Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[n]uril

Dieses Protokoll bietet eine vielseitige Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Harnsäure mit hoher Empfindlichkeit. Daher handelt es sich um ein Protokoll für diagnostische und klinische Anwendungen. Dieses Protokoll kann Biomarker in einer komplexen Matrix, wie z. B. Körperflüssigkeiten, schnell quantifizieren.

Diese Technik kann möglicherweise erweitert werden, um Krankheiten zu diagnostizieren, bei denen Harnsäure als Biomarker verwendet wird, wie z. B. Gicht, Bluthochdruck und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Es kann auch zur Detektion und Quantifizierung anderer gefährlicher Stoffe für die Umweltüberwachung verwendet werden. Beim ersten Versuch des Protokolls könnten Forscher Schwierigkeiten haben, stabile Aggregate aus CB7- und Gold-Nanopartikeln zu bilden.

Es wird empfohlen, die Goldnanopartikel in CB7-Lösungen mittels Ultraschall zu mischen, da andere Techniken die Aggregationskinetik beeinflussen könnten. Ein Video, das kritische Schritte der Zugabe von CB7-Mischen zeigt, kann die Erfolgschancen und die Reproduzierbarkeit für Forscher erhöhen, wenn sie neu mit dem System sind. Für die Synthese von Goldsamen lösen Sie 98,5 Milligramm Auric in 10 Millilitern deionisiertem Wasser in einem Glasfläschchen, um eine 25 Millimolare Aurinchloridlösung und 64,5 Milligramm Natriumcitratpulver in 500 Mikrolitern deionisiertem Wasser in einem Glasfläschchen zu erhalten.

Als nächstes verdünne man einen Milliliter der Aurachloridlösung mit 99 Millilitern Wasser in einer 250 Milliliter Flasche mit blauem Deckel, um eine 0,25 Millimolare Aurachloridlösung zu erhalten, und füge 99,5 Milliliter der 0,25 Millimolaren Aurachloridlösung in einen 250 Milliliter Dreihalskolben mit rundem Boden hinzu, der mit einem Kondensator ausgerüstet ist. Dann erhitzen Sie die Lösung 15 Minuten lang unter kräftigem Rühren auf 90 Grad Celsius, bevor Sie 500 Mikroliter der Natriumcitratlösung in den Kolben injizieren und so lange rühren, bis die Lösung rubinrot wird. Um das Wachstum der Goldnanopartikel zu initiieren, geben Sie 25 Milliliter der Goldsamenlösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und kühlen Sie die Lösung in einem ThermoMixer auf 70 Grad ab.

Während die Lösung abkühlt, füllen Sie eine drei Milliliter Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 Millilitern 25 Millimolar Aurachloridlösung und füllen Sie eine weitere drei Millimeter Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 Millilitern 60 Millimolar Natriumcitratlösung. Setzen Sie die Spritzen in Spritzenpumpen ein und verwenden Sie Luer-zu-MicroTight-Adapter, um PEEK-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 150 Mikromolaren an die Spritzen anzuschließen. Führen Sie den Schlauch in das Zentrifugenröhrchen mit der abgekühlten Goldsamenlösung in den ThermoMixer ein und stellen Sie beide Spritzenpumpen so ein, dass sie über einen Zeitraum von 20 Minuten 167,5 Mikroliter Lösung abgeben.

Stellen Sie die Drehzahl des ThermoMixers auf 600 Umdrehungen pro Minute ein und drücken Sie Start an der Spritzenpumpe mit der 25 millimolaren Aurachloridlösung. Drücken Sie nach zwei Minuten an der Spritzenpumpe mit der 60 millimolaren Natriumcitratlösung auf Start. Entfernen Sie nach 30 Minuten ein Aliquot der Goldnanopartikellösung zur Analyse.

Um eine 0,4 Millimolare CB7-Lösung herzustellen, geben Sie 4,65 Milligramm CB7 in ein 15-Milliliter-Glasfläschchen und 10 Milliliter Wasser in das Fläschchen. Nachdem Sie das Fläschchen fest verschlossen haben, beschallen Sie es bei Raumtemperatur, bis sich der CB7-Feststoff vollständig aufgelöst hat. Um eine 0,4 Millimolare Harnsäurelösung herzustellen, geben Sie 2,69 Milligramm Harnsäure in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 40 Milliliter Wasser in das Röhrchen.

