Name: Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR-Cas9-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation zur Erzeugung männlich-steriler Reislinien durch Knockout des OsABCG15-Gens. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung in Oryza sativa.

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Die Autoren würdigen Xiaofei Chen für die Bereitstellung der jungen Reisblüten und Hilfe bei der Herstellung der Reisgewebekultur Medium. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31900611) unterstützt.

1. sgRNA-CAS9 Pflanzenexpressionsvektorkonstruktion und Agrobacterium-vermittelte Transformation
<ol><li>Ziel eines männlichen sterilen Genos OsABCG15 in Reis nach der veröffentlichten Literatur28.</li>
	<li>Entwerfen Sie sgRNA für den Zielstandort zwischen 106–125 bp im zweiten Exon von OsABCG15 (Abbildung 1).</li>
	<li>Verwenden Sie T4-Polynukleotidkinase, um die sgRNA-Oligos zu synthetisieren (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' und 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').</li>
	<li>Verwenden Sie Endonuklease BbsI, um den psgR-Cas9 Backbone-Vektor29zu verdauen.</li>
	<li>Ligate die synthetisierten sgRNA Oligos mit linearisiertem psgR-Cas9 Backbone unter Verwendung von T4 Ligase nach dem Herstellerprotokoll.</li>
	<li>Verdauen Sie mit HindIII/EcoRI die sgRNA-Kassette aus Schritt 1.5 und subklonieren Sie in die HindIII/EcoRI-Site des pCAMBIA1300 Binärvektors für eine stabile Transformation29.</li>
	<li>Bestätigen Sie das konstruierte Plasmid durch Enzymverdauung und Sequenzierung. Verwandeln Sie später das binäre Konstrukt in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 und wachsen Sie sie auf Kan/Rif-Selektionsplatten bei 28 °C für 2–3 Tage an.</li>
</ol>2. Reis-Genumwandlung und Pflanzengewebekultur
<ol><li>Callus-Induktion und Regeneration HINWEIS: Verwenden Sie frische junge Reisblüten als Ausgangsmaterial, um Callus zu induzieren (Abbildung 2).<ol>
<li>Sammeln Sie die jungen Blütenstände aus dem Reisfeld oder grünen Haus in der Meiose-Stufe, bestimmt durch Die Blütenlänge von 1,6-4,8 mm (Abbildung 2A)29. Stellen Sie sicher, dass die Reisblüten mit Blattscheide bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70% Alkoholabstrich ab und lassen Sie ihn vor dem Schneiden trocknen.</li>
		<li>Bringen Sie den Blütenstand auf eine saubere sterile Bank. Schneiden Sie es in kleine Stücke (je kleiner desto besser) mit sterilisierter Schere und übertragen Sie dann Stecklinge auf eine Petriplatte mit NBD2 Medium (Abbildung 2B, Tabelle 1).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 °C für etwa 10-14 Tage, um Callus zu induzieren (Abbildung 3A). HINWEIS: Verwenden Sie den neu gebildeten Callus für Agrobacterium-Infiltration (Schritt 2.2.7) direkt oder rekonditionieren Sie ein anderes Mal in frischem NBD2-Medium, um mehr Callus zu erhalten. Übertragen Sie den Callus alle 8–10 Tage in das neue NBD2-Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformation und Kokultivierung<ol>
<li>Verwenden Sie A. tumefaciens-Bakterien, die das binäre Plasmid aus Schritt 1.6 für die Transformation enthalten. Bewahren Sie die A. tumefaciens-Stämme in YEB-Medium(Tabelle 1) mit 50 % Glycerin bei -80 °C für die weitere Verwendung auf.</li>
		<li>Streifen A. tumefaciens von einem -80 °C Glycerinbestand zu YEB Agar Medium, das selektive Antibiotika enthält (Tabelle 1) und wachsen bei 25–28 °C für 48–72 h, damit Kolonien auftreten können.</li>
		<li>In einem 50 ml konischen sterilen Reagenzglas wird eine einzelne Kolonie von der YEB-Platte mit selektiven Antibiotika auf 5 ml flüssiges YEB-Medium mit denselben selektiven Antibiotika (Tabelle 1)geimpft. Schütteln Sie auf einem Orbital-Shaker bei 250 x gbei 25–28 °C, bis Bakterien auf eine OD600 von 0,5 anwachsen.</li>
		<li>1 ml bakterielle Suspension zu 100 ml YEB-Medium (Tabelle 1) mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250 ml konischen Kolben hinzufügen und auf einem Orbital-Shaker bei 250 x gschütteln, bei 28 °C für 4 h.</li>
