Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese
6. August 2020
Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.
Dieser Aderhaut-Assay ist hochgradig reproduzierbar und relevant für die Forschung zur Aderhautangiogenese und zur altersbedingten Makuladegeneration, AMD. Er kann In-vivo-Studien des mikrovaskulären Verhaltens ergänzen. Dieser Assay kann verwendet werden, um Verbindungen als potenzielle Behandlungen für neovaskuläre AMD zu untersuchen oder um Signalwege zu bewerten, die an der choroidalen Neovaskularisation beteiligt sind, unter Verwendung von Wildtyp- und genetisch verändertem Mausgewebe. Zu Beginn fügen Sie fünf Milliliter Penicillin, Streptomycin und 10 und fünf Milliliter handelsübliche Nahrungsergänzungsmittel zu 500 Millilitern des kompletten klassischen Mediums mit Serum hinzu und aliquotieren dann 50 Milliliter des Mediums, tauen den Basalmembranextrakt oder BME über Nacht im Kühlschrank bei zwei bis acht Grad Celsius auf.
Legen Sie ein Aliquot des kompletten klassischen Mediums auf Eis. Reinigen Sie das Präpariermikroskop, die Pinzette und die Schere mit 70% Ethanol. Bereiten Sie die Zellkulturschalen vor und legen Sie eine auf das Präpariermikroskop und die andere auf Eis.
Geben Sie dann 10 Milliliter komplettes klassisches Medium in jedes Gericht. Halten Sie die Augen vor dem Sezieren komplett in klassischem Medium auf Eis. Entfernen Sie das Bindegewebe und den Sehnerv und schneiden Sie dann mit einer Mikroschere 0,5 Millimeter hinter dem Hornhaut-Limbus um.
Entfernen Sie den Hornhaut-Iris-Komplex, den Glaskörper und die Linse. Machen Sie einen einen Millimeter senkrechten zur Schnittkante in Richtung des Sehnervs und schneiden Sie ein umlaufendes, ein Millimeter breites Band, dann trennen Sie die zentralen und peripheren Bereiche des Komplexes. Lösen Sie die Netzhaut mit einer Pinzette aus dem RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex.
Halten Sie das periphere Aderhautband in komplett klassischem Medium auf Eis. Isolieren Sie das andere Auge und wiederholen Sie den Vorgang, um ein zweites Band zu schneiden. Schneiden Sie die kreisförmige Blende in fünf bis sechs etwa gleich große Stücke.
Geben Sie 30 Mikroliter des aufgetauten BME in die Mitte jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, dass das Tröpfchen BME am Boden der Platte eine konvexe Kuppel bildet, ohne die Ränder zu berühren. Lege das Taschentuch in die Mitte des BME.
Drücke die Aderhaut-X-Pflanze nicht platt. Lassen Sie das Gewebe innerhalb des BME expandieren. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich das Gel verfestigen kann, und geben Sie dann 500 Mikroliter des kompletten klassischen Mediums in jede Vertiefung
.Wechseln Sie das klassische Medium jeden zweiten Tag. Das Keimen der Aderhaut kann nach drei Tagen mit dem Mikroskop beobachtet werden. Öffnen Sie das Aderhautbild mit Bild J und überprüfen Sie Bild, Typ und Achtbit mit Graustufen.
Optimieren Sie dann den Kontrast, indem Sie das Bild auswählen, anpassen, den Helligkeitskontrast anpassen und anpassen. Verwenden Sie die Zauberstab-Funktion, um das Aderhautgewebe, das in der Mitte der Sprossen vorhanden ist, zu umreißen und zu entfernen. Entfernen Sie den Hintergrund des Bildes mit den freien Auswahlwerkzeugen.
Gehen Sie als Nächstes zum Bild, passen Sie den Schwellenwert an und verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um die mikrovaskulären Sprossen vor dem Hintergrund in der Peripherie zu definieren. Klicken Sie auf F2 und eine Zusammenfassung wird angezeigt. Klicken Sie auf Speichern, um ein Bild des ausgewählten Bereichs im selben Ordner wie das Originalbild zum späteren Nachschlagen zu speichern.
