Name: Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Krebszellverhalten in der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mittels Organ-On-A-Chip, konfokaler Tomographie und maschinellem Lernen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen.

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Wir danken dem Steeg Lab am National Cancer Institute für die großzügige Spende von MDA-MB-231-BR-GFP Zellen. Die konfokale Mikroskopie wurde am University of Michigan Biointerfaces Institute (BI) durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde an der University of Michigan Flow Cytometry Core durchgeführt. Virale Vektoren wurden von der University of Michigan Vector Core erstellt. Wir danken auch Kelley Kidwell für die Anleitung bei der statistischen Analyse dieser Daten.
Finanzierung:
C.R.O. wurde teilweise von einem NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) und 1R21CA245597-01 unterstützt. T.M.W. wurde teilweise von 1R21CA245597-01 und dem National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer UL1TR002240 unterstützt. Die Finanzierung von Materialien und Charakterisierung wurde von National Cancer Institute of the National Institutes of Health unter der Auszeichnung Nr. 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation und der Breast Cancer Research Foundation bereitgestellt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

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Wir haben eine neue Methode entwickelt und vorgestellt, die Werkzeuge anpasst, die häufig in klinischen bildgebenden Analysen zur Messung der Extravasation und Migration von Krebszellen durch eine Endothelbarriere in das Hirngewebe verwendet werden. Wir stellen dar, dass dieser Ansatz sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Messungen nützlich sein kann; wir haben seine Verwendung auf einem 3D-Mikrofluidsystem demonstriert, das die Gehirnvaskulatur rekapituliert. Krebszellmessungen, einschließlich extravasierter Entfern...

Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren zum Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp1,2. Eine Hauptfrage, die sich beim Studium der Krebsmetastasierung stellt, ist, wie Subklone aus der humoralen Umgebung des Blutkreislaufs in ein Organ wie das Gehirn3,4wandern. Diese Frage hat zu vielen Variationen von Migration, Invasion und Extravasation Assays geführt. Alle diese Methoden teilen den entscheidenden Schritt des Zählens oder Messens von Eigenschaften von Zellen, die sich als Reaktion auf einen Stimulus von einem Standort zum anderen bewegen. Die meisten migrationsfreundlichen Assays werden verwendet, um die zweidimensionale (2D) Migration von Krebszellen zu untersuchen. Diese haben eine Fülle von Wissen aufgeklärt; Sie rekapitulieren jedoch nicht den dreidimensionalen Charakter des in vivo-Systems, den andere Methoden5liefern können. Daher ist es notwendig, die Tumor-Mikroumgebung (TME) in dreidimensionalen (3D) Systemen zu untersuchen, aber die Analyseansätze für 3D-Strukturen sind begrenzt und oft inkonsistent.
Eines der beliebtesten 3D-Werkzeuge ist eine Boyden-Kammer, die aus einer Membran besteht, die an der Unterseite eines Brunnens aufgehängt ist und zwei verschiedene Bereiche trennt. Boyden führte den Test ein, um Leukozyten-Chemotaxis zu untersuchen4. Die unteren Bereiche können durch Chemie oder andere Mittel6,,7 variiert werden, um Zellen im oberen Bereich dazu zu bringen, in den unteren Bereich zu migrieren. Der häufigste Ansatz zur Quantifizierung der Anzahl der zellen, die migriert wurden, besteht darin, die Zellen von der Unterseite der Membran mithilfe einer Pufferlösung freizusetzen, sie zu lysieren und sie dann basierend auf der Menge des DNA-Gehalts in der Lösung7zu zählen. Dieser indirekte Ansatz ist aufgrund der Technikvariabilität anfällig für Bedienerfehler und das Verfahren zerstört Informationen über den Krebsphänotyp und die Mikroumgebung. Variationen des Boyden-Kammer-Assays beinhalten die Fixierung von Zugzellen, die auf der Membran verbleiben, liefert aber nur eine Anzahl von Zellen, die für die weitere Studie6,8,9nicht mehr lebensfähig sind.
Aufgrund der Einschränkungen der Boydenkammer und des Wachstums von Innovationen in der mikrofluidischen Gemeinschaft wurden Migrations-Assay-Chips entwickelt, die die Bewegung von Zellen als Reaktion auf einen Stimulus in eine Richtung anstatt drei10,11,12beobachten. Diese Migrationstests erleichtern die Kontrolle über Faktoren wie Strömung oder Einzelzelltrennung13,14, die eine bessere Interpretation der Ergebnisse ermöglichen; Ihr 2D-Format verliert jedoch unweigerlich einige dynamische Informationen. Jüngste Studien haben sich auf die Extravasation (d.h. die Bewegung von Zellen aus der Zirkulation in ein Gewebe, wie die Blut-Hirn-Schranke) in einer 3D-Umgebung14,15konzentriert. Der Extravasationsabstand in Gewebe und das Sondierungsverhalten, das an der zellulären Barriere/Membran auftritt, ist raffinierter als Messungen, die entweder mit der Boyden-Kammer oder einem 2D-Mikrofluid-Migrationsgerät16gewonnen wurden. Daher sind Geräte, die eine angemessene Bildgebung und Analyse der 3D-Extravasation ermöglichen, entscheidend, um diese ausgeklügelten Messungen zu erfassen, aber es fehlt in der Literatur.
Unabhängig von Migrationstests wurden robuste bildgebende Verfahren für die Magnetresonanztomographie (MRT) und Tomographie entwickelt, die gewebe im 3D-Raum17,18identifizieren und genau rekonstruieren können. Diese Techniken erfassen Bilder in Z-Stacks und Segmentteilen des Bildes basierend auf den Eigenschaften des Gewebes und konvertieren dann die segmentierten Bilder in dreidimensionale Netze19,20,21. Dies ermöglicht es Ärzten, in 3D einzelne Organe, Knochen und Gefäße zu visualisieren, um bei der chirurgischen Planung oder Hilfe bei der Diagnose von Krebs oder Herzerkrankungen zu helfen22,23. Hier zeigen wir, dass diese Ansätze für den Einsatz an mikroskopischen Proben und 3D-Extravasationsgeräten angepasst werden können.
Zu diesem Zweck haben wir die innovative konfokale Tomographie-Technik entwickelt, die hier vorgestellt wird und die Flexibilität bietet, die Extravasation von Tumorzellen über eine Membran zu untersuchen, indem bestehende Tomographie-Tools angepasst werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der gesamten Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen, da sie mit einer zellulären Barriere interagieren, wie z. B. einer endotheliaalen Zellschicht. Krebszellen zeigen Sondierungsverhalten; einige können eindringen, bleiben aber in der Nähe der Membran, während andere die Barriere leicht durchqueren. Diese Technik ist in der Lage, Informationen über den Phänotyp der Zelle in allen Dimensionen24zu liefern. Mit diesem Ansatz zur Untersuchung der TME ist sowohl relativ kostengünstig, leicht zu interpretieren und reproduzierbar, im Vergleich zu komplexeren in vivo murinen Modellen. Die vorgestellte Methodik sollte eine starke Grundlage für die Untersuchung vieler Arten von Tumoren und Mikroumgebungen bieten, indem die Stromregion angepasst wird.
Wir beschreiben und demonstrieren die Verwendung einer 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische(MBBN)Plattform ( Abbildung 1 ), in der kritische Elemente der Barriere und Nische (mikrovaskuläre Endkörperzellen und Astrozyten des Gehirns) über einen längeren Zeitraum (ca. bis zu 9 Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die mit unserer konfokalen Tomographie rekonstruierten Bilder rekonstruiert werden können ( Abbildung2); alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Die Schnittstelle zur Blut-Hirn-Schranke mit der Gehirnnische besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Kellermembran, Astrozytenfüße und Pericyten25verstärkt werden. Wir konzentrierten uns selektiv auf die Astrozyten- und Endothelkomponenten, da sie für die Bildung und Regulierung der Blut-Hirn-Schranke wichtig sind. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und tumormikro-Umweltzell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Schließlich zeigen wir, wie maschinelles Lernen genutzt werden kann, um die intrinsischen phänotypischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen24. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zu Metastasen, therapeutischen Strategien und der Rolle der TME in beiden zu beantworten.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA mit Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm Biopsie-Stanze mit Kolben</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, ohne Ca und Mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>200uL Pipettenspitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>4 Zoll Silikonwafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>48 mm breites Packband</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-072-097</td><td></td></tr><tr><td>50 x 75 mm Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>A1 Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aceton Fisher Scientific</td><td>A9-20</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum (Penicillin/Streptomycin/Amphotericin)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Teppichmesserklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1721575</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit 4,5 g/L Glukose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>doppelseitiges Klebeband</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviertes</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>EMD Millipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Anaconda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel - Wachstumsfaktor reduziert mit Phenolrot</td><td>Corning</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231-BR-GFP</td><td>Dr. Patricia Steeg, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>normale menschliche Astrozyten (NHA)</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td></td></tr><tr><td>Orange Software</td><td>Universität Ljubljana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Photolithographie-Masken</td><td>Photosciences Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7-dsRed</td><td>University of Michigan Vector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EV-GFP</td><td>University of Michigan Vector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLOX-TERT-iresTK</td><td>Addgene</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membran, 5 μm Porengröße</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>PureCol, 3 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005</td><td>Typ I Rinderkollagen</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Solo Cup</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1416545</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2075</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Entwickler</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Company</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179965-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tricholoro Perfluoroctylsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der metastasierenden tumor-mikroumgebung des gehirns mit einem organ-on-a-chip-3d-modell, maschinellem lernen und konfokaler tomographie

