Name: Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala der frei verhaltenden Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala frei verhaltender Mäuse. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Überwachung genetisch definierter Zellpopulationen über mehrere Wochen.

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<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
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<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

Der Autor hat nichts zu verraten

Geschickte Operationstechniken sind unerlässlich, um eine erfolgreiche optische Kalzium-Bildgebung in vivo mit Kopf-Mount-Miniaturmikroskopie in tieferen Hirnregionen wie der Amygdala zu erreichen, wie wir sie hier beschrieben haben. Obwohl dieses Protokoll eine Richtlinie für optimierte chirurgische Prozesse der Grundplattenbefestigung und der GRIN-Linsenimplantation bietet, können zusätzliche Optimierungsprozesse für kritische Schritte erforderlich sein. Wie im Protokollabschnitt erwähnt, müssen Amygdala-Koordinaten in...

Kalzium ist ein allgegenwärtiger zweiter Botenstoff, der eine entscheidende Rolle in fast allen Zellfunktionen spielt8. In Neuronen führen Aktionspotentialabschuss und synaptische Sendeleistung zu einer schnellen Veränderung der intrazellulären freien [Ca2+]9,10. Daher bietet die Verfolgung von Kalziumtransienten die Möglichkeit, die neuronale Aktivität zu überwachen. GECIs sind leistungsstarke Werkzeuge, die die Überwachung [Ca2+] in definierten Zellpopulationen und intrazellulären Kompartimenten11,12ermöglichen. Unter vielen verschiedenen Arten von proteinbasiertem Kalziumindikator ist GCaMP, eine Ca2+-Sonde, die auf einem einzigen GFP-Molekül13basiert, die am meisten optimierte und daher am weitesten verbreitete GECI. Durch mehrere Runden des Engineerings wurde eine Reihe von Varianten von GCaMP entwickelt12,14,15,16. Wir verwenden einen der kürzlich entwickelten GCaMPs, GCaMP7b, in diesem Protokoll16. GCaMP-Sensoren haben wesentlich zur Untersuchung der Funktionen des neuronalen Schaltkreises in einer Reihe von Modellorganismen beigetragen, wie z. B. der Abbildung von Ca2+ Transienten während der Entwicklung17, in vivo Bildgebung in einer spezifischen kortikalen Schicht18, Messung der Schaltungsdynamik im Motoraufgabenlernen19 und Bildgebung der Zellensembleaktivität im Zusammenhang mit assoziativem Angstgedächtnis im Hippocampus und Amygdala20,21.
Optische Bildgebung von GECIs hat mehrere Vorteile22. Die genetische Codierung ermöglicht es, GECIs für einen längeren Zeitraum stabil in einer bestimmten Teilmenge von Zellen zu exprimieren, die durch genetisches Profil oder spezifische Muster anatomischer Konnektivität definiert sind. Optische Bildgebung ermöglicht in vivo chronische simultane Überwachung von Hunderten bis Tausenden von Neuronen bei lebenden Tieren. Einige optische Bildgebungssysteme wurden für die In-vivo-Bildgebung und Analyse von GECIs im Gehirn frei verhaltender Mäuse mit miniaturisierten Fluoreszenzmikroskopen21,23,24,25entwickelt. Obwohl die optische Bildgebungstechnik in vivo, die auf GECIs, GRIN-Objektiv und einem Head-Mount-Miniaturmikroskop basiert, ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um den Zusammenhang zwischen neuronaler Schaltkreisaktivität und Verhalten zu untersuchen, war die Anwendung dieser Technologie auf die Amygdala aufgrund mehrerer technischer Probleme im Zusammenhang mit der Ausrichtung der GRIN-Linse auf Zellen, die GECIs in der Amygdala exzieren, ohne Bewegungsartefakte zu verursachen, die die Qualität der Bildaufnahme stark reduzieren und Zellen finden, die GECIs exdrücken. Dieses Protokoll soll eine hilfreiche Richtlinie für chirurgische Verfahren der Baseplate-Anhaftung und GRIN-Linsenimplantation bieten, die entscheidende Schritte für eine erfolgreiche optische Kalzium-Bildgebung in vivo in der Amygdala sind. Obwohl dieses Protokoll auf die Amygdala abzielt, sind die meisten hier beschriebenen Verfahren allgemein auf andere tiefere Hirnregionen anwendbar. Obwohl dieses Protokoll auf einem bestimmten System (z. B. Inscopix) basiert, kann derselbe Zweck leicht mit anderen alternativen Systemen erreicht werden.