Nach dem festen Verschließen die Mischung in einem ThermoMixer auf 70 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute zwei Stunden lang schwenken. Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, verdünnen Sie einen Milliliter der 0,4 Millimolaren Harnsäurelösung mit neun Millilitern Wasser in einem 15 Milliliter Glasfläschchen, um eine 0,04 Millimolare Harnsäurelösung zu erhalten. Nachdem Sie das Fläschchen fest verschlossen haben, beschallen Sie es 30 Sekunden lang.

Zur Herstellung der CB7-Harnsäurekomplexe geben Sie 750 Mikroliter der 0,4 Millimolaren CB7-Lösung und 750 Mikroliter der 0,4 Millimolaren Harnsäurelösung in ein 1,5 Milliliter-Röhrchen und beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang. Halten Sie dann die Röhre 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Bildung der Gastgeber-Gast-Komplexe sicherzustellen. Klicken Sie in der Raman-Systemsoftware auf das Symbol für den Spektroskopie-Anwendungsassistenten und wählen Sie Raman aus.

Starten Sie eine Neuerfassung und setzen Sie die Integrationszeit auf 30 Sekunden, die Scans auf durchschnittlich fünf und den Güterwagen auf null. Speichern Sie dann das Hintergrundspektrum und geben Sie die Laserwellenlänge ein. Für die SERS-Substratbildung geben Sie 900 Mikroliter der 40-Nanometer-Gold-Nanopartikellösung und 100 Mikroliter der vorgeformten CB7-Harnsäure-Komplexlösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und beschallen, bis die Lösung von rubinrot nach violett wechselt.

Übertragen Sie die Probenlösung in eine Semi-Mikroküvette und setzen Sie die Küvette in den Raman-Probenhalter ein. Schließen Sie die Abdeckung und starten Sie die Messung. Stellen Sie dann die automatische Speicherung so ein, dass fünf aufeinanderfolgende SERS-Spektren aufgezeichnet werden.

Die ultravioletten sichtbaren Spektren für die synthetisierten Goldnanopartikel zeigen eine Verschiebung der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanzpeaks von 521 auf 529 Nanometer nach 10 Wachstumsschritten, während die dynamischen Lichtstreudaten eine enge Größenverteilung zeigen, wenn die Größe der Nanopartikel von 25,9 auf 42,8 Nanometer zunimmt. Die durchschnittlichen Größen von G0, G5 und G10, die aus Transmissionselektronenbildern gemessen werden, betragen etwa 20, 33 bzw. 40 Nanometer. In diesen repräsentativen Analysen wurden Wirt-Gast-Komplexe aus CB7 und Harnsäure mit leerem CB7 gebildet, was die Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen innerhalb der Goldnanopartikel CB7-Nanoaggregate vermittelt, was durch die charakteristischen Harnsäuresignale im SERS-Spektrum unterstützt wird.

Umgekehrt können in Abwesenheit von CB7 keine SERS-Signale von Harnsäure beobachtet werden, was die Schlüsselrolle von CB7 bei der Auslösung der Goldnanopartikelaggregation verdeutlicht. Die hohe Empfindlichkeit des in diesem Protokoll vorgestellten Nachweisschemas wird durch die Beobachtung klarer SERS-Signale von den Harnsäurepeaks bei 640 und 1130 reziproken Zentimetern bis hinunter zur 0,2 mikromolaren Nachweisgrenze demonstriert. Darüber hinaus wurden sehr starke Korrelationen zwischen der SERS-Intensität und den logarithmischen Konzentrationen der Harnsäure für beide Peaks mit linearen Bereichen im Bereich von 0,2 bis 2 Mikromolaren nach dem Potenzgesetz erhalten.

Harnsäure hat eine geringe Wasserlöslichkeit, daher muss sichergestellt werden, dass das Harnsäurepulver vor dem nächsten Schritt weich wird. Es kann eine fortschrittliche Datenanalyse durchgeführt werden, die es ermöglicht, mehrere in der Matrix vorhandene Biomarker zu quantifizieren.