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren auf das Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp. Um die Belastung durch metastasierende Tumore im Gehirn zu verringern, müssen Lücken in grundlegenden und translationalen Kenntnissen behoben werden. Zu den größten Herausforderungen gehören ein Mangel an reproduzierbaren präklinischen Modellen und zugehörigen Werkzeugen. Dreidimensionale Modelle der Hirnmetastasierung können die relevanten molekularen und phänotypischen Daten liefern, die in Kombination mit speziellen Analysetools verwendet werden, um diesen Anforderungen gerecht zu werden. Darüber hinaus erzeugen Organ-on-a-Chip-Modelle von Patiententumorzellen, die die Hirnschranke des Blutes in die Mikroumgebung des Gehirns durchqueren, im Vergleich zu murinen Modellen schnell Ergebnisse und sind mit quantitativen Methoden interpretierbarer und somit für Tests mit hohem Durchsatz geeignet. Hier beschreiben und demonstrieren wir den Einsatz einer neuartigen 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische (mBBN), auf der mehrere Elemente der Nische über einen längeren Zeitraum (mehrere Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die Bilder mit einer innovativen konfokalen Tomographie-Technik rekonstruiert werden können; alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung (TME) in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und TME-Zell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Darüber hinaus zeigen wir, wie künstliche Intelligenz (KI) verwendet wird, um die intrinsischen phänotischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zur Metastasierung, zur Wirksamkeit therapeutischer Strategien und zur Rolle der TME in beiden zu beantworten.

Mit dieser Technik analysierten wir Zelltypen, die mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen gekennzeichnet sind. Wir demonstrieren die Verwendung dieses Ansatzes mit einem mit hCMEC/D3-DsRed und nicht fluoreszierenden Astrozyten formulierten SmBBN-Chip. Die mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns wurden auf eine poröse Membran (5 m Track geätzte Poren) gesät und in einem Inkubator34 bei 37 °C unter 5%CO2platziert. Nach drei Tagen wurde die Konfluenz der Endothels...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