<table><tbody><tr><td>26G Nadel</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie Acryl-Zahnzement (Ortho-jet Acryl Rosa)</td><td>Lang</td><td>1334-pink</td><td>Chirurgie & Grundplatte Aufsatz</td></tr><tr><td>Luftströmungsmanipulator</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Grundplatte Aufsatz</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie Grundplatte</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Grundplatte Aufsatz</td></tr><tr><td>Grundplatte Abdeckung</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Grundplatte Aufsatz</td></tr><tr><td>Verhaltensapparat (Kammer)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Testkäfig</td><td>Verhaltenstest</td></tr><tr><td>Verhaltensapparatur (Software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Standbild</td><td>Verhaltenstest</td></tr><tr><td>Carbon Cage</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Datenverarbeitungssoftware</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Datenverarbeitungssoftware</td><td>Baseplate Befestigung & Verhaltenstest</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Bohrer Bohrer</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Glasnadel</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>GRIN Linse (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Kopfplatte</td><td>Neurotar</td><td>Modell 5</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie Sechskantschlüssel</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Grundplattenaufsatz</td></tr><tr><td>Laptop Computer</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Chirurgie & </td></tr><tr><td>INSCOPIX</td><td></td> <td>1050-004223</td> Greifer für <td>Operationsmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Mikroskop-Aufsatz für die Basisplatte</td></tr><tr><td>, Datenerfassungssoftware, Hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Basisplattenaufsatz & Verhaltenstest</td></tr><tr><td>Mobiler Homekäfig</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Moterisierter Arm</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Moterized Arm Software</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NI Board</td><td>Nationales Instrument</td><td></td><td>Verhaltenstest</td></tr><tr><td>Abnehmbare Epoxidbindung</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast Chirurgie</td><td></td></tr><tr><td>Harzzement (Super-Bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C& B</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Schädelschraube</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Elektrodenhalter</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Grundplattenaufsatz</td></tr></tbody></table>

erfolgreiche in-vivo-calcium-bildgebung mit einem kopfmontierten miniaturmikroskop in der amygdala der frei verhaltenden maus

