Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

SM FISH quantifiziert genau die Konzentrationen und die Lokalisation der spezifischen RNase. Diese Methode ist besonders nützlich für die Analyse von Zell-zu-Zell- und Allel-by-Allel-by-Allel-Variation in RNA. Die Gentranskription ist ein wesentlicher Prozess in der Zellbiologie, SM FISH ermöglicht die Untersuchung des RNA-Gehalts als Reaktion auf äußere Reize auf Einzelzellebene und liefert räumliche Informationen.

Waschen Sie die Zellen nach der Behandlung mit Östrogenrezeptoragonisten mit kaltem, sterilem PBS mit Kalzium und Magnesium und fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern Fixierungspuffer für 30 Minuten auf Eis. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal drei Minuten lang mit kaltem, sterilem PBS mit Kalzium und Magnesium, bevor Sie 500 Mikroliter 70%iges Ethanol in jede Vertiefung geben. Verschließen Sie dann die 24-Well-Platte mit einer Paraffin-Plastikfolie und legen Sie die Platte für mindestens vier und bis zu 16 Stunden bei vier Grad Celsius auf einen Rotator.

Für die RNA-FISH-Hybridisierung waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation einmal mit 500 Mikrolitern 2X SSC-Puffer, ergänzt mit 10%Formamid für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Legen Sie während der Inkubation ein Stück Parffin-Plastikfolie mit der unbelichteten Seite nach oben in eine mit einer RNA-Oberfläche gereinigte Petrischale, dekontaminieren Sie es und legen Sie es auf sterile wassergetränkte Papiertücher entlang der Ränder der Schale. Geben Sie am Ende der Inkubation gleichmäßig verteilte 30 Mikroliter frisch vorbereitete Tröpfchen auf GREB1 Intron und GREB1 Exon-Sondenpuffer auf die saubere Seite der Paraffin-Kunststofffolie und platzieren Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig und blasenfrei ein Deckglas mit der Zellseite nach unten auf jedes Tröpfchen.

Nachdem Sie die Schale mit Paraffinfolie verschlossen haben, decken Sie die Platte mit Folie ab und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einer flachen, nicht rotierenden Fläche. Am nächsten Morgen verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser für zwei 15-minütige Wäschen in 500 Mikrolitern frischem 2X SSC-Puffer, ergänzt mit 10 % Formamid pro Waschgang bei 37 Grad Celsius auf einem beheizten Rotator, mit einer Pinzette nach oben auf die 24-Well-Plattenzelle zurückzubringen. Nach dem zweiten Waschen wird die DNA 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI in 2X SSC-Puffer gegengefärbt, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche in 2X SSC-Puffer bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie ein Papiertuch, um den überschüssigen 2X SSC-Puffer zu entfernen, und spülen Sie die Proben in nukleasefreiem Wasser ab, um überschüssige Salze zu entfernen. Anschließend die Deckgläser mit nicht aushärtendem Eindeckmedium auf Glasobjektträger aufkleben und mit Klarlack versiegeln. Für die Probenbildgebung laden Sie den Objektträger mit der höchsten erwarteten Intensität auf einen Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskoptisch, der mit einem 60- oder 100-fachen Ölobjektiv in einer sCOMS-Kamera ausgestattet ist, und platzieren Sie ein Tröpfchen Immersionsöl auf dem Objektiv.

Fokussieren Sie sich für die Zstack-Erfassung auf die Probe im DAPI-Kanal und wählen Sie den oberen und unteren Rand des Zstacks in den Abständen aus, in denen die DAPI-gefärbten Kerne unscharf werden. Verwenden Sie den Dia, um die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle und die Belichtungszeiten für jeden Kanal zu optimieren und Bilder von allen Dias unter Bedingungen aufzunehmen, die Fotobleichen und/oder Kamerapixelsättigung vermeiden. Verwenden Sie nach der Aufnahme 10 Zyklen eines aggressiven restaurativen Algorithmus, um die Bilder zu entfalten und alle Projektionsbilder entsprechend der Bittiefe der verwendeten Kamera zu speichern.

Laden Sie für die Bildanalyse zunächst das Jupiter Notebook von GitHub herunter und installieren Sie Python Anaconda Distribution Version 3.6 oder höher. Öffnen Sie die Anaconda-Eingabeaufforderung und geben Sie den Installationsbefehl ein, um SimpleITK für Anaconda zu installieren. Öffnen Sie den Anaconda Navigator und starten Sie Jupiter Notebook.

Es öffnet sich ein Webbrowser, in dem Verzeichnisse und Dateien angezeigt werden. Durchsuchen Sie die Verzeichnisstrukturen, um das Verzeichnis zu erreichen, das das heruntergeladene Jupiter Notebook von GitHub enthält. Öffnen Sie dann das Notebook, und drücken Sie Umschalt und Eingabetaste, um jede Zelle auszuführen.

In diesem repräsentativen Experiment wurden adhärente Brustkrebszellen 24 Stunden lang mit einem Östrogenrezeptor-Agonisten oder Vehikel behandelt. Spektral getrennte Sondensätze gegen intronische und exonische GREB1-Sequenzen ermöglichten die gleichzeitige Visualisierung und Quantifizierung von naszierender und reifer mRNA. Wichtig ist, dass die Anzahl der transkriptionell aktiven Allele in jeder Zelle, die nachweislich Teil des Östrogen-Reaktionszeitverlaufs sind, markiert werden kann.

Unter Berücksichtigung der überlappenden Intron- und Exon-Spots wurde festgestellt, dass die E2-behandelten Zellen im Vergleich zu Vehikel-behandelten Zellen einen vierfach erhöhten Anteil an Zellen aufweisen, die zwei oder mehr aktive GREB1-Allele aufweisen. Da Introns aus naszierender mRNA gespleißt werden, um reife mRNA zu erzeugen, die nur aus Exon-Sequenzen besteht, kann die Anzahl der reifen mRNA pro Zelle gezählt werden, indem die Anzahl der grünen Flecken quantifiziert wird. Die Darstellung dieser Daten ermöglicht es dann, die Verschiebung der Verteilung der reifen GREB1-mRNA-Zellen und die Veränderung der Gesamtfaltung in der Zellpopulation nach der E2-Behandlung zu beobachten.

C-FISH ermöglicht die nacheinander untersuchte mehrere RNA-Spezies, MERFISH ist eine Barcoding-Technik zur massiven Steigerung des Multiplexings und iFISH wird zur gleichzeitigen Untersuchung von RNA und Proteinen verwendet.