Genetischer Variantennachweis im CALR-Gen mittels hochauflösender Schmelzanalyse

Diese Methode definiert Calreticulin-Mutationen bei Patienten mit Verdacht auf hämatologische Erkrankungen, insbesondere wenn andere diagnostische Optionen begrenzt sind oder es eine Überschneidung mit nicht-hämatologischen Erkrankungen gibt. Der Hauptvorteil der hochauflösenden Spiegeltechnik besteht darin, die gemeinsamen somatischen genetischen Varianten in der Hotspot-Region des Calreticulin-Gens an der akzeptablen Nachweisgrenze und zu erschwinglichen Kosten zu detektieren. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und nicht-invasive Diagnose von myeloproliferativen Erkrankungen, insbesondere von essentieller Thrombozythämie und primärer Myelofibrose.

Derzeit hat es keinen Einfluss auf die Wahl der Therapie bei diesen Patienten. Dies kann sich jedoch in Zukunft ändern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des qPCR-HRM-Mastermixes, wie im Textmanuskript beschrieben, und stellen Sie genug für drei Replikate jeder DNA-Probe und Kontrolle her.

Mischen Sie den Reaktionsinhalt, indem Sie das Röhrchen vorsichtig abklopfen und umdrehen und zwei bis drei Sekunden lang vortexen, dann drehen Sie das Röhrchen kurz, um die verstreuten Tröpfchen aufzufangen. Übertragen Sie 19 Mikroliter des qPCR HRM-Mastermixes in jede Vertiefung der optischen 96-Well-Reaktionsplatte. Pipettieren Sie einen Mikroliter der Negativkontrollen, Positivkontrollen und Proben in die entsprechenden Vertiefungen der Platte für die No-Template-Kontrolle oder NTC mit einem Mikroliter steriler RNAs und des freien DNA-Wassers, das zur Herstellung des qPCR-HRM-Mastermixes anstelle der DNA verwendet wird.

Verschließen Sie die Reaktionsplatte fest mit der optischen Klebefolie, um eine Verdunstung während des Laufs zu verhindern. Dann schleudern Sie es eine Minute lang bei 780 G bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie, ob sich die Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen in der Reaktionsplatte befindet, und führen Sie den Assay durch.

Weisen Sie die Kontrollen und Proben den entsprechenden Wells in der Gerätesystemsoftware zu und ändern Sie das Standard-Instrumentenverstärkungsprotokoll. Programmieren Sie das Instrument wie im Textmanuskript beschrieben, um die Dissoziationsanalyse unmittelbar nach der qPCR durchzuführen. Wenn der Lauf beendet ist, überprüfen und verifizieren Sie das Verstärkungsdiagramm.

Wählen Sie im Experimentmenü der Gerätesystemsoftware die Option Amplifikationsdiagramm aus. Wenn keine Daten angezeigt werden, klicken Sie auf die grüne Schaltfläche "Analysieren". Wählen Sie auf der Registerkarte Amplifikationsdiagramm aus dem Dropdown-Menü für den Diagrammtyp das Diagramm aus, das die Amplifikationsdaten als Fluoreszenzmesswerte anzeigt, normiert auf die Fluoreszenz aus der passiven Referenz als Funktion der Zyklusnummer. Wählen Sie im Dropdown-Menü für die Diagrammfarbe die Option Probe aus.

Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü "Diagrammtyp" den Diagrammtyp "Lineare Verstärkung" aus und stellen Sie sicher, dass der Start- und Endzyklus der Basislinie korrekt eingestellt ist. Der Endzyklus sollte einige Zyklen vor der Zyklusnummer eingestellt werden, in der ein signifikantes Fluoreszenzsignal erkannt wird. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü für den Diagrammtyp den Protokoll-10-Verstärkungsdiagrammtyp aus, um die Schwellenwertlinie im Diagramm anzuzeigen, indem Sie die Option für den Schwellenwert auswählen und den Schwellenwert anpassen.

Die Schwellenwertlinie sollte die exponentielle Phase an den qPCR-Kurven kreuzen. Stellen Sie sicher, dass alle Proben- und Positivkontroll-Wells normale Amplifikationskurven aufweisen und dass in den NTC-Wells keine Amplifikation vorhanden ist. Ein normales Amplifikationsdiagramm zeigt eine exponentielle Zunahme der Floreszenz, die den Schwellenwert zwischen den Zyklen 15 und 35 überschreitet.

Überprüfen Sie in den abgeleiteten Schmelzkurven die Bereiche vor und nach dem Schmelzen oder Temperaturlinien. Die Bereiche vor und nach dem Schmelzen sollten sich in einem flachen Bereich befinden, in dem es keine großen Spitzen oder Steigungen in den Fluoreszenzwerten gibt. Stellen Sie bei Bedarf den Start und Stopp der Temperaturleitungen vor und nach dem Schmelzen in einem Abstand von ca. 0,5 Grad Celsius ein.