Die konfokale Tomographie wurde entwickelt, um die volle Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen zu erhalten, da sie mit der zellulären Barriere und Nische interagieren. Diese Methode bietet eine Grundlage für die Untersuchung von Metastasen, wie sie auftreten. Dieser Ansatz ist nützlich, um das Verhalten von Lebenden Zellen zu quantifizieren.Die konfokale Tomographie ist in Kombination mit maschinellem Lernen für eine Vielzahl von Organ-on-a-Chip-Plattformen nützlich. Die Analyse von primären oder rezidivierenden Tumorzellen oder zirkulierenden Tumorzellen kann ein wichtiges diagnostisches Werkzeug darstellen, um Hirnmetastasen vorherzusagen und Hirnmetastasen von nicht hirnmetastasierenden Zellen zu unterscheiden. Um das mikrofluidische BBN-Gerät zu montieren, übertragen Sie ein Gerät aus dem Vakuum-Desiccator auf eine geeignete Oberfläche mit nach unten gerichteten Einlässe und legen Sie das gesamte Setup in eine Plasmakammer.Legen Sie das gesamte Setup in eine Plasmakammer und ziehen Sie ein Vakuum, bevor Sie das Gerät 30 Sekunden lang mit Plasma bei 80 Watt behandeln. Verwenden Sie am Ende der Behandlung eine Anleitung, um das Gerät schnell auf die Glasrutsche auf der Laborbank zu legen, um eine dauerhafte Verbindung zwischen den PDMs des Geräts und dem Dia herzustellen. Als nächstes 200 Mikroliter Pipettenspitzen einsetzen, zwei Millimeter von der Spitze in alle Ein- und Auslässe schneiden und das Gerät für eine achtminütige, 200 Watt Plasmabehandlung in die Plasmakammer legen.Nachdem das Gerät abgekühlt ist, legen Sie das Gerät in einen sterilen Sekundärbehälter und übertragen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Plasmidbehandlung 120 Mikroliter einer Kollagen-Astrozytenlösung über die Pipettespitze für die Bodenkammer in das Gerät. Lassen Sie die Lösung über die Kammer in die gegenüberliegende Pipettespitze leiten und füllen Sie den nächsten Kanal des Geräts. Wenn alle vier Kanäle des Geräts gefüllt sind, legen Sie den Chip für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator.Wenn das Kollagen gesetzt ist, alle Pipettenspitzen, die die untere Kammer mit dem entsprechenden kompletten Zellkulturmedium füttern, in Rechnung stellen und die obere Kammer mit 2% Wachstumsfaktor reduziertem Matrigel in komplettem endotheliaalen Medium beschichten. Wenn beide Kammern codiert sind, legen Sie das Gerät für eine Stunde in den Inkubator, bevor Sie die obere Kammer mit dem entsprechenden Medium abspülen. Wechselnde Spitzen, siehe 30 Mikroliter von einem mal 10 bis zur sechsten Endothelzellen pro Milliliter des entsprechenden Mediums, durch die Spitzen in die obere Kammer alle 15 Minuten, für insgesamt vier Aliquots von Zellen pro Spitze.Inkubieren Sie das Gerät zwischen den Aussaaten. Wenn alle Endothelzellen gesät sind, füllen Sie alle Spitzen mit dem Medium und geben Sie das Gerät für 48 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Endothelschicht gereift ist, ersetzen Sie das Medium im Chip, um das Zellkulturmedium aufzufüllen, und säen Sie jeden oberen Kammerkanal mit 30 Mikrolitern von einem mal 10 bis zu den sechs Krebszellen pro Milliliter des entsprechenden Mediums.Nachdem jeder 30 Mikroliter Aliquot der Zellen gesät wurde, geben Sie das Gerät für 15 Minuten an den Inkubator zurück und füllen Sie dann alle Spitzen mit dem entsprechenden Medium zurück das Gerät in den Zellkultur-Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Nachdem das Gerät kultiviert und abgebildet wurde, um den Phänotyp der Krebszellen zu messen, öffnen Sie die mitgelieferte Software und lesen Sie das konfokale Bild ins Gedächtnis. Die Software speichert jeden Farbkanal aus dem konfokalen 3D-Bild in einer separaten TIFF-Datei.Wählen Sie Opazitätswerte für jeden Mikroskopkanal ändern' und passen Sie den Kanal-Alphawert für die im Bild vorhandenen Farbkanäle an, sodass der Hintergrund entfernt wird und nur die Leuchtstoffröhren innerhalb der Zellen verbleiben. Um den Effekt zu visualisieren, wählen Sie Anzeigen eines 3D-Renderings aus, um zu überprüfen, ob der Schwellenwert richtig eingestellt ist, und wenn das Bild richtig aussieht, speichern Sie die Deckkraftwerte in der Experimenttracker-Tabelle. Verwenden Sie dann Marschwürfel, um das Volumenbild in einzelne dreieckige 3D-Netzobjekte zu konvertieren, die im VTK-Datenformat gespeichert sind.Um eine Ebene an die Endothelbarriere anzupassen, lokalisieren Sie zuerst