Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay
10. September 2020
Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.
Unser Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Analyse von Wechselwirkungen zwischen Multitransmembranproteinen des endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Komplexes in lebenden Zellen bei niedrigen Expressionsniveaus. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die besondere Empfindlichkeit, die es ermöglicht, hohe Überexpressionsniveaus zu vermeiden, die oft schädlich für die Zellgesundheit sind und die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen stören können. Ernten Sie die adhärente HEK293 T-Zellkultur durch Trypsinisierung und resuspendieren Sie die Zellen in einem speziellen vollständigen Wachstumsmedium.
Plattieren Sie die Zellen auf eine 96-Well-Platte mit klarem Boden und weißer Seite. Passen Sie die Gesamtzahl der Wells an, um alle getesteten Kombinationen und Kontrollen, einschließlich Replikationen, aufzunehmen. Kultivieren Sie die Zellen dann über Nacht unter Standardbedingungen.
Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Kombinationen von Expressionsplasmiden. Verdünnen Sie die Plasmide in einem serumfreien Medium auf 6,25 Nanogramm pro Mikroliter für jedes Konstrukt und fügen Sie das lipidbasierte Transfektionsreagenz hinzu. Fügen Sie ein geeignetes Lipid-zu-DNA-Verhältnis hinzu.
Inkubieren Sie die Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie dann acht Mikroliter des Lipid-DNA-Gemischs in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Mischen Sie den Inhalt der Platte mit sanfter Drehung und kultivieren Sie die Zellen 20 bis 24 Stunden lang unter Standardbedingungen.
Ersetzen Sie am nächsten Tag das konditionierte Medium in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter eines serumfreien Mediums und achten Sie darauf, dass sich die Zellen beim Medienaustausch nicht ablösen. Mischen Sie kurz vor der Messung der Lumineszenz ein Volumen Fruimazin mit 19 Volumen eines Verdünnungspuffers. Geben Sie 25 Mikroliter der Furimazin-Arbeitslösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Platte vorsichtig von Hand oder mit einem Orbitalschüttler.
Legen Sie die Platte in einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader und äquilibrieren Sie die Platte 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus und lesen Sie die Lumineszenz mit einer Integrationszeit von 0,3 Sekunden aus. Überwachen Sie die Lumineszenz bei Bedarf bis zu zwei Stunden lang.
Dieses Protokoll wurde an zwei Nukleotid-Zuckertransportern, SLC35A2 und SLC35A3, getestet, bei denen es sich um Golgi-residente Typ-3-Membranproteine mit N- und C-Termini handelt, die dem Zytoplasma zugewandt sind. Es gab acht mögliche Markierungsoptionen und die resultierenden Fusionsproteine konnten auf acht mögliche Arten zusammengesetzt werden. Hier werden die mittleren relativen Lumineszenzeinheiten oder RLU-Werte angezeigt, die allen getesteten und Kontrollkombinationen entsprechen.
Die RLU-Werte, die für drei der Kombinationen erhalten wurden, waren signifikant höher als die für die entsprechende Kontrollkombination. Um Verhältniswerte für die interessierenden Kombinationen zu erhalten, wurden die RLU-Werte durch die RLU-Werte dividiert, die für die jeweiligen Kontrollen erhalten wurden. Verhältnisse zwischen 10 und 1000 sind ein starker Hinweis auf spezifische Wechselwirkungen.
Es gab zwei solcher Kombinationen, die die Idee unterstützten, dass SLC35A2 und SLC35A3 interagieren. Um diese Daten zu bestätigen, wurden HA-markierte SLC35A2 oder SLC35A3 mit der Kombination koexprimiert, die zu der höchsten relativen Lumineszenz führte. Unterschiedliche Mengen der Plasmide und kodierenden HA-markierten NST-Varianten wurden für die Co-Transfektion verwendet, was zu einer statistisch signifikanten dosisabhängigen Abnahme der RLU-Werte führte.
Das Wichtigste ist, dass Sie Ihr Eigeninteresse auf alle möglichen Arten ansprechen und alle möglichen Kombinationen testen, da eine gewisse Markierungsorientierung zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Sobald die leistungsstärkste Kombination ausgewählt wurde, kann die Dynamik der entsprechenden Interaktion überwacht werden, um beispielsweise Wirkstoffe oder Bedingungen zu identifizieren, die Ihren interessierenden Komplex im Laufe der Zeit stören.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert das Auftreten heterologer Wechselwirkungen zwischen Golgi-assoziierten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten Termini in lebenden Säugetierzellen mithilfe eines empfindlichen split-Luciferase-Komplementierungsassays. Es ermöglicht die Identifizierung von Wechselwirkungen bei niedrigen Expressionsniveaus und minimiert Störungen der zellulären Gesundheit.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Proteinwechselwirkungen
- Membranbiologie
Hintergrund
- Konzentration auf Wechselwirkungen zwischen multiplen Transmembranproteinen.
