Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye
14. Januar 2021
Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.
Diese neue effiziente Methode zur Isolierung von Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoiden von erwachsenen Mäusen kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Diese Methode verwendet einen DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität mit einem breiten Anregungsspektrum, das auf die meisten derzeit verwendeten FACS-Aufträge angewendet werden kann. Diese Methode ist sehr einfach.
Der schwierigste Aspekt ist die Flusszytometrie-Gating, aber die detaillierte Gating-Strategie sollte bei der Anpassung des Protokolls an andere Zellensortierer helfen. Demonstriert wird das Verfahren von Yu-Han Yeh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter des Satoshi Namekawa Labors. Nach der Ernte beider Hoden von einer acht Wochen alten männlichen Maus, legen Sie das Gewebe in eine 60 Millimeter Petrischale mit zwei Millilitereeis PBS und entfernen Sie die Tunika albuginea.
Trennen Sie die Hoden vorsichtig mit Zangen, um die seminiferen Tubuli leicht zu zerstreuen. Und die Tubuli in einen Tropfen frische eiskalte PBS in einer 100-Millimeter-Petrischale übertragen. Verwenden Sie die Zange, um die Tubuli sanft zu entwirren und die Tubuli in drei zusätzlichen Tröpfchen PBS zu waschen, wie gerade gezeigt.
Nach der letzten Wäsche die entwirrten seminiferen Tubuli in ein 15-Milliliter-Rohr geben, das zwei Milliliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius enthält. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Tubuli 20 Mal sanft zu pipetten, bevor Sie das Rohr für weitere sechs Minuten zum Inkubator zurückgeben. Am Ende der Inkubation, Pipette das Gewebe zusätzlich 20 Mal, bevor die Röhre zum Inkubator zurück.
Nach drei Minuten die Tubuli 10 Mal sanft pipetten oder bis keine sichtbaren Gewebestücke übrig bleiben, bevor die Dissoziation mit 10 MilliliterN FACS-Puffer gestoppt wird. Dann Zentrifuge zur Gewebesuspension zweimal mit einem zusätzlichen 10 Milliliter für frischen FACS Puffer für die zweite Wäsche, um die Spermatozoen und so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. Um die Zellen für die zytometrische Durchflussanalyse zu färben, setzen Sie das Pellet in drei Milliliter FACS-Puffer wieder auf.
Und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikron Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Nach dem Zählen, übertragen Sie 10% der Zellen in eine neue Röhre auf Eis als die ungefärbte negative Kontrolle. Und mischen Sie sechs Mikroliter DCV-Färbung gründlich in die verbleibende Zellsuspension.
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius im Dunkeln mit sanftem Schütteln alle 10 Minuten fünf Mikroliter DNase I in die Zellen geben. Und filtern Sie die Zellen durch ein 35 Mikron Nylon-Netzsieb in eine fünf Milliliter FACS-Röhre auf Eis. Erstellen Sie für die zytometrische Flussanalyse der Zellen ein neues Experiment in der Strömungsanalysesoftware, und klicken Sie im Menü Arbeitsblattwerkzeuge auf neue Dichte, um einen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala zu erstellen.
Klicken Sie auf neues Histogramm, um ein blaues DCV-Histogrammdiagramm auf einer logarithmischen Skala zu erstellen. Klicken Sie auf Start und Datensatz, um mit der Verarbeitung der unbefleckten Probe zu beginnen. Während die Probe ausgeführt wird, klicken Sie auf Detektor- und Schwellenwerteinstellungen, um sowohl die vor- als auch die seitenseitige Streu-PMT-Spannung anzupassen, um die ungefärbten Zellen auf der Skala des Vorwärts- und Zurück-Streudiagramms zu platzieren.
Passen Sie die PMT-Spannung für den Jappy-Kanal an, um die Position der DCV-negativen Population im ersten Jahrzehnt des dCV-blauen Histogramm-Logarithmischen Diagramms zu lokalisieren. Klicken Sie dann auf Stopp, um die unbefleckte Probe zu entladen. Nachdem Sie die gebeizte Probe kurz gewirbelt und geladen haben, klicken Sie auf das nächste Rohr, um ein neues Arbeitsblatt für die Probe zu erstellen.