die Zellzentroide. Verwenden Sie den Polydatenverbindungsfilter, um die Liste der Netze in der VTK-Datei zu durchlaufen, um die Regionen zu extrahieren, die nicht verbunden sind. Berechnen Sie den Schwerpunkt jedes Netzes, und fügen Sie die Messung einer Liste von Zentroiden hinzu, die nach Netzen filtern, die zu groß oder zu klein sind.Um eine Ebene an die Liste der Zentroide für die Endothelzellen anzupassen, verwenden Sie eine Minimierung der Fehlermethode, führen Sie Visualize RFP-Zentroide und Ebene fit aus, um die Ebene zu generieren und zu zeichnen und die Passform der Ebene zu überprüfen, indem Sie die Passform bei Bedarf manuell anpassen. Wenn das Flugzeug ordnungsgemäß montiert wurde, speichern Sie die Normale des Flugzeugs in der Experimentier-Tracker-Datei. Um jeden Krebszellen-Phänotyp zu messen, nachdem er die Endothelschicht mit einer Ebene charakterisiert hat, laden Sie die Zellanalysefunktion und führen Sie Read in den Experiment-Tracker-Informationen aus, und analysieren Sie die vorhandenen Kanäle, um jede Region in der VTK-Datei zu iterieren und zu analysieren.Für jede Region wird die Funktion jede Zelle beschneiden, sodass das Netz unterhalb der Membran berechnet wird. Um den zellulären Phänotyp zu messen, berechnen Sie die Form, das Volumen und die Position jeder Krebszelle. Messen Sie dann das Volumen und die Position jeder abgeschnittenen Krebszelle, um den Prozentsatz der Zelle zu berechnen, die durch die Endothelbarriere extravasiert wurde.Nachdem Sie diese Schritte für mehrere Experimente ausgeführt haben, führen Sie Exportieren Sie die Daten als einzelne xlsx-Datei aus, um die Daten in einer Kalkulationstabelle zu speichern. Ein mikrofluidischer BBN-Chip mit einer konfluenten Endothelbarriere ist für Experimente akzeptabel, ein mikrofluidischer BBN-Chip mit besonders schlechter Endothelabdeckung nicht. In dieser repräsentativen Analyse zeigt das Gehirn, das Krebszelllinie sucht, eine Subpopulation von Zellen, die über die Endothelbarriere extravasiert und tief in den Gehirnnischenraum des mikrofluidischen BBN-Chips wandert. , während die metastasierende Krebszellpopulation des Gehirns einen Anteil der Zellen beibehielt, die größer als 100% extravasiert waren.Die morphologische Quantifizierung der Krebszellform zeigte, dass die Elternzellen weniger sphärisch geformte Zellen an einem Tag nach der Aussaat zeigten, während beide Krebszelllinien nach zwei und neun Tagen Interaktion dazu neigten, ihre Sphärizität zu verringern. Darüber hinaus waren die Krebszellsubpopulationen, die in die astricydic Nische extravasierten, kleiner, verglichen mit den Krebszellen, die in Wechselwirkung mit der Endothelbarriere blieben, ohne in das Gehirn zu extravasieren. Gehirn auf der Suche nach Krebszelllinien und Patienten abgeleitet Xenografts, zeigen ein phänotypisches Muster in der mikrofluidischen BBN-Chip, die genutzt werden könnte, um zwischen dem Gehirn metastasieren und nicht Gehirn metastasierende Krebszellen durch maschinelles Lernen zu unterscheiden.Selbstauswahl ist wichtig. Endothelzellen mit einer höheren, niedrigen Durchgangszahl wiesen ein variables Barriereverhalten auf. Darüber hinaus können sich Krebszellen und ihre fluoreszierende Expression im Laufe der Zeit ändern.Nach diesem Verfahren können Forscher molekulare Profilierung des Hauses oder der Zellen des Geheimnisses im Gerät verwenden, um molekulare Mechanismen von Metastasen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht die Erforschung komplexer Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihren Mikroumgebungen, indem eine technische Mikroumgebung mit einer quantitativen Bildgebung von Nischenkomponenten im Laufe der Zeit kombiniert wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir haben 3D-Kokultur-Modelle für Live-Cell-Imaging entwickelt in Echtzeit von Interaktionen zwischen Brust-Tumor-Zellen und andere Zellen in ihrer Mikroumgebung, die Einfluss auf Progression zu einem invasiven Phänotyp. Diese Modelle können als Bildschirme für präklinische Arzneimittel auf parakrine-induzierte proteolytische, Chemokin / Zytokin-und Kinase-Signalwege in Invasivität-Ziels dienen.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines 3D-Co-Kultursystems. Hirnschnitte von Mäusen werden auf eine Membran gelegt, auf der fluoreszenzmarkierte menschliche Hirntumorzellen wachsen können. Sobald das System fertig ist, wird es für die Bildgebung gefärbt.

