Name: Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit n uril (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Lernen Sie die quantitative SERS-Detektion von Harnsäure mit Cucurbit[7]uril und Goldnanopartikeln für diagnostische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Quantifizierung von Biomarkern in komplexen biologischen Matrices.

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TCL ist dankbar für die Unterstützung durch den Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) und den UCL BEAMS Future Leader Award, der durch den Institutional Sponsorship Award des EPSRC (EP/P511262/1) finanziert wird. WIKC, TCL und IPP danken der Studentenschaft, die durch das A*STAR-UCL Research Attachment Programme durch das EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) finanziert wird. GD und TJ danken dem EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) für das Sponsoring ihres Stipendiums. TJ und TCL würdigen Camtech Innovations für ihren Beitrag zum Studium von TJ. Alle Autorinnen und Autoren danken dem UCL Open Access Fund.

1. Synthese von Au-NPs
<ol><li>Synthese von Au-Samen nach der konventionellen Turkevich-Methode26<ol>
<li>Bereiten Sie 10 ml 25 mM HAuCl4-Lösung vor, indem Sie 98,5 mg HAuCl4 auflösen. 3H2O Vorläufer mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Glasdurchstechflasche. HINWEIS: Übertragen Sie eine kleine Menge HAuCl 4-Vorläufer in ein Wiegeboot und verwenden Sie einen Kunststoffspatel anstelle eines metallischen Spatels, um die Kristalle auszuwiegen, da der HAuCl4-Vorläufer Metalllaborgeräte korrodiert. Der Wiegeschritt sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, daHAuCl 4 hygroskopisch ist und daher sein Gewicht im Laufe der Zeit erhöht, indem es Wasser aus der Atmosphäre aufnimmt. HAuCl4 ist stark korrosiv und kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Seien Sie besonders vorsichtig bei der Handhabung.</li>
		<li>Bereiten Sie 0,5 ml 500 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 64,5 mg Natriumcitratpulver mit 0,5 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.</li>
		<li>Verdünnen Sie 1 ml der 25 mM HAuCl4-Lösung mit 99 mL Wasser in einer 250 mL Flasche mit blauem Deckel, um 100 ml 0,25 mMHAuCl 4-Lösung zu erhalten.</li>
		<li>99,5 ml der 0,25 mM HAuCl4-Lösung in einen 250 ml Dreihalskolben mit rundem Boden geben, der mit einem Kondensator ausgestattet ist. Die Lösung unter starkem Rühren auf 90 °C erhitzen und die Temperatur 15 min halten.</li>
		<li>Injizieren Sie 0,5 ml der 500 mM Natriumcitratlösung in das Reaktionsgemisch und halten Sie die Temperatur und das Rühren aufrecht, bis die Farbe der Lösung rubinrot wird. HINWEIS: Die Reaktion dauert ca. 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Seeded Growth von Au NPs über die kinetisch kontrollierte Methode13
	<ol>
<li>Die as-synthetisierte Au-Samenlösung wird auf 70 °C abgekühlt.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 ml 60 mM Natriumcitratlösung vor, indem Sie 154,8 mg Natriumcitratpulver mit 10 ml entionisiertem Wasser in einer Durchstechflasche aus Glas auflösen.</li>
		<li>Es werden 0,67 ml der 25 mM HAuCl4-Lösung und 0,67 ml der 60 mM Natriumcitratlösung mit einem Zeitintervall von 2 min in die Au-Samen injiziert.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2.3, um die Größe von Au NPs schrittweise auf 40 nm zu erhöhen. HINWEIS: Es dauert etwa 10 Wachstumsschritte, um 40 nm zu erreichen. Die tatsächliche Anzahl der erforderlichen Schritte kann von der genauen Einrichtung abhängen.</li>
	</ol></li>
	<li>Seeded Growth von Au NPs mit automatisiertem Synthesizer (Abbildung 2)
	<ol>