		<li>Zentrifuge bei 4.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Das bakterielle Pellet mit AAM-AS-Medium (Tabelle 1) aussetzen und die Suspension auf eine OD600 = 0,4 verdünnen. HINWEIS: Die perfekte OD der bakteriellen Suspension ist entscheidend für eine effiziente Transformation. Es hilft bei der Beseitigung überschüssiges bakterielles Wachstum auf dem Callus.</li>
		<li>Sammeln Sie rund 150 gesunde, leichtgelbe zerbrechliche embryogene Calli aus Schritt 2.1.3 in einen 150 ml sterilen Kolben. Fügen Sie 50–75 ml bakterielle Zellsuspension ab Schritt 2.2.6 in den sterilen Kolben und fügen Sie dann etwa 10-25 ml frisches AAM-AS-Medium hinzu, um den Calli für 10–20 min einzutauchen und gelegentlich zu schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die überschüssige bakterielle Suspension aus dem Callus mit sterilem Filterpapier #1 oder Tissuepapier. Dann legen Sie sie auf eine Petrischale mit NBD-AS Medium (Tabelle 1) mit einem sterilen Filterpapier #1 bedeckt. Bei 25–28 °C im Dunkeln 3 Tage lang inkubieren und auf bakterielles Überwuchern überprüfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Auswahl für widerstandsfähigen Callus<ol>
<li>Nach 3 Tagen Kokultivierung die Calli mit einem sterilen Filterpapier in eine sterile Petrischale geben.</li>
		<li>Lufttrocknen Sie den Calli für 2 h auf einer sauberen Bank. Stellen Sie sicher, dass der Callus nicht am Filterpapier haftet.</li>
		<li>Übertragen Sie die Calli gleichmäßig mit steriler Pinzette auf das Primäreselektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/L Hygromycin und 250 mg/L Timentin) (Tabelle 1). Kultur calli für 2 Wochen bei 25–28 °C im Dunkeln.</li>
		<li>Nach 2 Wochen Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/L Hygromycin und 250 mg/L Timentin) übertragen (Tabelle 1). Kultur die Calli für weitere 2 Wochen bei 25–28 °C im Dunkeln.</li>
	</ol></li>
	<li>Callus-Differenzierung<ol>
<li>Transfer Callus auf frisches MS Medium (mit 25 mg/L Hygromycin und 150 mg/L Timentin) (Tabelle 1). Kultur unter dem Licht bei 25–28 °C für ca. 2 Wochen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.4.1 noch einmal.</li>
		<li>Übertragen Sie die Triebknospen auf das neue MS-Medium (mit 10 mg/L Hygromycin), um mehr Triebe zu vermehren.</li>
	</ol></li>
	<li>Wurzelinduktion<ol>
<li>Übertragen Sie die neuen Triebe in 1/2 MS medium (Tabelle 1). Kultur unter dem Licht bei 25 °C - 28 °C. Die transformierten Pflanzen produzieren Wurzeln innerhalb von 2 Wochen.</li>
		<li>Nach 1 Woche, übertragen Sie die Pflanzen zu reinigen Töpfe, die die Pflanze zu reinigen, um Austrocknung zu verhindern.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Genotyp-Identifikation
<ol><li>Sammeln Sie junge Blätter aus neu erzeugten Pflanzen für die gesamte DNA-Extraktion mit der Cetyltrimethyl-Ammoniumbromid -Methode (CTAB)31.</li>
	<li>Wählen Sie anhand der genomischen DNA als Vorlage die Primer (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' und Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCTCTTTCA 3' in der Hygromycin-Region) aus, um die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchzuführen, um die Transgenintegration und die Frequenzen zu validieren (Abbildung 4). Folgende PCR-Bedingungen: 94 °C für 5 min; 36 Zyklen (94 °C für 30 s; 56 °C für 30 s; 72 °C für 1 min ); 72 °C für 7 min. Erfolgreiche PCR-Reaktionen ergeben ein 604 bp Amplikon.</li>
	<li>Führen Sie eine weitere PCR-Datei durch, um die genomische Region um die CRISPR-Zielstandorte mit spezifischen Primern (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCTCTCACAACAGTTTCT 3' und OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') zu verstärken, um den Genotyp der Transformatoren zu identifizieren. Die PCR-Bedingungen sind die gleichen wie in Schritt 3.2.</li>
	<li>Verwenden Sie PCR-Fragmente aus Schritt 3.3 direkt für die Sanger-Sequenzierung, um Mutationen zu identifizieren.</li>
</ol>4. Beobachten Sie den grundlegenden Phänotyp des Mutanten