Etablierung eines Hirntumors in einem organotypischen Scheiben-Co-Kulturmodell

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Viele Arten von menschlichen Hirntumoren sind auf bestimmte Regionen innerhalb des Gehirns beschränkt und in Kultur schwer zu züchten. Dieses Protokoll befasst sich mit der Rolle der Tumormikroumgebung und untersucht neue medikamentöse Behandlungen durch die Analyse fluoreszierender primärer Hirntumorzellen, die in einem organotypischen Maushirnschnitt wachsen.

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Das vorliegende Protokoll entwickelt eine bildbasierte Technik zur schnellen, zerstörungsfreien und markierungsfreien Messung der regionalen Zelldichte und -lebensfähigkeit innerhalb von 3D-Tumoraggregaten. Die Ergebnisse zeigten einen Zelldichtegradienten mit höheren Zelldichten in Kernregionen als in äußeren Schichten in sich entwickelnden Aggregaten und überwiegend peripherem Zelltod in HER2+-Aggregaten, die mit Trastuzumab behandelt wurden.

Zerstörungsfreie Bewertung der regionalen Zelldichte innerhalb von Tumoraggregaten nach medikamentöser Behandlung

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Die meisten Hirnmetastasen-Mausmodelle werden durch systemische Metastasen kompliziert, die die Analyse der Mortalität und der therapeutischen Interventionsergebnisse verwirren. Hier wird ein Protokoll für die interne Karotisinjektion von Krebszellen vorgestellt, das konsistente intrakranielle Tumoren mit minimalen systemischen Tumoren erzeugt.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Die stereotaktische intrakranielle Injektionstechnik ermöglicht eine präzise und lokalisierte Einpflanzung von Tumorzellen in den Mauskortex und ist damit ein wirkungsvolles Modell zur Untersuchung der metastatischen Besiedlung des Gehirns.

Modellierung von Gehirnmetastasen: Standardisierte Analyse metastatischer Kolonisierung und histologischer Wachstumsmuster durch stereotaktische intrakortikale Injektion

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Erfahren Sie die Quantifizierung von Krebszellverhalten in der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mittels Organ-On-A-Chip, konfokaler Tomographie und maschinellem Lernen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen.

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie (Video) | JoVE Journal

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

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