- Ziel ist es, Proteinwechselwirkungen ohne schädliche Effekte durch Überexpression zu bewerten.
- Nutzung des Golgi-Komplexes und des endoplasmatischen Retikulums als biologische Systeme.
Verwendete Methoden
- Split-Luciferase-Komplementierungsassay
- Kultur menschlicher HEK293-T-Zellen
- Transfektion von Expressionsplasmiden
Hauptergebnisse
- Nachweis signifikanter Interaktionen zwischen SLC35A2 und SLC35A3.
- RLU-Werte deuteten auf spezifische Interaktionen hin, wobei Verhältnisse zwischen 10 und 1000 auf starke Interaktionen schließen ließen.
- Bestätigung der Interaktionen durch HA-markierte Ko-Expression und dosisabhängige Assays.
Schlussfolgerungen
- Die Studie erläutert erfolgreich die Wechselwirkungen von Membranproteinen in lebenden Zellen.
- Sie bietet eine wertvolle Methode zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen in der Zellbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Nachweis heterologer Komplexe zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen adressiert eine zentrale Herausforderung bei der Zielvalidierung für Wechselwirkungen von Membranproteinen. Der Split-Luciferase-Komplementierungsassay ermöglicht einen empfindlichen Nachweis bei niedrigen Expressionsniveaus, verringert Artefakte durch Überexpression und stärkt die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsphase. Diese Fähigkeit verbessert die mechanistische Entlastung von Risiken und unterstützt die Priorisierung von Zielstrukturen in der Portfolioauswahl für Membranproteine.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen bei physiologisch relevante Expressionsspiegeln.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Membranproteinkomplexen, die an Glykosylierungswegen beteiligt sind.
- Verringert mechanistische Unschärfen, indem spezifische heteromere Wechselwirkungen von Hintergrundrauschen unterschieden werden.
- Erleichtert die Vorhersagegenauigkeit bei der Auswahl von Membranproteintargets für die weitere Entwicklung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert einen quantitativen, reproduzierbaren Messwert (RLU) für die Wechselwirkungsstärke zwischen Proteinpaaren.
- Ermöglicht die systematische Bewertung von Markierungsorientierungen, um falsch-negative Ergebnisse bei der Assay-Entwicklung zu minimieren.
- Unterstützt die Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays zur Untersuchung von Modulatoren der Proteinwechselwirkungen.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Assay-Leistung unter Verwendung von Kontroll- und Experimentalkombinationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Modellierung von Interaktionen in Säugetierzellen und ist somit an krankheitsrelevanten Systemen ausgerichtet.
- Ermöglicht die Beobachtung komplexer Dynamiken unter verschiedenen Bedingungen und unterstützt so die translationale Erforschung von Biomarkern.
- Bietet Kontinuität von der interaktionskartierenden Entdeckungsphase bis zur präklinischen Validierung der Funktion von Membranproteinen.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung von auf Membranproteine abzielenden Programmen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser geteilte Luciferase-Komplementierungs-Assay integriert sich in die Entwicklungs- bis präklinische Kontinuum, indem er eine robuste Target-Validierung und Assay-Entwicklung für Membranproteinkomplexe ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Bildung von Protein-Komplexen und die Kartierung von Signalwegen in lebenden Zellen.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Lumineszenzsignale zur Beurteilung der Interaktionsstärken unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Ermöglicht statistische Analysen der RLU-Verhältnisse, um spezifische Wechselwirkungen von Kontrollen zu unterscheiden.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Überwachung dynamischer Wechselwirkungen als Reaktion auf Störungen und unterstützt damit Biomarker-Strategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung unterschiedlicher Wechselwirkungen membranständiger Proteine über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung von Membranproteintargets.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit, Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays für die Übernahme durch verschiedene Teams.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse minimiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Membranproteintargets für die Weiterentwicklung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Membranproteinforschung und im Design von Assays an lebenden Zellen.
- Benötigt Zugang zu Lumineszenz-Plattenreadern und Zellkulturgefäßsystemen.
- Erfordert eine sorgfältige Kontrollgestaltung und systematische Bewertung der Tag-Orientierungen.
- Kann eine Anpassung an verschiedene Zelllinien oder Klassen von Membranproteinen erfordern.
- Falsch-negative Ergebnisse können auftreten, wenn das Tagging die Proteinfunktion oder -lokalisation stört.