<ol><li>Bereiten Sie die I2-KI-Lösung vor: 2 g KI (Kaliumjodid) in 10 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 0,2 g I2 (resublimed Jod) darin hinzufügen. Nach dem Mischen das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml bringen.</li>
	<li>Bereiten Sie die FAA-Lösung (63% wasserfreies Ethanol, 5% Eisessigsäure, 5% Formaldehyd und 27% Wasser) vor und mischen Sie vor der Verwendung.</li>
	<li>Die 0,5% Toluidin-Blaufärbungslösung vorbereiten: 0,5 g Toluidinblau in 100 ml destilliertem Wasser auflösen.</li>
	<li>Führen Sie eine vegetative phätotypische Beobachtung durch, indem Sie die ganzen Pflanzen mit einer Digitalkamera bebildern.</li>
	<li>Führen Sie reproduktive Phänotyp Beobachtung, entfernen Sie die Paläa und Lemma aus dem Florett. Nehmen Sie Fotos von ganzen Anthern unter einem Stereomikroskop auf.</li>
	<li>Beobachten Sie die Pollenlebensfähigkeit durch Jodfärbung.<ol>
<li>Wählen Sie reife Reisspieße vor der Blütenanthese, entfernen Sie die Paläa und Lemma, um die Anther freizusetzen.</li>
		<li>Nehmen Sie 6 Anther und legen Sie sie auf eine Glasrutsche. Fügen Sie 1 Tropfen destilliertes Wasser hinzu, zerkleinern Sie den Anther gut mit einer Pinzette, um die Pollenkörner freizusetzen, und fügen Sie dann 2–3 Tropfen I2-KI Lösung hinzu. Abdeckung mit dem Coverslip.</li>
		<li>Beobachten Sie unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung. Pollenkörner, die schwarz gefärbt sind, zeigen eine kräftigere Lebensfähigkeit, keine Farbe oder gelbbraun gefärbt eaktiert oder degeneriert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie einen halbdünnen Abschnitt Reis-Anther<ol>
<li>Fixieren Sie die Reisblumen aus verschiedenen Entwicklungsstadien in eine FAA-Lösung. Vakuumieren Sie die Materialien bei 4 °C (in der Regel 15 min), damit das Fixativ in das Gewebe eindringen kann, bis das Material auf den Boden der Sammelflasche sinkt.</li>
		<li>Ersetzen Sie dies am nächsten Tag durch eine neue FAA-Lösung. Sobald das Material nach unten sinkt, mit 70% Ethanol ersetzen und bei 4 °C für den langfristigen Einsatz lagern.</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Materialien mit unterschiedlichen Ethanolgradienten (70%, 80%, 95% jedes Mal für 30 min, 100% Ethanol für 2 h, 100% Ethanol mit etwas Safraninfarbstoff für 2 h). HINWEIS: Fügen Sie ein wenig Safranin Farbstoff in die zweite 100% Ethanol, um die Anther für eine einfachere Schnitt nach.</li>
		<li>Führen Sie die Einbettung durch befolgen sie der Anweisung des Herstellers (Tabelle der Materialien). Dann im Ofen bei 60 °C für 48 h vor dem Schnitt backen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Probe mit einem Mikrotom auf eine Dicke von 2 m ab. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Glasrutsche hinzu. Nehmen Sie dann die dünnen Abschnitte, die Antherblöcke enthalten, mit Zangen auf und legen Sie sie auf die Oberfläche des Wassertropfens auf den Rutschen.</li>
		<li>Legen Sie die Rutschen auf das Wasserbad bei 50 °C, um die Abschnitte vollständig zu verteilen, damit sie fest an der Rutsche haften.</li>
		<li>Verwenden Sie 0,5% Toluidin blau Lösung Flecken die Dias für 30 min. Dann mit Wasser abspülen und in der Dunstabzugshaube trocknen. Mit neutralem Baumkleber versiegeln. Legen Sie vorsichtig einen Deckelrutsch auf die Rutsche und trocknen Sie in der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Beobachten und fotografieren Sie die Probe unter dem Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
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Künstliche genegene männliche sterile Mutanten werden traditionell durch zufällige physikalische, chemische oder biologische Mutagenese erzeugt. Obwohl dies mächtige Techniken sind, kann ihre zufällige Natur nicht aus der riesigen Menge an modernem genomischem Wissen Kapital schlagen, das das Potenzial hat, maßgeschneiderte Verbesserungen in der molekularen Züchtung zu liefern32. Das CRISPR-Cas9-System ist aufgrund seiner einfachen und erschwinglichen Möglichkeiten zur Manipulation und Bearbeitung...