<li>25 ml der in Abschnitt 1 hergestellten Au-Saatgutlösung in ein konisches 50 mL Zentrifugenröhrchen geben und in einem Thermomischer auf 70 °C abkühlen. HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur im Thermomischer mit einem Thermoelement-Thermometer, das in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 25 ml Wasser platziert ist.</li>
		<li>Füllen Sie eine 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 25 mM HAuCl4-Lösung . Füllen Sie eine weitere 3 mL Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 ml 60 mM Natriumcitratlösung.</li>
		<li>Legen Sie die Spritzen in die Spritzenpumpen und verwenden Sie Luer-to-MicroTight-Adapter, um den PEEK-Schlauch (150 μm Innendurchmesser) mit den Spritzen zu verbinden. Führen Sie den Schlauch in das Zentrifugenröhrchen mit der Au-Saatgutlösung im Thermomischer ein.</li>
		<li>Stellen Sie beide Spritzenpumpen so ein, dass sie 0,1675 ml Lösung über 20 min (8,357 μL pro min) dosieren.</li>
		<li>Stellen Sie die Drehzahl des Thermomixers auf 700 U/min ein und drücken Sie Start an der Spritzenpumpe, die die 25 mM HAuCl4-Lösung enthält.</li>
		<li>Drücken Sie nach 2 Minuten auf Start an der Spritzenpumpe, die die 60 mM Natriumcitratlösung enthält.</li>
		<li>Entfernen Sie 30 Minuten nach Beginn der Injektion der HAuCl 4-Lösung ein Aliquot der AuNP-Lösung zur Analyse.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3.5 – 1.3.7, um den Durchmesser der Au NPs schrittweise auf bis zu 40 nm zu erhöhen. HINWEIS: Dieses Setup kann verwendet werden, um Au-NPs in einem Schritt auf bis zu 40 nm zu erhöhen, indem das Volumen der in Schritt 1.3.4 hinzugefügten Reaktanten erhöht wird. Dies wird erreicht, indem die Dosierzeit bei gleichbleibender Injektionsrate erhöht wird.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Charakterisierung von Au-NPs
<ol><li>UV-Vis-Spektroskopie<ol>
<li>Fügen Sie 1 ml der Au NP-Lösung zu einer Semi-Mikro-Quarzküvette hinzu.</li>
		<li>Schalten Sie das Spektrometer ein.</li>
		<li>Stellen Sie den Wellenlängenbereich auf 400 - 800 nm ein.</li>
		<li>Erfassen Sie das UV-Vis-Spektrum für jede Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dynamische Lichtstreuung (DLS)<ol>
<li>Filtern Sie die Probenlösung in eine Kunststoff-Semi-Mikro-Küvette mit einem 0,22-μm-Filter.</li>
		<li>Schalten Sie das DLS-Instrument ein.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein und gleichen Sie sie für 60 s.</li>
		<li>Messen Sie die hydrodynamische Größe jeder Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)<ol>
<li>Ein 5-μL-Tropfen der Probenlösung wird auf ein C-beschichtetes 300-Mesh-Cu-Gitter getropft und an der Luft getrocknet. HINWEIS: Für konzentriertere Au NP-Lösungsproben ist eine Verdünnung erforderlich, um gut dispergierte Au-NPs auf einem TEM-Gitter zu erhalten.</li>
		<li>Erfassen Sie mehrere TEM-Bilder für jede Probe mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV.</li>
		<li>Messen Sie den Durchmesser von 200 Au-NPs für jede Stichprobe mit ImageJ, um die durchschnittliche Größe und die Standardabweichung zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bildung von CB7-UA-Komplexen
<ol><li>Herstellung einer 0,4 mM CB7-Lösung<ol>
<li>4,65 mg CB7 in eine 15 ml Durchstechflasche aus Glas geben. HINWEIS: Die Menge an CB7 wird basierend auf dem Formelgewicht von CB7 (= 1163 Da) berechnet, das von den meisten Berichten in der Literatur verwendet wurde. Dennoch enthalten CB7-Feststoffproben typischerweise Wasser, HCl, Methanol und andere Salze, die von den Synthese- und Reinigungsschritten übrig geblieben sind, was zu ~ 10 - 20% Eigengewicht in der Probe beiträgt. Die eingeschlossenen Lösungsmittel und Salze konnten nicht durch Erhitzen in einem Vakuumofen oder auf andere Weise entfernt werden. Ihre Mengen variieren zwischen verschiedenen Probenchargen, können aber mit Hilfe der Elementaranalyse quantifiziert werden. Das vorgelegte Protokoll reagiert jedoch nicht empfindlich auf das Vorhandensein einer nicht quantifizierten Menge an Lösungsmitteln und Salzen in den CB7-Proben.</li>
