (gepunktete orange Linie) und Ouabain-perfused, gestresste Mäuse (dunkelblaue Linie). Für jeden Zeitpunkt werden die Mittelwerte des Mittelwerts (SEM) angezeigt. (B) Das Diagramm zeigt die Beurteilung abnormaler Bewegungen während eines 2-min Schwanzsuspensionstests für NaCl-perfused, gestresste Mäuse (gepunktete schwarze Linie), Ouabain-perfused, nicht-stressed Mäuse (gepunktete orange Linie) und Ouabain-perfused, gestresste Mäuse (dunkelblaue Linie). Statistische Auswertungen wurden für die Dystonie-Bewertungsskala und die Testbewertung der Schwanzsuspension mit dem zweischwänzigen Mann-Whitney-Test durchgeführt. Die Bonferroni-Holm-Korrektur () der p-Werte zeigte einen signifikanten Unterschied für den Beobachtungszeitraum von 72 h. Dunkelblau * bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen Ouabain-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfused, nicht-gestressten Mäusen, schwarz * bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen NaCl-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfused, gestressten Mäusen sowie zwischen NaCl-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfundierten, nicht-gestressten Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir bieten ein Protokoll zur Erzeugung eines pharmakologischen DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie-Mausmodells über die Implantation von Kanülen in Basalganglien und Kleinhirn, das mit osmotischen Pumpen verbunden ist. Wir beschreiben die Induktion von Dystonie-ähnlichen Bewegungen durch Anwendung einer motorischen Herausforderung und die Charakterisierung des Phänotyps über Verhaltens-Scoring-Systeme.

Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Verfahren zu beschreiben, die bei der Erstellung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3-Dystonie durch den Einsatz von Hirnkanülen in osmotischen Pumpen und durch die Induktion von Stress durch herausfordernde motorische Aufgaben involviert sind. Diese Methode beschreibt, wie man ein pharmakologisches Mausmodell mit chronischer Medikamentenabgabe über osmotische Pumpen an mehrere Gehirnkanülen erstellt und wie man den Phänotyp durch herausfordernde motorische Aufgaben induziert. Das Paradigma des milden motorischen Stresses gibt auch Einblicke in die Rolle von Gen-Umwelt-Wechselwirkungen bei Bewegungsstörungen und kann auf andere Nagetiermodelle angewendet werden.Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den geltenden nationalen und institutionellen Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der osmotischen Pumpen in einer sterilen Umgebung. Füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27 Gauge Füllkanüle mit steriler gefilterter Ouabain-Lösung oder Fahrzeuglösung.Halten Sie die osmotische Pumpe in aufrechter Position, legen Sie die Kanüle bis zur Pumpe ein und füllen Sie das Reservoir langsam, bis eine überschüssige Lösung oben erscheint. Fügen Sie als Nächstes den Strömungsmoderator in die Pumpe ein. Nehmen Sie vorsichtig den weißen Flansch des Flow-Moderators mit einer Schere ab und verbinden Sie ein Stück Vinylschlauch mit dem Flow-Moderator.Jede Pumpe in Eppendorf-Rohre untertauchen, die auf halbem Weg mit einer Salinelösung gefüllt sind, und legen Sie sie in einen Thermocycler um 37 Grad, um sicherzustellen, dass die Pumpleistung vor Beginn der Operation einen stabilen Zustand erreicht. Nachdem das Tier nach zugelassenen Protokollen tief beäpft iert wurde, legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und fixieren Sie den Kopf mit Gummispitzen oder nicht gebrochenen Ohrstangen. Nach gründlicher Desinfektion des Operationsbereichs verwenden Sie ein Skalpell, um den Schnitt an der Oberseite des Kopfes zu platzieren und verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt bis zu den Vorderteilen fortzusetzen.Den Schädel mit Hilfe von Bulldoggenklemmen aussetzen und das Periost mit einem sterilen, mit Baumwolle gekippten Applikator abwischen. Richten Sie entweder einen Stift oder die Spitze eines in schwarzer Tinte gefärbten Kanülen mit Bregma aus und verwenden Sie die entsprechenden Koordinaten, um die drei Einstiegspunkte für die Hirnkanülen auf dem Schädel zu markieren. Als nächstes bohren Sie sorgfältig die Löcher für den Doppelkanülen, der für die Basalganglien und die für das Kleinhirn vorgesehene Einzelkanüle bestimmt ist.Bohren Sie ein viertes Loch für eine kleine Schraube zwischen dem Striatum und dem Kleinhirn. Diese Schraube wird schließlich in Zahnzement eingebettet und bieten zusätzlichen Halt für die Kanülen. Um eine kleine Tasche für die osmotische Pumpe auf jeder Seite des Tieres zurück zu schaffen, verwenden Sie Gewebezange, um die subkutanen Gewebeschichten zu trennen.Bewegen Sie die Zange auf ein Hinterbein und öffnen Sie die Zange leicht, um die subkutane Tasche zu erweitern. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite, zuerst entfernen Sie die Zange aus dem Schnitt und schieben Sie sie dann sanft in Richtung des zweiten Hinterbeins. Mit Hilfe von Zangen, legen Sie die Pumpen und den angeschlossenen Katheter sorgfältig in jede subkutane Tasche.Die Tasche sollte es der Pumpe ermöglichen, leicht einzurutschen. Mit einem Mini-Pumpenhalter, führen Sie eine einzelne osmotische Kanüle mit einer benutzerdefinierten Länge von 3,0 Millimetern in das Loch in der Mittellinie des Kleinhirns gebohrt. Lösen Sie den Kanülenkopf sorgfältig und fixieren Sie die Kanüle sowie die kleine Schraube mit Zahnzement, wobei darauf geachtet wird, das Verbindungsstück für die Schläuche der osmotischen Pumpe nicht zu bedecken.Stellen Sie sicher, dass der Zahnmannzement, der die Kanüle umgibt, vollständig getrocknet ist, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Bevor Sie die Doppelkanüle in die bilateral gebohrten Löcher oberhalb der Basalganglien einsetzen, befestigen Sie zwei 0,5 Zentimeter lange Vinylschläuche an den beiden Verbindungsstücken der Doppelkanüle. Verbinden Sie die Vinylschläuche mit einem Bifurkationsadapter und füllen Sie das gesamte Schlauchsystem sorgfältig mit steriler Ouabain-Lösung oder Fahrzeug aus.Wiederholen Sie als Nächstes die gleichen Schritte wie zuvor für die einzelne Kanüle gezeigt und enden, indem Sie die Doppelkanüle mit Zahnzement fixieren. Schließen Sie die Katheter der osmotischen Pumpen an den Bifurkationsadapter bzw. eine einzelne Kanüle an. Beide Pumpen haben eine gleiche Durchflussrate, also achten Sie darauf, die osmotische Pumpe mit einer doppelt konzentrierten Lösung an den Bifurkationsadapter zu verbinden, um sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration sowohl die Basalganglien als auch das Kleinhirn erreicht.Schließen Sie den Schnitt auf dem Rücken der Tiere so weit wie möglich mit Stichen, ohne die Haut zu überdehnen. Subkutan einjizieren Sterile Saline, die Körpertemperatur haben sollte, um Austrocknung zu vermeiden. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in den Bergungskäfig.Um Dystonie-ähnliche Bewegungen zu induzieren, sollten Ouabain-perfundierte Mäuse vier Stunden nach der Operation und alle 24 Stunden wiederholt herausfordernden motorischen Aufgaben als mildes Stressparadigma ausgesetzt werden und sich alle 24 Stunden wiederholen. Dies schließt keine Verhaltenscharakterisierung der Tiere ein. Wir zeigen hier das Beispiel eines fahrzeugdurchlässigen Tieres, das auf einen 50 Zentimeter rauen Holzpfahl mit nach unten gerichteter Nase platziert wird.Geben Sie bei Stürzen genügend Bettwäsche an der Basis der Stange an. Bei ouabain-perfused Mäusen sollten die Tiere beginnen, erste Symptome wie Bradykinesie n. Chr. vier Stunden nach der Operation zu zeigen. Jedoch, 24 Stunden nach der Operation, sollten Sie unwillkürliche Hyperextension der vorderen oder hinteren Gliedmaßen als Zeichen von Dystonie-ähnliche Bewegungen während des Abstiegs sehen.Die Mäuse sollten den Pol dreimal absteigen, mindestens zwei Minuten Erholung zwischen jedem Abstieg ermöglichen. Die Zeit des Abstiegs muss nicht gemessen werden. Auf die Stabprüfung sollte eine zweite Motoraufgabe mit einer rotierenden Stange folgen.Wie beim Rotarod-Leistungstest werden die Ouabain- und Fahrzeugmäuse aus den Belastungsgruppen auf den rotierenden Stab gelegt. Die Latenz zu fallen muss nicht gemessen werden. Wie beim vorherigen Test sollten Mäuse dreimal auf den rotierenden Stab gelegt werden, so dass zwischen den Läufen zwei Minuten Erholung möglich sind.Die modifizierte Dystonie-Bewertungsskala kann verwendet werden, um die Häufigkeit, schwere und Körperverteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen von Mäusen zu bewerten. Die Tiere sollten in einer Plastik- oder Holzkiste untergebracht werden und Bewegungen sollten für einen Zeitraum von vier Minuten aufgezeichnet werden. Die Bewerter sollten für die Gruppenzuweisung geblendet werden.Bewegungen oder Haltungen, die als Dystonie-ähnlich angesehen werden, sind die unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, eine breite Haltung, oder Hyperextension der Hinterbeine, sowie Kyphose. Wenn nur ein Körperteil betroffen ist, sollte Dystonie als fokal betrachtet werden. Wenn der Stamm und mindestens zwei andere Körperteile betroffen sind, sollte Dystonie als verallgemeinert betrachtet werden.Ein zweites neu entwickeltes Punktesystem von null auf acht Punkte bewertet das Vorhandensein und die Schwere von Dystonie-ähnlichen Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Halten Sie für den Test die Maus am Schwanz in der Nähe ihrer Basis für zwei Minuten hoch. Es wird empfohlen, den Schwanzfederungstest aufzuzeichnen und der nachfolgenden Analyse des Filmmaterials eine Punktzahl zuzuweisen.Die vorderen Gliedmaßen werden von null auf vier Punkte erzielt. Wiederholte oder anhaltende Tonic-Retraktionen eines der beiden vorderen Gliedmaßen, sowie die Hyperextension kombiniert mit der Kreuzung der vorderen Gliedmaßen werden als Dystonie-like bewertet. Dystonie-ähnliche Bewegungen der Hinterbeine, d.h. Rückzug und Klammern, sowie anhaltende Hyperextension werden von null auf drei Punkte erzielt.Eine Abgeschnittene Verzerrung, die über 80 % der aufgezeichneten Zeit vorliegt, wird mit einem zusätzlichen Punkt bewertet. Hintere Gliedmaßenumschlüsse sind unspezifische Zeichen für motorische Beeinträchtigung und sollten nicht bewertet werden. Diese Grafik zeigt die Ergebnisse der Dystonie-Bewertungsskala.Die ouabain-perfused gestressten Mäuse zeigen deutlich mehr Dystonie-ähnliche Bewegungen über einen Beobachtungszeitraum von 72 Stunden als die nicht-Stress-Ouabain-perfused Gruppe, sowie die Fahrzeugtiere. Dieses Bild zeigt die Ergebnisse des Schwanzsuspensionstests und zeigt ein ähnliches Ergebnis wie die Dystonie-Bewertungsskala. Beachten Sie, dass die Ergebnisse des Mittelwerts aus der Gesamtpunktzahl jedes Tieres für jeden Zeitpunkt.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Gehirnkanülen stereotaxisch implantieren und wie Sie subkutan osmotische Pumpen implantieren können. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass repetitive und stressige Injektionen vermieden werden können und dass ein Substrat wie Ouabain, das sonst systemweite Nebenwirkungen hätte, direkt an eine bestimmte Hirnstruktur abgegeben werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zur Verabreichung von Neurotherapeutika mit einer osmotischen Pumpe in einem demyelinisierten Mausmodell. Die kontrollierte Wirkstofffreisetzung fördert die Remyelinisierung, indem sie myelinproduzierende Zellen im Corpus callosum aktiviert.