Legen Sie das Zytometer fest, um mindestens ein mal 10 für die sechs Ereignisse zu erfassen, und klicken Sie auf Start und Record. Klicken Sie als Nächstes auf neue Dichte, um die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Streubreite nach vorne zu erstellen. Und DCV blau im Vergleich zu DCV rote Dichte Diagramme auf einer linearen Skala.
Verwenden Sie im Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte das Polygonwerkzeug, um ein Tor namens Zellen zu zeichnen, um die meisten Zellen einzubeziehen und kleine Trümmer auszuschließen. Wenden Sie dieses Tor auf die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Diagramm der Streuungsbreite nach vorne an, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um das Tor einer einzelnen Zelle zu zeichnen, um nicht einzelne Zellen auszuschließen. Wenden Sie das Tor der einzelnen Zelle auf das DCV-Blau- und DCV-Diagramm mit roter Dichte an, und passen Sie die Skala an, um ein erweitertes Profil zu erfassen.
Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein DCV-Gate zu zeichnen, um die unbefleckten Zellen und die Seitenpopulation auszuschließen, und wenden Sie das Tor auf ein blaues Histogrammdiagramm des DCV auf einem linearen Maßstab an. Die drei Hauptspitzen beziehen sich auf die verschiedenen 1C-, 2C- und 4C-DNA-Inhalte. Erstellen Sie ein zweites DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala.
Und hinter dem Tor das DCV-Tor auf das Grundstück, um die 1C und 4C Populationen zu lokalisieren. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau- im DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Und verwenden Sie das Ellipsenwerkzeug, um ein Tor auf die 1C-Population zu zeichnen.
Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um die 4C-Population mit einer kontinuierlichen Kurve zu bewirten. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein 4C-Tor zu erstellen.
Verwenden Sie in einem neuen vorwärts-nebeneinander gerichteten Streudiagramm das Ellipsenwerkzeug, um Pachyten, Diploten und Leptoten, zygoten Spermatozytentore zu erstellen. Wenn alle Tore gezeichnet wurden, erstellen Sie ein neues DCV-Blau- im DCV-Rot-Farbe-Punkt-Diagramm auf einer linearen Skala, um das für 4C-Tor anzuwenden, um sicherzustellen, dass sich die drei Populationen in einer kontinuierlichen Reihenfolge innerhalb des Gates befinden. Erstellen Sie als Nächstes einen neuen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala, und wählen Sie die einheitliche Größe der Zellen als reine runde Spermienpopulation aus.
Nach der Sortierung liegen die repräsentativen Reinheitsfraktionen der abgetrennten Leptoten, Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozytenfraktionen typischerweise zwischen 80% und 90%, wie sYCP3 und Gamma H2AX Immunostaining bestätigen. Die Reinheit der runden Spermafraktion kann durch Kernfärbung mit DCV in Kombination mit Sp56 und H1t Färbung bestätigt werden, und ist auch in der Regel um 90%Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellpopulationen ist in der Regel über 95%und die durchschnittlichen Gesamterträge jeder Fraktion aus einer einzelnen erwachsenen Maus ist in der Regel ausreichend für verschiedene nachgeschaltete Analyse. Die sortierten Zellen können für verschiedene Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation verwendet werden, um die Genexpression und -regulation während der Spermatogenese besser zu erforschen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine einfache Methode zur Isolierung lebender meiotischer und postmeiotischer Keimzellen aus adulten Maustestes vorgestellt. Mithilfe eines DNA-Bindungsfarbstoffs mit geringer Zytotoxizität und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) können Forscher hochangereicherte Populationen von spermatogenetischen Zellen für verschiedene Anwendungen gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Reproduktionsbiologie
Hintergrund
- Die Isolierung von spermatogenetischen Zellen ist entscheidend für die Untersuchung der Meiose und der Spermatogenese.
- Aktuelle Methoden können eine hohe Zytotoxizität aufweisen, die die Zellviabilität einschränkt.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, die Zellviabilität während der Isolierung zu verbessern.
- Die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie ist ein kritischer Schritt im Verfahren.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines effizienten Protokolls zur Isolierung von Spermatocyten und Spermatiden.
- Unterstützung der Untersuchung molekularer Mechanismen in der Meiose.
- Bereitstellung einer detaillierten Gating-Strategie zur Anpassung des Protokolls an andere Zellsortierer.
Verwendete Methoden
- Gewinnung der Hoden von adulten männlichen Mäusen.