		<li>Geben Sie 10 ml Wasser in die Durchstechflasche und ziehen Sie die Kappe fest.</li>
		<li>Beschallen Sie die Probe bei Raumtemperatur, bis der CB7-Feststoff vollständig gelöst ist. HINWEIS: CB7 wurde gemäß Literatur27 synthetisiert, ist aber auch im Handel erhältlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung einer 0,4 mM UA-Lösung<ol>
<li>2,69 mg UA in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben.</li>
		<li>Geben Sie 40 ml Wasser in den Schlauch und ziehen Sie die Kappe fest.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Thermomixer, um die Probenlösung zu schwenken, indem Sie die Temperatur auf 70 °C, die Drehzahl auf 800 U/min und die Zeit auf 2 h einstellen. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. HINWEIS: UA hat eine geringe Löslichkeit in Wasser (0,40 mM)5. Länger schwenken, wenn das UA-Pulver nicht vollständig gelöst wurde. Alternativ kann Ultraschall verwendet werden, um die Auflösung zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequentielle Verdünnungen der 0,4 mM UA-Lösung<ol>
<li>Verdünnen Sie 5 ml der 0,4 mM UA-Lösung mit 5 mL Wasser in einer 15 mL Glasdurchstechflasche, um 10 mL 0,2 mM UA-Lösung zu erhalten. Ziehen Sie die Kappe fest und beschallen Sie für 30 s.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 mit einer angemessenen Menge UA und Wasser, wie in Tabelle 1 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der CB7-UA-Komplexe<ol>
<li>0,75 ml der 0,4 mM CB7-Lösung und 0,75 ml 0,4 mM UA-Lösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie Deckel und Beschallung für 30 s.</li>
		<li>Warten Sie 30 Minuten, um die Bildung von Gastgeber-Gäste-Komplexen sicherzustellen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 – 3.4.2 mit UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SERS-Erfassung von UA
<ol><li>Versuchsaufbau des Raman-Systems (Abbildung 3)<ol>
<li>Schalten Sie den 633 nm He-Ne Laser (22,5 mW) ein.</li>
		<li>Schalten Sie das modulare Raman-Spektrometer ein.</li>
		<li>Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software.</li>
		<li>Klicken Sie auf das Symbol Spektroskopie-Anwendungsassistenten , und wählen Sie dann Raman aus.</li>
		<li>Starten Sie eine neue Akquisition. Stellen Sie die Integrationszeit auf 30 s, scannt auf durchschnittlich 5 und boxcar auf 0.</li>
		<li>Speichern Sie das Hintergrundspektrum und geben Sie die Laserwellenlänge (d. h. 633 nm) ein. HINWEIS: Die Integrationszeit ist die Zeit für jeden Scan, die durchschnittlichen Scans sind die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um jedes Spektrum zu erstellen, und Boxcar ist die Anzahl der benachbarten Pixel, diedurchschnittlich 28 beträgt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildung der SERS-Substrate<ol>
<li>0,9 ml der 40 nm Au NP-Lösung und 0,1 ml der vorgeformten CB7-UA-Komplexlösung in ein 1,5-ml-Rohr geben. Befestigen Sie den Deckel und beschallen Sie, bis die Lösung von rubinrot zu lila wechselt. HINWEIS: Kommerzielle Citrat-stabilisierte 40 nm Au NP-Lösungsproben können ebenfalls verwendet werden. Typischerweise wird die optische Dichte des LSPR-Peaks (Localized Surface Plasmon Resonance) durch Verdünnung aus konzentrierten Stammlösungsproben auf 1 eingestellt. Die Citratkonzentration in der Probe wird typischerweise als 2 mM gehalten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probenlösung auf eine Semi-Mikroküvette. Legen Sie die Küvette in den Raman-Probenhalter und schließen Sie die Abdeckung.</li>
		<li>Starten Sie die Messung.</li>
		<li>Richten Sie die automatische Speicherung ein, um fünf aufeinanderfolgende SERS-Spektren aufzuzeichnen.</li>
