Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es die Nutzung bestehender zellfreier Translationssysteme für die Einzelmolekülanalyse der aktiven eukaryotischen Translation ermöglicht. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Bulk-Translationseigenschaften beibehält, eine Einzelmolekülauflösung bietet und relativ einfach von anderen Bulk-Translation-Assays zu adaptieren ist. Diese Methode kann auf jedes zellfreie Translationssystem angewendet werden, das verifiziert wurde, um eine effiziente cap-abhängige Translation unter Massenbedingungen zu ermöglichen.

Hongyun Wang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter, und Anthony Gaba, ein leitender Wissenschaftler des Xiaohui Qu-Labors, werden das Verfahren demonstrieren. Schalten Sie mindestens drei Stunden vor der Durchführung eines Einzelmolekülexperiments den Mikroskop-Inkubator ein und reduzieren Sie den Luftstrom auf eine niedrige Geschwindigkeit, um eine übermäßige akustische Störung des Experiments zu vermeiden. Stellen Sie dann die Inkubatortemperatur auf die optimale Temperatur ein, die für das zellfreie Translationssystem spezifisch ist.

Drücken Sie mindestens eine Stunde vor dem Experiment die Ein-/Aus-Taste des Lasers hinter der Laserbox, drehen Sie die Sicherheitstaste des Lasers und drücken Sie die Starttaste, um den Laser einzuschalten. Schalten Sie das Mikroskop ein und wählen Sie den Bildgebungsmodus, das Objektiv und den Filtersatz aus. Schalten Sie die EMCCD-Kamera, den Tischcontroller, die Spritzenpumpe und den Computer ein und öffnen Sie die Software für die Kamera, den Laser, den motorisierten Tisch und die Spritzenpumpe.

Klicken Sie in der Lasersteuerungssoftware auf Verbinden, um die Laserintensität einzustellen, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für den Auslöser und klicken Sie auf Steuerung, um den Schieberegler für die Intensität im Popup-Fenster der Lasersteuerung zu ziehen. Geben Sie die Eindringtiefe ein, um den Laser auf den gewünschten Winkel einzustellen, und vergewissern Sie sich, dass der Verschlusskasten geschlossen ist, um den Laser im Aus-Modus zu halten, wenn er nicht abbildet. Wenn die Kamera abgekühlt und auf die vorgesehene Arbeitstemperatur stabilisiert ist, wählen Sie in der Kamerasoftware kinetisch als Aufnahmemodus aus und geben Sie die Parameter Belichtungszeit, kinetische Serienlänge und Elektronenmultiplikationsverstärkungswert ein.

Wählen Sie das Verzeichnis aus und vergeben Sie Dateinamen zum Speichern der Datenbilddatei. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine moderate bis schnelle Durchflussrate ein und geben Sie 500 Mikroliter 70%iges Ethanol in ein Mikrofuge-Röhrchen. Führen Sie das Schlauchende der Spritzenpumpe in die Ethanollösung ein und verwenden Sie die Spritzenpumpensoftware, um die Spritzenpumpe zwischen Entnahme- und Ausgabemodus umzuschalten, um den Schlauch dreimal mit Ethanol und dreimal mit RNase-freiem Wasser zu waschen.

Tupfen Sie nach der letzten Wasserwäsche das Schlauchende auf ein sauberes Taschentuch, um das restliche Wasser aus der Innenseite des Schlauchs zu entfernen, und legen Sie das Ende des Schlauchs in ein sauberes Mikrofugenröhrchen. Für die Immobilisierung von biotinylierter mRNA mit drei Prime-Enden setzen Sie die Durchflusskammer mit der Deckglasseite nach unten in den Probenhalter des Mikroskops ein und sichern Sie die Kammer mit Klebeband. Verwenden Sie das Klebeband, um die Ein- und Auslässe des Durchflusskanals abzudecken, die nicht verwendet werden, und geben Sie das 1,5-fache des Volumens einer Streptavidin-Lösung von 200 Mikrogramm pro Milliliter in den Strömungskanal.

Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur den Kanal dreimal mit dem dreifachen Volumen an T50-Waschpuffer pro Waschgang und dem gefalteten Laborgewebe waschen und abwischen. Geben Sie nach dem letzten Waschen einen Tropfen Immersionsöl auf das Mikroskopobjektiv und stellen Sie den Halter und die Kammer auf den Mikroskoptisch. Bringen Sie dann das Objektiv in die Nähe des Deckglases, bis das Immersionsöl auf dem Objektiv das Deckglas berührt, und bewegen Sie den Probentisch so, dass sich die Position des Strömungskanals direkt über der Objektivlinse befindet.

Wählen Sie auf dem Touchscreen der Mikroskopsteuerung die Registerkarte "Fokus" aus und klicken Sie auf "Fokussuche und Start". Ein Signalton ertönt, wenn die Fokusebene erfolgreich erreicht wurde. Wählen Sie in der Kamerasoftware den Live-Modus aus.

Öffnen Sie in der Lasersteuerungssoftware den Laserverschluss und stellen Sie die Laserintensität ein. Beobachten Sie das Echtzeit-Fluoreszenzbild im Live-Modus und auf dem Touchscreen der Mikroskopsteuerung mit der Feinschrittsteuerung, um die Objektivposition anzupassen. Verschieben Sie in der Kamerasoftware den Tisch, um den Grad des Fluoreszenzhintergrunds in verschiedenen Bereichen der Durchflusskanal-Detektionsoberfläche zu bewerten.