Reis ist die wichtigste Nahrungsmittelpflanze, insbesondere in Entwicklungsländern, und stellt für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ein Grundnahrungsmittel dar. Insgesamt wächst die Nachfrage nach Reisgetreide und wird bis 2030 voraussichtlich um 50 % und bis 2050 um 100 % ansteigen1,2. Zukünftige Verbesserungen des Reisertrags müssen aus verschiedenen molekularen und genetischen Ressourcen kapitalisieren, die Reis zu einem ausgezeichneten Modell für monokotyledonöse Pflanzenforschung machen. Dazu gehören ein effizientes Transformationssystem, fortschrittliche molekulare Karte und öffentlich zugängliche Datenbank von ausgedrückten Sequenz-Tags, die über viele Jahre generiert wurden3,4. Eine Strategie zur Verbesserung des Ernteertrags ist die Hybridsaatgutproduktion5, ein zentrales Element davon ist die Fähigkeit, die männliche Fruchtbarkeit zu manipulieren. Das Verständnis der molekularen Kontrolle der männlichen Fruchtbarkeit in Getreidepflanzen kann dazu beitragen, Schlüsselwissen in praktische Techniken umzusetzen, um die Hybridsaatgutproduktion zu verbessern und die Ernteproduktivität zu verbessern6,7.
Die genetische Transformation ist ein Schlüsselinstrument für die Grundlagenforschung und die kommerzielle Landwirtschaft, da sie die Einführung fremder Gene oder die Manipulation endogener Gene in Kulturpflanzen ermöglicht und zur Erzeugung genetisch veränderter Linien führt. Ein geeignetes Transformationsprotokoll kann dazu beitragen, genetische und molekularbiologische Studien für ein grundlegendes Verständnis der Genregulation zu beschleunigen8. Bei Bakterien findet die genetische Transformation auf natürliche Weise statt; jedoch wird es in Pflanzen künstlich mit molekularbiologischen Techniken9,10durchgeführt. Agrobacterium tumefaciens ist ein bodengestütztes, gramnegatives Bakterium, das Kronengallenerkrankungen in Pflanzen verursacht, indem es T-DNA, eine Region seines Ti-Plasmids, über ein Sekretionssystem vom Typ IV11,12in die Pflanzenzelle überträgt. In Pflanzen wird die A. tumefaciens-vermittelte Transformation als weit verbreitete Methode zur Genmodifikation betrachtet, da sie zu einer stabilen und niedrigen Kopierzahl der Integration von T-DNA in das Wirtsgenom13führt. Transgener Reis wurde erstmals Mitte der 1990er Jahre durch Agrobacterium-vermittelte Gentransformation in der Japonica-Sorte14erzeugt. Mit diesem Protokoll wurden innerhalb von 4 Monaten mehrere transgene Leitungen mit einer Transformationseffizienz von 10%–30% erhalten. Die Studie zeigte, dass es zwei entscheidende Schritte für die erfolgreiche Transformation gibt: einer ist die Induktion von embryogenen Callus aus reifen Samen und ein anderer ist die Zugabe von Acetosyringon, einer Phenolverbindung, zur Bakterienkultur während der Kokultivierung, die eine höhere Transformationseffizienz in Pflanzenermöglicht 14,15. Dieses Protokoll wurde ausgiebig mit kleineren Änderungen in japonica16,17,18,19 sowie anderen Sorten wie Indica20,21,22,23 und tropischen japonica24,25verwendet. Tatsächlich verwenden über 80% der Artikel, die die Reistransformation beschreiben, Agrobacterium-vermittelte Gentransformation als Werkzeug13. Bis heute wurden mehrere genetische Transformationsprotokolle entwickelt, die Reissamen als Ausgangsmaterial für die Callusinduktion16,17,18,19verwenden. Über den jungen Blütenstand als Explants für die Callusproduktion ist jedoch nur sehr wenig bekannt. Insgesamt ist es wichtig, ein schnelles, reproduzierbares und effizientes Gentransformations- und Regenerationsprotokoll für die funktionelle Genomik und Studien zur Verbesserung von Pflanzen zu erstellen.
In den letzten Jahren hat die Weiterentwicklung der CRISPR-Cas9-Technologie zu einem präzisen Genom-Editing-Mechanismus geführt, um die Genfunktion zu verstehen und agronomisch wichtige Verbesserungen für die Pflanzenzüchtung zu liefern26,27. CRISPR bietet auch erhebliche Versprechen für die Manipulation der männlichen Reproduktionsentwicklung und Hybridproduktion. In dieser Studie nutzten wir ein Gen-Knockout-System mit CRISPR-Cas9-Technologie und koppelten es an ein effizientes Reisgentransformationsprotokoll, das junge Blütenstände als Explanten verwendete, wodurch stabile männliche sterile Linien für die Untersuchung der Reproduktionsentwicklung geschaffen wurden.