Starten Sie die Analyse neu, wenn die Parameter durch Klicken auf die Schaltfläche Analysieren angepasst werden. Wählen Sie auf der Registerkarte "Ploteinstellungen" der Registerkarte "Differenzpott" eine der Wildtyp-Kontrollreplikate als Referenz-DNA aus und starten Sie die Analyse neu, indem Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" klicken. Vergewissern Sie sich auf der Registerkarte Ausgerichtete Schmelzkurven, dass alle Positivkontrollen den richtigen Genotyp aufweisen und dass der NTC nicht amplifiziert werden konnte.

Wählen Sie in der Well-Tabelle ein Kontroll-Well aus, um die entsprechende Schmelzekurve in den Analysediagrammen hervorzuheben und zu bestätigen, dass die Farbe der Linie dem richtigen Genotyp entspricht. Überprüfen Sie auf der Registerkarte Ausgerichtete Schmelzekurven sorgfältig die Diagrammanzeigen für die unbekannten Proben und vergleichen Sie sie mit den Diagrammanzeigen für Kontrollen. Wählen Sie die Wells aus, die die unbekannten Probenreplizierungen enthalten, und richten Sie die Schmelzkurven in einer geordneten Reihenfolge an den Steuerelementen aus, indem Sie die Wells mit den Steuerelementen nacheinander auswählen.

Analysieren Sie das Ergebnis für die unbekannte Stichprobe auf der Registerkarte Differenzdiagramm, um zu überprüfen, ob die erzielten Ergebnisse konsistent sind. Wählen Sie die Vertiefungen aus, die die unbekannten Probenreplizierungen enthalten, und richten Sie die Schmelzkurven in einer geordneten Reihenfolge an den Steuerelementen aus, wobei Sie nacheinander die Vertiefungen mit den Steuerelementen auswählen. Führen Sie qPCR HRM-Produkte auf einem 4%igen Agarose-Fertiggel aus, das einen fluoreszierenden Nukleinsäurestamm enthält.

Führen Sie nur einen positiven negativen NTC durch und die qPCR-HRM-Replikation der Probe erfolgt durch Nehmen Sie das Fertigteilgel und die Kassette aus der Verpackung, entfernen Sie den Kamm und setzen Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Gerät ein. Verdünnen Sie eine Probe von 10 Mikrolitern auf 20 Mikroliter mit sterilem RNA- und DNA-freiem Wasser und befüllen Sie jede Vertiefung mit 20 Mikrolitern der verdünnten Probe.

Verdünnen Sie drei Mikroliter Standardlösung in DNA-Größe auf 20 Mikroliter und laden Sie sie in die Markervertiefung. Füllen Sie leere Vertiefungen mit 20 Mikrolitern steriler RNA und freiem DNA-Wasser. Wählen Sie sofort das Programm entsprechend dem Prozentsatz des laufenden Gels aus und stellen Sie die Laufzeit des Geräts auf 20 Minuten ein.

Starten Sie die Elektrophorese innerhalb einer Minute nach dem Laden der Proben. Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, visualisieren Sie die DNA und das Gel mit blauem Licht oder UV-Durchleuchtung. Und eine erfolgreich amplifizierte DNA-Region von Interesse mit einem exponentiellen Anstieg der Fluoreszenzwerte, der die Schwelle zwischen den Zyklen 15 und 35 überschreitet, und sehr engen Werten des Quantifizierungszyklus in allen Replikaten und Kontrollen ist eine Voraussetzung für die zuverlässige Identifizierung genetischer Varianz durch hochauflösende Schmelzanalyse.

Die HRM-Analyse wird unmittelbar nach der qPCR durchgeführt, wobei die aktiven Schmelzregionen der Proben, die Kontrollen und der NTC verwendet werden, um ihre ausgerichteten Schmelzkurvendiagramme zu erstellen. Korrekt eingestellte Bereiche vor und nach dem Schmelzen sind wichtig für die korrekte Visualisierung und Identifizierung genetischer Varianz in den Proben. Hier sind ausgerichtete Schmelzekurven und verschiedene Töpfe dargestellt.

Die unbekannten Proben sind eng mit einer der Positivkontrollen ausgerichtet. Falsch eingestellte Vor- und Nachschmelzregionen oder Temperaturlinien führen zu ausgerichteten Schmelzekurven und unterschiedlichen Diagrammen, bei denen die korrekte Identifizierung der genetischen Varianz schwieriger ist. Die genetische Variante in der Probe kann identifiziert werden, indem das Bandenmuster der Probe mit dem der Kontrollen verglichen wird.

Und durch die Kombination von HRM und Agarose-Gelelektrophorese. Die korrekte Identifizierung genetischer Varianten kann nur für die Proben erfolgen, die dieselbe genetische Variante enthalten wie eine der Kontrollen, die im HRM-Assay verwendet werden. Proben, die seltene genetische Varianten von Calreticulin enthalten, unterscheiden sich im HRM-Ergebnis und im Elektrophoresebandenmuster.

Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die ausgerichteten Schmelzkurvendiagramme der bekannten Proben und der Kontrollproben sorgfältig zu vergleichen.