- Verwendung eines DNA-Bindungsfarbstoffs mit geringer Zytotoxizität, der mit violettem Licht angeregt wird.
- Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS).
- Durchführung einer detaillierten Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung lebender meiotischer und postmeiotischer Keimzellen.
- Hohe Anreicherung von spermatogenetischen Zellpopulationen.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode auf verschiedene FACS-Systeme.
- Vorlage eines einfachen Protokolls für Forschende.
Schlussfolgerungen
- Die Methode verbessert die Vitalität isolierter Keimzellen.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Spermatogenese dar.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Erforschung genetischer und epigenetischer Faktoren in der Meiose umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung lebender spermatogener Teilpopulationen ermöglicht die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen in der Fortpflanzungsbiologie und die Entdeckung von Therapeutika, die auf die Keimbahn abzielen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturvalidierung, indem sie hochreine, lebensfähige Zellen für downstream Omics- und Funktionsanalysen bereitstellt. Ihre Kompatibilität mit gängigen FACS-Plattformen mit violettem Laser verbessert die Zugänglichkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Entdeckungsworkflows hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in den Meiose- und Spermatogenese-Wegen unter Verwendung gereinigter Leptotän/Zygotän-, Pachytän- und Diplotän-Spermatocyten-Fraktionen.
- Operativer Wert: Bietet einen zellverträglichen Färbeansatz, der mit weit verbreiteten Violett-Laser-Zellsortierern kompatibel ist und somit die technischen Hürden verringert.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die Isolierung lebender Zellen mit einer Vitalität von über 95 % für funktionelle Nachuntersuchungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative DNA-Gehaltsmessungen (1C, 2C, 4C) mittels DCV-Färbung und ermöglicht standardisierte, ploidiebasierte Gating-Strategien für die Reproduzierbarkeit von Assays.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Herstellung von Einzelzell-Suspensionen aus murinen Hoden, einen entscheidenden Vorverarbeitungsschritt für FACS-basierte Screening-Verfahren.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert hochreine Fraktionen von Spermatiden und Spermatocyten (80–90 % Reinheit), die für konsistente nachgeschaltete Anwendungen wie RNA-seq geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung genetischer und epigenetischer Regulatoren der Meiose und unterstützt so die Abstimmung von Zielstruktur und Hypothese.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem lebensfähige Keimzellen für mechanistische Studien bereitgestellt werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem mechanistische Unklarheiten bei der Validierung von Keimbahnzielen verringert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung zum Zielmolekül bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, insbesondere für therapeutische Wirkstoffe, die die Keimbahn modulieren und bei denen der zelluläre Kontext entscheidend ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung definierter meiotischer Stadien für molekulares Profiling.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Dissoziations- und Färbeprotokolle, die eine konsistente Qualität der Zellsuspension gewährleisten.
- Analytik: Liefert ploidieaufgelöste, quantitative Ergebnisse mittels DCV-Fluoreszenz und ermöglicht den Vergleich zellulärer Zustände unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Forschung, indem ein murines Modellsystem bereitgestellt wird, das translationsrelevante Parallelen zur menschlichen Spermatogenese aufweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren, FACS-kompatiblen Workflow zur Isolierung lebender Keimzellen über mehrere Projekte und Zielklassen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch mechanistische Klarheit im Verlauf der Meiose.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch detaillierte Gating-Strategie und Verwendung niedrig zytotoxischer Farbstoffe.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung biologischer Risiken in fortgeschrittenen Phasen von Programmen zur Erforschung reproduktiver Targets.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung von Keimbahn-Targets basierend auf funktioneller Validierung in gereinigten Zellsubpopulationen.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gating-Strategie der Durchflusszytometrie und in der Fluoreszenzkompensation für die Mehrparameteranalyse von DCV.
- Setzt den Zugang zu FACS-Geräten mit Anregung durch einen Violett-Laser (405 nm) voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Gewebe-Dissociation und der Färbungszeiten über verschiedene Bediener und Labore hinweg.
- Die Übertragung auf andere Modellsysteme kann eine Optimierung des Dissociationspuffers und der Inkubationsbedingungen erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Methode ist derzeit an adulten murinen Hoden validiert; die Anwendbarkeit auf unreifes oder menschliches Gewebe bedarf weiterer Untersuchungen.