<table><tbody><tr><td>1-Naphthalinessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurin (6-BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.,</td><td>Ltd 10000561</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Aneurinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Ethanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologisches Pepton</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>Rindfleischextrakt</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Kaseinsäurehydrolysat</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt(II)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose wasserfreies</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63011037</td> EDTA, <td></td></tr><tr><td>Dinatriumsalz, Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS Digitale SLR- und Kompaktsystemkameras</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Vollautomatisches Rotationsmikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Mangansulfat-Monohydrat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskope</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumnitrat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxinhydrochlorid (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Natriummolybdatdihydrat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Technovit Embedding Kits 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Deutschland</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad für Paraffinschnitte</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfat-Heptahydrat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated genetic transformation, transgenic production, and its application for the study of male reproductive development in rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Männliche Sterilität ist eine wichtige agronomische Eigenschaft für die Hybridsamenproduktion, die in der Regel durch funktionelle Defekte in männlichen Fortpflanzungsorganen/Gameten gekennzeichnet ist. Jüngste Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen eine hohe Editing-Wirksamkeit und zeitsparende Knockout-Mutationen endogener Kandidatengene an bestimmten Standorten. Darüber hinaus ist Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von Reis auch eine Schlüsselmethode zur Genmodifikation, die von vielen öffentlichen und privaten Laboratorien weit verbreitet ist. In dieser Studie haben wir CRISPR-Cas9 Genombearbeitungswerkzeuge eingesetzt und erfolgreich drei männliche sterile Mutantlinien durch gezielte Genombearbeitung von OsABCG15 in einer Japonica-Sorte erzeugt. Wir verwendeten eine modifizierte Agrobacterium-vermittelteReistransformationsmethode, die hervorragende Mittel zur genetischen Easculation für die Hybridsamenproduktion in Reis bieten konnte. Transgene Pflanzen können innerhalb von 2–3 Monaten erhalten werden und homozygote Transformanten wurden durch Genotypisierung mittels PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung gescreent. Die grundlegende phänotypische Charakterisierung der männlichen sterilen homozygoten Linie wurde durch mikroskopische Beobachtung der männlichen Reisvermehrungsorgane, Pollenlebensfähigkeitsanalyse durch Jodkaliumjodid (I2-KI) durchgeführt, indem halbdünne Querschnitte von sich entwickelnden Anthern färben.