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo Echtzeit-Überwachung von neuronalen Aktivitäten bei frei beweglichen Tieren ist einer der wichtigsten Ansätze, um neuronale Aktivität mit Verhalten zu verknüpfen. Zu diesem Zweck wurde eine in vivo-Bildgebungstechnik entwickelt, die Kalziumtransienten in Neuronen mithilfe genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs), eines miniaturisierten Fluoreszenzmikroskops und einer Gradienten-Refraktiven-Index-Linse (GRIN) erkennt und erfolgreich auf viele Gehirnstrukturen1,2,3,4,5,6angewendet. Diese bildgebende Technik ist besonders leistungsfähig, da sie eine chronische simultane Bildgebung genetisch definierter Zellpopulationen über einen längeren Zeitraum bis zu mehreren Wochen ermöglicht. Obwohl nützlich, diese bildgebende Technik wurde nicht leicht auf Gehirnstrukturen angewendet, die tief im Gehirn wie Amygdala, eine wesentliche Gehirnstruktur für emotionale Verarbeitung und assoziative Angst Gedächtnis7lokalisieren. Es gibt mehrere Faktoren, die es schwierig machen, die bildgebende Technik auf die Amygdala anzuwenden. Zum Beispiel treten Bewegungsartefakte in der Regel häufiger während der Bildgebung in den tieferen Hirnregionen auf, weil ein tief in das Gehirn implantiertes Kopf-Mount-Mikroskop relativ instabil ist. Ein weiteres Problem ist, dass der seitliche Ventrikel in der Nähe der implantierten GRIN-Linse positioniert ist und seine Bewegung während der Atmung zu hochunregelmäßigen Bewegungsartefakten führen kann, die nicht leicht korrigiert werden können, was es schwierig macht, eine stabile bildgebende Ansicht zu bilden. Da die Zellen in der Amygdala in der Regel in einem ruhenden oder anästhesierten Zustand ruhig sind, ist es schwierig, die Zielzellen, die GECI in der Amygdala exzieren, während des Baseplating-Verfahrens für eine spätere Bildgebung zu finden und zu fokussieren. Dieses Protokoll bietet eine hilfreiche Anleitung, wie zellen, die GECI in der Amygdala exemiten, effizient mit einem miniaturisierten Mikroskop mit Kopfmontage für eine erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung in einer so tieferen Hirnregion gezielt werden können. Es wird darauf hingewiesen, dass dieses Protokoll auf einem bestimmten System (z. B. Inscopix) basiert, aber nicht darauf beschränkt ist.

Validierung der GRIN-Linsenimplantation Bevor die Grundplatte chronisch durch Zementieren am Gehirn befestigt wird, muss die GRIN-Linsenimplantation validiert werden. Bei Tieren mit erfolgreicher Linsenimplantation wurden sowohl GCaMP-Extierzellen als auch Blutgefäße innerhalb eines Fokalebenenbereichs deutlich beobachtet, der durch den Abstand zwischen objektiver Linse des Mikroskops und implantierter GRIN-Linse bestimmt wurde (Abbildung 2Aund B...

In vivo mikroendoskopische Kalzium-Bildgebung ist ein unschätzbares Werkzeug, das Echtzeit-Überwachung von neuronalen Aktivitäten bei frei verhaltenden Tieren ermöglicht. Jedoch, Anwendung dieser Technik auf die Amygdala war schwierig. Dieses Protokoll soll eine nützliche Leitlinie für die erfolgreiche Ausrichtung auf Amygdala-Zellen mit einem miniaturisierten Mikroskop bei Mäusen bieten.

Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala der frei verhaltenden Maus