Wenn die Fluoreszenz niedrig ist, stoppen Sie den Live-Modus, schließen Sie den Lasershutter in der Lasersteuerungssoftware und ersetzen Sie den Waschpuffer aus dem Strömungskanal durch das doppelte Volumen der biotinylierten mRNA-Lösung. Waschen Sie den Kanal nach 15 Minuten dreimal mit dem dreifachen Volumen des translationskompatiblen Puffers pro Waschgang. Für die Einzelmoleküldetektion wird das dreifache Volumen des frisch aufgetauten Translationsgemisches ohne mRNA zusammengefügt und mit einer optimierten Konzentration fluoreszenzmarkierter Antikörper in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis ergänzt und das Röhrchen kurz gedreht, um das Gemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Übertragen Sie das Translationsgemisch in die Innenseite eines 700-Mikroliter-Mikrofugenröhrchendeckels und stellen Sie die Spritzenpumpe in den Entnahmemodus. Führen Sie das Ende des Pumpenschlauchs in die Translationsmischung ein und beginnen Sie mit der Spritzenentnahme. Wenn die Translationsmischung vollständig in den Pumpenschlauch eingedrungen ist, stoppen Sie die Entnahme, schalten Sie die Spritzenpumpeneinstellungen in den Dosiermodus um und stellen Sie den Durchfluss auf eine optimale Rate für die Abgabe der Translationsmischung ein.

Starten und stoppen Sie die Spritze, damit die Translationsmischung bei Bedarf das Ende des Schlauchs erreichen kann, und führen Sie das Ende des Pumpenschlauchs in den Einlass des Strömungskanals ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Schrauben Sie die maßgefertigte Metallhalterung auf die Probenhalterplatte des Mikroskops, um die Verbindung zu stabilisieren und den Mikroskopfokus und die Fluoreszenz des Bildbereichs zu beurteilen. Vergewissern Sie sich, dass die Parameter für die Filmaufnahme korrekt sind und dass der entsprechende Dateiname und das entsprechende Verzeichnis zum Speichern der Dateien eingegeben wurden.

Verschieben Sie den Tisch, um die Abbildung eines Bereichs in der Mitte der Erkennungsoberfläche des Strömungskanals zu ermöglichen. Klicken Sie auf der Registerkarte "Kontinuierlicher AF" auf die Startschaltflächen. Ein Signalton ertönt, wenn eine Fokusebene erfolgreich erreicht wurde.

Nachdem Sie das Umgebungslicht reduziert haben, öffnen Sie den Laserauslöser und klicken Sie auf die Schaltfläche Signal nehmen, um die Aufnahme zu starten. Geben Sie nach fünf Sekunden den Befehl run ein, um die Translationsmischung in den Flow-Kanal zu liefern. Nehmen Sie die Daten dann bis zu zwei Stunden lang mit einer Auflösung von 0,5 bis zwei Sekunden pro Bildzeit auf.

Um Cy3 ANTI-FLAG-Bindungsereignisse zu analysieren, wurden die Fluoreszenzintensitäten ausgewählter Cy3 alpha flag Spots Bild für Bild für den gesamten Film berechnet und zu einer Intensitätsbahn verbunden. Rohverläufe können verrauscht erscheinen und erfordern möglicherweise eine Verfeinerung mit einem nichtlinearen Vorwärts-/Rückwärtsfilter, um Hintergrundrauschen zu reduzieren. Eine weitere Verfeinerung kann mit Hilfe von Schritterkennungsalgorithmen erreicht werden, um Trajektorien zu digitalisieren.

Die Bindung von Antikörpern an ein naszierendes Polypeptid führt zu einem sofortigen Anstieg der Fluoreszenz, während die Dissoziation des Antikörper-Polypeptids zu einer sofortigen Abnahme der Fluoreszenz führt. Das Verweilzeithistogramm für Luciferase-Flaggen-mRNA passt sich an eine logarithmische Normalverteilung an und ergibt eine Peptidsyntheserate von 2,5 plus oder minus 0,1 Aminosäuren pro Sekunde. Das Histogramm der ersten Ankunftszeit passt zu einer verschobenen logarithmischen Normalfunktion, was den hohen Grad an Heterogenität in der Translationsaktivität einzelner mRNAs verdeutlicht.

Wie das Histogramm zeigt, kann das erste Peptidsyntheseereignis an einzelnen Luciferase-Flaggen-mRNA-Molekülen bereits zwei Minuten und erst 20 Minuten nach der Verabreichung des Translationsmixes beginnen. Im Vergleich zur Translation mit Luciferase-Flaggen-mRNA zeigte das erste Ankunftszeit-Histogramm mit Hairpin-Luciferase-Flaggen-mRNA-Translation eine langsamere Antikörperbindung. Die Verwendung von Lumineszenzmessungen in großen Mengen aus zellfreien Translationsreaktionen mit denselben mRNAs löst jedoch keine Unterschiede in der Translationskinetik.

Die Einzelmolekülauflösung dieses Assays bietet kinetischere Einblicke in die kappenabhängige Translation, die mit anderen Ansätzen nicht leicht zu erreichen sind. Die eukaryotische zellfreie Translation reagiert empfindlich auf kleine Variationen und experimentelle Bedingungen. Daher sind Detailgenauigkeit und Konsistenz bei der Verwendung dieses Assays von entscheidender Bedeutung, um kleine Unterschiede in der Translation genau zu erkennen.