Gezeigt wird hier der Einsatz von Gen-Editing-Technologie, um eine männliche sterile Linie für zukünftige Forschung von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen. Um die männliche sterile Linie von osabcg15zu erstellen, wurde CRISPR-CAS9-vermittelte Mutagenese für die binäre Vektorkonstruktion verwendet. Die sgRNA wurde vom OsU3-Promotor angetrieben, während die Expressionskassette von hSpCas9 vom doppelten 35S-Promotor angetrieben wurde und der mittlere Vektor in einem ein...

Diese Arbeit beschreibt den Einsatz der CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Technologie, um das endogene Gen OsABCG15 zu knockouten, gefolgt von einem modifizierten Agrobacterium-vermitteltenTransformationsprotokoll, um eine stabile männlich-sterile Linie in Reis zu produzieren.

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und eine Regenerationsmethode zur Aufdeckung der Genfunktion sowie zur Verbesserung der Ernte zu etablieren. Junge Blütenstände als Explantation für die Callusproduktion sind wichtig, um eine schnelle und effiziente Gentransformation und die Regenerationsmethode zur Enthüllung der Genfunktion zu etablieren. Video-Demonstration dieser Technik wird dem Betrachter helfen, den Prozess der Wartung der Materialien zu verstehen, um die gewünschte transgene Ausrichtung zu produzieren, ohne Zeit und Mühe zu verschwenden.Beginnen Sie mit dem Sammeln von jungen ReisBlüten aus dem Reisfeld oder einem Gewächshaus in der Meiose-Phase, um sicherzustellen, dass sie mit dem Blattmantel bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70%alkoholabstrich ab und lassen Sie ihn vor dem Schneiden trocknen. Bringen Sie den Blütenstand auf eine sterile Laborbank und schneiden Sie ihn mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke, und übertragen Sie die Stecklinge dann auf eine Petriplatte, die NBD2-Medium enthält.Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 Grad Celsius für 10 bis 14 Tage, um Callus zu induzieren. Um die Transformation durchzuführen, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von der weißen EB-Platte mit selektiven Antibiotika auf fünf Milliliter flüssiges YEB-Medium, das die gleichen Antibiotika in einem 50 Milliliter konischen sterilen Reagenzglas enthält. Schütteln Sie die Röhre auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 25 bis 28 Grad Celsius, bis Bakterien auf eine OD 600 von 0,5 wachsen.Fügen Sie einen Milliliter bakterielle Suspension zu 100 Milliliter YEB Medium mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250 Milliliter konischen Kolben und schütteln Sie den Kolben auf einem Orbital-Shaker bei 250 mal g und 28 Grad Celsius für vier Stunden. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit DemaUM AS Medium wieder auf, und verdünnen Sie die Suspension dann auf eine OD 600 von 0,4.Sammeln Sie nach der Inkubation rund 150 gesunde hellgelbe embryogene Calli in einen 150 Milliliter sterilen Kolben. Fügen Sie 50 bis 75 Milliliter der bakteriellen Zellsuspension in den Kolben und fügen Sie dann 10 bis 25 Milliliter frisches AAM AS Medium hinzu, um den Calli für 10 bis 20 Minuten einzutauchen, gelegentlich schüttelnd. Gießen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die Calli mit sterilem Filterpapier, legen Sie sie dann auf eine Petrischale mit NBD AS Medium und bedecken Sie sie mit Filterpapier.Inkubieren Sie die Calli bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln für drei Tage, überprüfen Sie sie auf bakterielles Überwuchern. Nach drei Tagen Kokultivierung die Calli mit Filterpapier auf eine sterile Petrischale übertragen und dann zwei Stunden auf einer sauberen Bank an die Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Calli nicht am Filterpapier behaftet sind, und übertragen Sie sie an das primäre Auswahlmedium NBD2.Nach zwei Wochen die Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium übertragen, dann die Calli zur Differenzierung auf frisches MS-Medium und die Triebknospen mit 10 Milligramm pro Liter Hygromycin auf MS-Medium verschieben, um mehr Triebe