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Bei der Verwendung miniaturisierter Mikroskopie für die in vivo Kalziumbildgebung der Amygdala können viele Herausforderungen auftreten. Dieses Protokoll bietet zeitsparende Richtlinien für eine erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung. Die In-vivo-Calcium-Bildgebung ermöglicht die kontinuierliche gleichzeitige Bildgebung von genetisch definierten Zellpopulationen über einen Zeitraum von bis zu mehreren Wochen, ein Prozess, der bisher nicht möglich war.Für die AAV-Injektion richten Sie die anästhesierte Maus in einem stereotaktischen Rahmen aus, indem Sie die Höhe des Bregmas und des Lambdas mit dem Stift ausrichten und die spezifische Stelle auf dem freiliegenden und desinfizierten Schädel für die Kraniotomie identifizieren. Verwenden Sie einen Bohrer, der mit einem 0,6-Millimeter-Bohrer ausgestattet ist, um vorsichtig eine 1,6-Millimeter-Kraniotomie mit einer Bohrgeschwindigkeit von 18.000 Umdrehungen pro Minute durchzuführen und den Schädel mit sterilem PBS zu waschen. Subtrahieren Sie die dorsoventrale Differenz zwischen dem Bregma und der exponierten Hirnoberfläche von 4,2 Millimetern, der dorsoventralen Koordinate der Linsenimplantation basierend auf einem Bregma, um den Wert A-Abstand zu berechnen, und laden Sie drei Mikroliter Mineralöl und 0,7 Mikroliter eines mehr als eins mal 10 bis 13. viralen Genoms pro Milliliter der AAV-Lösung in eine Glaspipette.Entfernen Sie den Stift aus dem stereotaktischen Sondenhalter, damit die Pipette am Rahmen befestigt werden kann, und positionieren Sie die Pipette über der vorbereiteten Injektionsstelle. Wenn die Blutung vollständig gestoppt ist, führen Sie die Glaspipettenspitze 4,3 Millimeter in das Hirngewebe von der dorsoventralen Bregma-Koordinate ein und geben Sie mit einer Injektionspumpe das gesamte Virusvolumen ab, bevor Sie die Pipette langsam entfernen. Wenn das gesamte Virus injiziert wurde, bohren Sie den Schädel noch zwei weitere Male, um die Implantation von zwei Schädelschrauben zu ermöglichen, und waschen Sie die Schädelfraktionen mit PBS.Implantieren Sie anschließend die mit 70 % Ethanol sterilisierten Schrauben so tief wie möglich und installieren Sie einen motorisierten Operationsarm auf dem stereotaktischen Rahmen. Schließen Sie die erforderliche Hardware an einen Laptop an, auf dem die Steuerungssoftware installiert ist, und befestigen Sie mit einem Kanülenhalter eine 26-Gauge-Nadel stabil auf dem stereotaktischen Rahmen. Nachdem Sie die Koordinaten für die Nadeleinstichstelle berechnet haben, positionieren Sie die Nadelspitze mit dem stereotaktischen Manipulator an der freiliegenden Oberfläche des Gehirns und hydratisieren Sie das Hirngewebe mit zwei bis drei Tropfen PBS.Geben Sie die entsprechenden dorsoventralen und lateralen Amygdala-Koordinaten in die Software ein und klicken Sie auf Gehe zu, um die Nadel abzusenken. Wenn die Nadel vollständig zum Stillstand gekommen ist, geben Sie 45 Millimeter in das Feld für die Startposition ein und klicken Sie auf Gehe zu, um die Nadel anzuheben. Wenn sich die Nadel nicht mehr bewegt, entfernen Sie das PBS von der Gehirnoberfläche und entfernen Sie die Nadel und den Kanülenhalter aus dem stereotaktischen Rahmen.Befestigen Sie den Objektivhalter an der stereotaktischen Stange und befestigen Sie das GRIN-Objektiv am Objektivhalter. Sterilisieren Sie die Linse mit 70%igem Ethanol und befestigen Sie den stereotaktischen Stab am stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie die Spitze der GRIN-Linse an der dafür vorgesehenen Stelle auf der Hirnoberfläche und subtrahieren Sie den Absolutwert von A von der dorsoventralen Koordinate der Hirnoberfläche, um die dorsoventrale Koordinate für die Linsenimplantation zu bestimmen.Hydratisieren Sie das Hirngewebe mit zusätzlichen zwei bis drei Tropfen PBS und stellen Sie mit dem motorisierten Arm die