Nachdem eine Gruppe von Proben gemessen wurde, kopieren Sie die aufgezeichneten Daten zur Analyse. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Aderhautsprossung bei C 57, schwarzen sechs J-Mäusen vom dritten bis zum sechsten Tag zu untersuchen und zu quantifizieren. In einem repräsentativen Fall betrug die Aderhautkeimfläche 0,38, 1,47, 5,62 und 10,09 Millimeter zum Quadrat an den Tagen drei, vier, fünf und sechs.
Die Auswirkungen des Verlusts von FFAR4 auf die choroidale Gefäßsprossung wurden mit dem Aderhaut-Keimungsassay bei FFAR4-, Vier-Knockout- und FFAR4-Wildtyp-Mäusen untersucht. Die Keimfläche in FFAR4-Knockout-Mäusen erhöhte das choroidale Gefäßwachstum im Vergleich zum FFAR4-Wildtyp am sechsten Tag. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit einem mikromolaren FFAR4-Agonisten die Aderhautkeimfläche im Vergleich zu unbehandelten Mäusen am sechsten Tag.
Dieser Assay ermöglicht eine reproduzierbare Bewertung des anti-angiogenen Potenzials pharmakologischer Verbindungen und der Variation der Rolle eines spezifischen Signalwegs bei der choroidalen Neovaskularisation unter Verwendung von genetisch verändertem Mausgewebe
.Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll stellt einen Choroide-Sprossungs-Assay als ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Mikrogefäßerneuerung vor, insbesondere im Zusammenhang mit der choroideaalen Angiogenese und der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Der Assay ermöglicht die Untersuchung der an der Proliferation choroideaaler Mikrogefäße beteiligten Signalwege sowie die Bewertung von Arzneimitteltherapien unter Verwendung von Geweben sowohl von Wildtyp- als auch von genetisch modifizierten Mäusen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Chorioideale Angiogenese
- Altersbedingte Makuladegeneration (AMD)
- Mikrovaskuläres Verhalten
Hintergrund
- Bedeutung der choroidalen Angiogenese bei Augenerkrankungen
- Ex-vivo-Modelle als Ergänzung zu In-vivo-Studien
- Genetisch modifizierte Mausmodelle für vertiefte Einblicke
Verwendete Methoden
- Auswuchs-Assay der Aderhaut
- Verwendung von Mausgeweben aus Wildtyp- und genetisch modifizierten Stämmen
- Mikroskopie zur Beobachtung des Aderhautauswuchses
Hauptergebnisse
- Der Assay ermöglicht reproduzierbare Messungen des choroidalen Aussprossens über mehrere Tage hinweg
- Der Verlust von FFAR4 bei Knockout-Mäusen führte im Vergleich zum Wildtyp zu einem stärkeren Wachstum der Aderhautgefäße
- Die Behandlung mit einem FFAR4-Agonisten verringerte die choroidale Aussprossungsfläche bei Knockout-Mäusen
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Wirksamkeit des Assays bei der Bewertung des antiangiogenetischen Potenzials pharmakologischer Substanzen
- Sie unterstreicht die Rolle spezifischer Signalwege bei der choroidalen Neovaskularisierung
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der ex-vivo-Chorioidspross-Assay bietet ein reproduzierbares Modell zur Beurteilung der mikrovaskulären Proliferation in der Aderhaut, das direkt für die Wirkstoffforschung bei der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) relevant ist. Er ermöglicht die mechanistische Absicherung angiogener Signalwege unter Verwendung von Geweben von Wildtyp- und genetisch modifizierten Mäusen und unterstützt so die Zielstrukturvalidierung und die Identifizierung führender Wirkstoffkandidaten in ophthalmologischen Entwicklungsprogrammen. Der Assay verbindet die Entdeckungsbiologie mit der präklinischen Bewertung, indem er die Sprossungsdynamik in einem physiologisch relevanten Gewebe-Explantat-System quantifiziert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die choroidale Aussprossung als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Modulation angiogener Signalwege gemessen wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen wie FFAR4 in einem multizellulären Gewebekontext, der Endothel, Makrophagen, Perizyten und retinale Pigmentepithelzellen umfasst.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem dosisabhängige Wirkungen von Substanzen auf die Mikrogefäßerneuerung über die Zeit quantifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, bildbasierte Messgrößen der Aussprossungsfläche, die die Bildung mikrovaskulärer Netzwerke unter kontrollierten Bedingungen widerspiegeln.