zu vermehren. Übertragen Sie die neuen Triebe in das halbe MS-Medium für die Wurzelinduktion und kultiieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius unter Licht. Die transformierten Pflanzen sollten innerhalb von zwei Wochen Wurzeln produzieren.Um reproduktive Phänotyp Beobachtung durchzuführen, entfernen Sie die Paläa und Lemma aus dem Florid und Bild der ganzen Anther unter einem Stereomikroskop. Um die Lebensfähigkeit der Pollen zu beobachten, pflücken Sie reife Reisspieße vor der Blütenanthese und entfernen Sie die Paläa und das Lemma, um die Anther freizusetzen. Nehmen Sie sechs Anther und legen Sie sie auf eine Glasrutsche.Fügen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser hinzu, zerkleinern Sie den Anther mit einer Pinzette, um die Pollenkörner freizusetzen, dann fügen Sie zwei bis drei Tropfen Jodlösung hinzu und decken Sie ihn mit einem Deckelabschlag ab. Beobachten Sie das Dia unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung. Pollenkörner, die schwarz gefärbt sind, zeigen eine kräftigere Lebensfähigkeit, während Körner ohne Farbe oder die gelbbraun gefärbten verkümmert oder degeneriert sind.Um die Transverformungsmikroskopie durchzuführen, verwenden Sie 0,5% Toluidin-Blaulösung, um die Dias 30 Minuten lang zu färben, dann mit Wasser abspülen und in der Dunstabzugshaube trocknen. Nach dem Trocknen die Dias mit neutralem Baumkleber versiegeln, einen Deckelrutsch vorsichtig auf den Schlitten legen und in der Dunstabzugshaube trocknen und dann die Probe unter dem Mikroskop abbilden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine männliche sterile Linie von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen.Die embryogenen Calli wurden direkt für die Umwandlung verwendet oder für die Proliferation subkultiviert, um mehr Calli für eine weitere Infektion zu erhalten. Nach 48 Stunden Mitkultivierung wurden die Calli in eine zweite Runde des Auswahlmediums verlegt. Nach 10 bis 14 Tagen zeigten transformierte Calli neu gebildete Mikrocalli, während die untransformierten Calli braun wurden und starben.Später wurden gesunde und cremig gefärbte Calli in regenerationsmittel übertragen. Der verwandelte Calli zeigte nach und nach grüne Flecken. Diese grünen Flecken wurden im Regenerationsmedium kultiviert, um das Triebwachstum zu ermöglichen, und dann in die Hälfte des MS-Mediums verschoben, um Wurzeln zu induzieren.Später wurden gesunde und kräftig wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet. Insgesamt wurden 21 regenerierte Sämlinge gewonnen. Die PCR-Verstärkung für die Hygromycin-Region zeigte, dass die Transformationshäufigkeit etwa 85,71% betrug. Die Transformationsmittel wurden genotypisiert, um die Mutationen an den sgRNA-Zielstandorten zu identifizieren.Unter den 18 transgenen Pflanzen waren acht heterozygote Linien und drei homozygote Linien CRISPR CAS9 positiv. Die homozygoten Knockout-Mutanten wurden durch grundlegende männliche Fortpflanzungsorganbeobachtung validiert. Die Anther von osabcg15 waren kleiner und blasser als die der wilden Art und es fehlten reife Pollenkörner.Transversalschnittmikroskopie wurde durchgeführt, um die anther morphologischen Defekte in osabcg15 zu untersuchen. In Stufe 10 wurden wilde Mikrosporen rund geformt und mit dunkelblau gebeiztem Exine vakant. Im Gegensatz dazu brach die osabcg15 Mikrosporen zusammen und degradierte.Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass sich das gesammelte Material im Meiosestadium befindet, und die Lufttrockenzeit der Calli zu steuern.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Quelle: Beernink, B. M. et al. Direkte Agroinokulation von Maissetzlingen durch Injektion mit rekombinanten Fuchsschwanzmosaikvirus- und Zuckerrohrmosaikvirus-infektiösen Klonen. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert die durch Agrobacterium vermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing. Es beschreibt den Prozess der Agrobacterium-Infektion , systemische virale Ausbreitung und phänotypische Veränderungen durch RNA-Interferenz.

Agrobakterienvermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing

In diesem Video demonstrieren wir die genetische Transformation des Reisgenoms mit Hilfe eines binären Vektors von Agrobacterium tumefaciens. Dieses Bakterium erleichtert die Übertragung eines fremden DNA-Plasmids mit Hilfe von Agrobacterium-Virulenzproteinen.

Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation: Eine Methode zur genetischen Transformation des Reisgenoms mittels gentechnisch verändertem Agrobacterium tumefaciens

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Pflanzenmorphogene können verwendet werden, um die genetische Transformation widerspenstiger Genotypen zu verbessern. Beschrieben wird hier ein Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation (QuickCorn) Protokoll für drei wichtige öffentliche Mais-Inzuchtlinien.

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Aufgrund seiner vielseitigen Anwendung als Modellart in verschiedenen Forschungsbereichen besteht ein Bedarf an einem genetischen Transformationswerkzeug für den Schmalblättrigen Wegerich (Plantago lanceolata).  In dieser Arbeit wird unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation ein Protokoll vorgestellt, das zu stabilen transgenen Linien mit einer Transformationseffizienz von 20% führt.

Agrobacterium tumefaciens-vermittelte genetische Transformation des Spitzwegerichs

Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation (AMT) zur Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom der grünen Mikroalge Chlorella vulgaris, was zur Produktion stabiler Transformanten führt.

Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentechnik von Grünen Mikroalgen, Chlorella vulgaris

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.

Breeding by Design für funktionellen Reis mit Genome Editing Technologies

Wir präsentieren ein effizientes, optimiertes Protokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica, ohne ressourcenintensive sterile Gewebekulturverfahren. Durch die Nutzung eines visuellen Transformationsmarkers und einer Triebregenerationspipeline wurden erfolgreich nahe klonale Transformanten erzeugt und somit zukünftige Studien zur Anpassung der Pflanzen an die Unterwasserumgebung vorangetrieben.

Effiziente, regenerationsbasierte Agrobakterien-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica

Testen visuelle Empfindlichkeit in Echsen mit einem operante Konditionierung, die Video-Wiedergabe von random-dot kinematograms und computer-generierte Wirbellosen beschäftigt.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Erfahren Sie die CRISPR-Cas9-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation zur Erzeugung männlich-steriler Reislinien durch Knockout des OsABCG15-Gens. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung in Oryza sativa.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice (Video) | JoVE Journal

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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