Absenktiefe auf 1.000 Mikrometer und die Hebehöhe auf 300 Mikrometer ein. Wenn die GRIN-Linse die Zielstelle erreicht, entfernen Sie das PBS und tragen Sie vorsichtig Zahnharzzement um die GRIN-Linse, die Schrauben und die Schraubenseitenwände auf. Wenn der Zahnzement ausgehärtet ist, entfernen Sie den Linsenhalter von der Linse und tragen Sie Acrylzement auf die Schädeloberfläche auf.Ersetzen Sie als Nächstes den Objektivhalter durch eine Kopfplatte, die horizontal an der Spitze des Stabes befestigt ist. Senken Sie den Stab langsam ab, bis sich die Kopfplatte oben an der Lensmanschette befindet, bevor Sie die Kopfplatte um 1.000 Mikrometer absenken, bis sich das Objektiv am rechten Rand des Innenrings der Kopfplatte befindet. Verwenden Sie Acrylzement, um die Kopfplatte an den Zementschichten zu befestigen, und verwenden Sie Paraffinfilm, um die implantierte GRIN-Linsenoberfläche vor Staub zu schützen, tragen Sie dann eine abnehmbare Epoxidbindung auf die Paraffinfolie auf, um die Folie auf der Linsenoberfläche zu befestigen und das Tier bis zum vollständigen Liegen unter Überwachung in seinen Käfig zurückzubringen.Um die Qualität der GRIN-Linsenimplantation zu bewerten, platzieren Sie einen Kohlekäfig unter der betäubten Maus auf der Kopfstange eines Wohnmobilkäfigsystems und schalten Sie den Luftstrom ein, so dass sich der Käfig frei und ohne Reibung bewegt. Verwenden Sie einen Mikroskopgreifer und einen stereotaktischen Manipulator, um ein miniaturisiertes Mikroskop vertikal auf den Rahmen auszurichten, bevor Sie das Mikroskop absenken, bis die Oberfläche der implantierten GRIN-Linse im Bildsichtfeld in der Software erscheint. Richten Sie die Mitte der implantierten GRIN-Linse mit der Mitte des Sichtfelds aus und nehmen Sie das Bild der implantierten GRIN-Linsenoberfläche auf, heben Sie dann langsam die Objektivlinse des Mikroskops an, während Sie das Bild auf das Erscheinungsbild von GCaMP-exprimierenden Zellen beobachten.Bei Tieren mit einer erfolgreichen Linsenimplantation können sowohl GCaMP-exprimierende Zellen als auch Blutgefäße innerhalb eines einzigen Fokusebenenbereichs deutlich beobachtet werden. Im Gegensatz dazu wird bei Tieren mit Off-Target-Implantation kein klares Bild von GCaMP-exprimierenden Zellen im Bereich der Fokusebene beobachtet, obwohl die Blutgefäße mit einigen Schwierigkeiten beobachtet werden können. Bei einer Linse außerhalb des Sichtfelds können weder Blutgefäße noch GCaMP-exprimierende Zellen sichtbar gemacht werden und auf der implantierten GRIN-Linse ist ein heller Rand zu beobachten.Bei Tieren mit einer erfolgreichen GRIN-Linsenimplantation zeigen etwa 50 bis 150 wahrscheinlich spontan aktive Zellen in der Regel auch ohne Tonus eine signifikante Fluoreszenzänderung im Sichtfeld in der lateralen Amygdala. Bei der Tonpräsentation zeigen nur wenige Zellen eine tonspezifische Änderung des GCaMP-Signals, die durch die Delta-F-Bildanalyse bestimmt wurde. Wenn die gleiche Analyse an Mäusen durchgeführt wird, denen GFP-exprimierendes AAV als Kontrolle injiziert wurde, werden GFP-exprimierende Zellen innerhalb des Bereichs der Fokusebene nachgewiesen, und keine der Zellen zeigt eine signifikante Fluoreszenzänderung mit oder ohne Ton.Die histologische Überprüfung der GCaMP-Expression und des GRIN-Linsen-Targetings zeigt keine Anzeichen einer Gewebeschädigung aufgrund einer Entzündung des Hirngewebes um die GRIN-Linse. Wenn die Geschwindigkeit der Nadel oder des Objektivs nicht konstant ist, kann dies zu Bewegungsartefakten und schlechter Bildqualität führen. Die Verwendung eines motorisierten Operationsarms kann helfen.Wenn das mobile Home-Care-System während des Schritts der Befestigung der Basisplatte nicht bereit ist, kann eine niedrige Konzentration an Isoflurangas verwendet werden, um die Maus während der Befestigung der Basisplatte zu betäuben.

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