 Osmotische Pump-basierte neurotherapeutische Wirkstoffabgabe in einem demyelinisierten Mausmodell

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Um die Reorganisation des Gehirns unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, haben wir miniosmotische Pumpen für die direkte Proteinabgabe ins Gehirn verwendet, wobei die Blut-Hirn-Schranke umgangen wird. Anschließend werden Tract Tracer injiziert, um Veränderungen in der Gehirnkonnektivität unter dem Einfluss des Proteins zu untersuchen.

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren

Das kostengünstige Protokoll bestehend aus Footprint Analysen und hängen-Box-Test nach Zurückhaltung Stress nützlich ist für die Bewertung der Bewegungsstörungen des Mausmodells.

Low-Cost-Protokoll der Footprint Analysen und hängen-Box-Test für Mäuse angewendet die chronische Zurückhaltung Stress

Die chronische Verabreichung von Isoproterenol über eine implantierte osmotische Pumpe wurde weit verbreitet verwendet, um fortgeschrittene Herzinsuffizienz bei Mäusen zu imitieren. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden der chirurgischen Mini-Pump-Implantation für die kontinuierliche Isoproterenol-Verabreichung über 3 Wochen sowie die echokardiographische Beurteilung der erfolgreichen Modellerstellung.

Implantation einer Isoproterenol Mini-Pumpe zur Induzieren von Herzinsuffizienz bei Mäusen

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Induktion von Modellen des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS) bei Mäusen durch kontrollierte Letrozolfreisetzung mit Minipumpen vor. Unter adäquater Anästhesie wurde die Minipumpe subkutan implantiert, und PCOS wurde bei den Mäusen nach einer bestimmten Zeit der Freisetzung der Minipumpe erfolgreich induziert.

Eine modifizierte Technik zur Induktion des polyzystischen Ovarialsyndroms bei Mäusen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Magnetic Resonance Imaging (MRI) ist ein zunehmend beliebtes Werkzeug für die Prüfung der Phänotyp genetisch veränderten Mäusen. Dieser Artikel beschreibt die Methoden notwendig, um High-Throughput-Phänotypisierung von genetisch veränderten Mäusen mit Multiple-Maus MRT zu erreichen.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Die Speiseschaltung in Drosophila melanogaster-Larven serviert ein einfaches aber leistungsstarkes Modell, das Änderungen in der Zuführungsrate, mit Veränderungen in der neuronalen Schaltkreise stomatogastrischen korreliert werden können. Diese Schaltung wird der zentrale serotonerge Neuronen, die Projektionen auf die Mundhaken sowie die Vorderdarm senden zusammen.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

Lernen Sie die Implantation von osmotischen Pumpen und Hirnkanülen zur Etablierung eines pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3-Dystonie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Bewegungsstörungen durch chronische Arzneimittelgabe.

Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie (Video) | JoVE Journal

Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie

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