- Operativer Wert: Verwendet standardisierte Explantat-Ausplattung in wachstumsfaktorreduziertem BME mit definierten Mediumwechsel-Zeitplänen, um die Reproduzierbarkeit über Experimente hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit dem 24-Loch-Plattenformat und einer halbautomatisierten ImageJ-Analyse für mittlere bis hohe Durchsatzraten bei der Wirkstoffscreening.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die native Architektur aus Choroidea, retinalem Pigmentepithel und Sklera und bewahrt so zelluläre Wechselwirkungen, die für die Modellierung pathophysiologischer Angiogenese entscheidend sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht den direkten Vergleich von Wildtyp- und Knockout-Geweben (z. B. FFAR4), um genetische Beiträge zu Auswuchsphänotypen zu isolieren.
- Prädiktiver Wert: Ermöglicht die Beurteilung der Wirkung von Agonisten und Antagonisten auf das Auswachsen und liefert präklinische Hinweise zur Modulation von Signalwegen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test passt in die ophthalmologische Entdeckungskontinuum von der Zielvalidierung über die Lead-Optimierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung, insbesondere für anti-angiogenetische Strategien bei der nAMD.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von angiogenen Regulatoren durch Quantifizierung von Veränderungen der Auswucherungen als Reaktion auf die Hemmung oder Aktivierung von Signalwegen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messgrößen für die Auswucherung, die eine Rangfolge der Wirkstoffeffekte in einem gewebebasierten Format ermöglichen.
- Analytik: Bietet zeitlich aufgelöste, flächenbasierte Messungen (z. B. Tag 3 bis Tag 6), die die kinetische Analyse mikrovaskulärer Reaktionen unterstützen.
- Translationale Forschung: Verwendet krankheitsrelevante Explantate, um die choroidale Neovaskularisierung zu modellieren, und erleichtert so die Übertragung auf in-vivo-AMD-Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, wiederverwendbare Plattform zur Bewertung mehrerer Wirkstoffe oder genetischer Modelle über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit quantifizierbaren Aussprossungsergebnissen in einem nativen Gewebekontext verknüpft werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle zur Gewebeisolation, BME-Plattierung, Mediumwechsel und Bildaufnahme.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch von Projekten, indem frühzeitige, gewebebasierte Hinweise auf antiangiogene Aktivität vor In-vivo-Tests bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf Dosis-Wirkungs- und genetischen Validierungsdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der dissezierenden Gewebeentnahme bei Mäusen und der Isolierung von Explantaten unter sterilen Bedingungen.
- Setzt den Zugang zu einem wachstumsfaktorreduzierten Basalmembran-Extrakt (BME) und zur Phasenkontrastmikroskopie voraus.
- Erfordert standardisierte Arbeitsabläufe für die Bildanalyse (z. B. ImageJ-Makro) zur konsistenten Quantifizierung der Auswucherungen.
- Muss bei der Interpretation der Metriken zur Auswucherung die Variabilität der Explantatgröße und der Gewebeviabilität berücksichtigen.
- Auf murines Gewebe beschränkt; artenspezifische Unterschiede können die Übertragbarkeit auf die menschliche Chorioidealbiologie beeinträchtigen.
