Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Das in diesem Video gezeigte Protokoll kombiniert zum ersten Mal die Verwendung von chemischem epigenetischem Löschen mit biomechanischen Signalen, um die Pluripotenz in adulten terminaldifferenzierten Zellen zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Die Hauptstärke dieses Protokolls besteht darin, dass es keine transgenen oder viralen Vektoren benötigt. Darüber hinaus ist es robust, hoch reproduzierbar und flexibel.

Diese Technik erfordert keine Gentransfektion und stellt daher einen bemerkenswerten technologischen Fortschritt für die translationale Medizin und Zelltherapie dar, während sie gleichzeitig die Langzeitkultivierung von Zellen mit hoher Plastizität unterstützt. Georgia Pennarossa, Assistenzprofessorin, und Teresina De Iorio, Doktorandin aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit der Zubereitung frischer einmillimolarer 5-aza-CR-Stammlösung.

Wiegen Sie 2,44 Milligramm 5-aza-CR und lösen Sie es in 10 Millilitern DMEM mit hohem Glukosegehalt auf. Das Pulver durch Vortexen wieder suspendieren und die Lösung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter sterilisieren. Bereiten Sie die 5-aza-CR-Arbeitslösung her, indem Sie einen Mikroliter der Stammlösung in einem Milliliter Fibroblasten-Kulturmedium verdünnen.

Trypsinisieren Sie die Zellen wie im Textmanuskript beschrieben und verdrängen Sie sie durch sanftes Pipettieren. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und überführen Sie sie in ein konisches Röhrchen. Zählen Sie Zellen in einer Zählkammer unter einem optischen Mikroskop.

Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 150-fachem G zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, um 40.000 Zellen in 30 Mikrolitern Fibroblasten-Kulturmedium zu erhalten, das mit einem mikromolaren 5-aza-CR ergänzt wird. Füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit PTFE-Pulver, um ein Bett herzustellen, und geben Sie die 30 Mikroliter Zellen auf das Pulverbett.

Drehen Sie die Petrischale vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass PTFE-Pulver die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig bedeckt und einen Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor bildet. Nehmen Sie den Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze auf, die auf den Durchmesser des Marmors zugeschnitten wurde. Den Mikrobioreaktor auf eine saubere bakteriologische Petrischale stellen, um ihn zu stabilisieren.

Übertragen Sie dann den Mikrobioreaktor aus der Petrischale in eine 96-Well-Platte. Geben Sie langsam 100 Mikroliter Medium vom Rand der Vertiefung hinzu. Der Mikrobioreaktor sollte auf dem Medium schwimmen.

Inkubieren Sie den Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Nach der Inkubation wird der Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze entnommen und in eine neue 35-Millimeter-Bakteriologie-Petrischale gelegt. Benutze eine Nadel, um den flüssigen Marmor zu durchstechen und ihn zu zerbrechen.

Stellen Sie die gebildeten Sphäroide mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze wieder her, die am Rand unter einem Stereomikroskop geschnitten wurde. Um 5-aza-CR-Rückstände abzuwaschen, geben Sie die Organoide in eine Petrischale, die ESC-Medium enthält. Bereiten Sie eine neue 35-Millimeter-Petrischale vor, die das PTFE-Pulverbett enthält, und geben Sie ein einzelnes Organoid in einem 30-Mikroliter-Tröpfchen ESC-Kulturmedium mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf das Pulver.

Drehen Sie die Schale vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um einen neuen Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor zu bilden, und geben Sie ihn in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 100 Mikroliter Medium vom Rand des Brunnens hinzu, um den Marmor langsam zu baden. Kultivieren Sie die Mikrobioreaktoren aus flüssigem Marmor bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Morphologische Analysen zeigen, dass nach einer 18-stündigen Inkubation mit dem Demethylierungsmittel 5-aza-CR Fibroblasten von drei Säugetierarten, die in PTFE-Mikrobioreaktoren verkapselt waren, aggregierten und sphärische 3D-Strukturen mit einer einheitlichen Größengeometrie bildeten. Unter 3D-Bedingungen veränderten 86,31 % der verkapselten Zellen ihren Phänotyp bemerkenswert. Im Gegensatz dazu waren Post-5-aza-CR-Zellen, die unter 2D-Standardbedingungen kultiviert wurden, erheblich kleiner, mit granulierten Zellkernen und behielten eine Monolagenverteilung bei.

Die morphologischen Veränderungen gingen einher mit dem Beginn einer pluripotentenzbedingten Genexpression, sowohl in 3D- als auch in 2D-Post-5-aza-CR-Zellen. Die Transkription wurde für die POU-Klasse fünf Homöobox eins, die NANOG-Homöobox, das ZFP42-Zinkfingerprotein und die geschlechtsbestimmende Region Ybox2 beobachtet, die in unbehandelten Fibroblasten fehlen. Eine signifikante Hochregulation des 10-11-Translokations-2-Epithelzelladhäsionsmoleküls und der Cadherin-1-Gene wurde auch in 3D-Post-5-aza-CR-Zellen im Vergleich zu Zellen beobachtet, die in 2D-Standard-Kunststoffschalen kultiviert wurden.

Parallel dazu wurde eine Herunterregulierung des Fibroblasten-spezifischen Markers Thy1-Zelloberflächenantigen sowohl in 3D- als auch in 2D-Post-5-aza-CR-Zellen nachgewiesen. Eine signifikante Abnahme der Methylierungsniveaus sowohl in 3D- als auch in 2D-Post-5-aza-CR-Zellen wurde mit ELISA bestätigt. Die DNA-Methylierungsniveaus waren in 3D-Post-5-aza-CR-Zellen signifikant niedriger als in den Zellen, die unter 2D-Bedingungen kultiviert wurden.

Darüber hinaus behielten 3D-Post-5-aza-CR-Zellen 28 Tage lang die erworbene sphärische 3D-Struktur, hohe Expressionsniveaus von pluripotenzbezogenen Genen und niedrige DNA-Methylierungswerte bei, woraufhin die Kultur gestoppt wurde. Die Mikrobioreaktoren können auch verwendet werden, um optimale Bedingungen für Vorläuferzellkulturen aufrechtzuerhalten und die Effizienz der terminalen Differenzierung zu steigern.