		<li>Stoppen Sie die Messung und ändern Sie die Probe.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 – 4.2.5 mit CB7-UA-Lösung in verschiedenen Konzentrationen. HINWEIS: Die Aggregationszeit hängt von der Konzentration von UA in den Nanoaggregaten ab, die von 30 s für 0,1 μM UA bis 30 min für 20 μM UA reicht, da die Konzentration von leerem CB7 einen großen Beitrag zur Vermittlung der Aggregation von Au-NPs leistet. Für den CB7-UA-Komplex ist ein Portal durch das sperrige UA-Molekül blockiert, wodurch es für die Bindung an die Au-NP-Oberfläche nicht verfügbar ist und daher nicht in der Lage ist, die NP-Aggregation21 zu vermitteln. Die Probe ist bereit für die Messung, wenn sich die Farbe der Lösung von rubinrot zu violett ändert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datenanalyse
<ol><li>Datenverarbeitung<ol>
<li>Lade die Baseline mit dem ALS-Plugin (Asymmetric Least Squares) herunter und installiere es in Origin. HINWEIS: Das ALS-Plugin erfordert OriginPro.</li>
		<li>Fügen Sie die Rohdaten in Origin ein.</li>
		<li>Berechnen Sie einen Durchschnittswert aus den fünf SERS-Spektren jeder Probe. Teilen Sie den Wert durch die Leistung des Lasers (d. h. 22,5 mW) und durch die Integrationszeit (d. h. 30 s).</li>
		<li>Klicken Sie auf das ALS-Symbol , um das Dialogfeld zu öffnen. Legen Sie den asymmetrischen Faktor auf 0,001, den Schwellenwert auf 0,03 %, den Glättungsfaktor auf 2 und die Anzahl der Iterationen auf 20 fest, um die Basislinie jedes gemittelten Spektrums zu korrigieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie die SERS-Spektren verschiedener UA-Konzentrationen mit gestapelten Linien durch y-Offsets auf. Die Ausgabe sollte Intensität (zählt s-1 mW-1) gegen Raman-Verschiebung (cm-1) sein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das im Protokoll beschriebene automatisierte Syntheseverfahren ermöglicht es, Au NPs zunehmender Größe reproduzierbar zu synthetisieren. Obwohl es einige Elemente gibt, die noch manuell durchgeführt werden müssen, wie die schnelle Zugabe von Natriumcitrat während der Saatgutsynthese und die regelmäßige Überprüfung, um sicherzustellen, dass der PEEK-Schlauch sicher ist, ermöglicht diese Methode Au NPs großer Größe (bis zu 40 nm), die normalerweise mehrere manuelle Injektionen von HAuCl4 und Natriumcitrat erford...

Harnsäure, das Endprodukt des Stoffwechsels von Purinnukleotiden, ist ein wichtiger Biomarker in Blutserum und Urin für die Diagnose von Krankheiten wie Gicht, Präeklampsie, Nierenerkrankungen, Bluthochdruck, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1,2,3,4,5. Zu den aktuellen Methoden für den Harnsäurenachweis gehören kolorimetrische enzymatische Assays, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese, die zeitaufwendig und teuer sindund eine ausgeklügelte Probenvorbereitung erfordern 6,7,8,9.
Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie ist eine vielversprechende Technik für die routinemäßige Point-of-Care-Diagnose, da sie die selektive Detektion von Biomolekülen über ihre Vibrationsfingerabdrücke ermöglicht und zahlreiche Vorteile wie hohe Empfindlichkeit, schnelle Reaktion, Benutzerfreundlichkeit und keine oder nur minimale Probenvorbereitung bietet. SERS-Substrate auf Basis von Edelmetall-Nanopartikeln (z.B. Au NPs) können die Raman-Signale der Analytmoleküle durch starke elektromagnetische Verstärkung durch Oberflächenplasmonenresonanz 11 um 4 bis10 Größenordnungen10 verstärken. Au NPs mit maßgeschneiderten Größen können im Gegensatz zur zeitaufwändigen Herstellung komplexer Metall-Nanokomposite12 leicht synthetisiert werden und werden daher aufgrund ihrer überlegenen Eigenschaften13,14,15,16 häufig in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Die Anlagerung makrozyklischer Moleküle, Kürbis[n]urile (CB n, wobei n = 5-8, 10), an die Oberfläche von Au-NPs kann die SERS-Signale der Analytmoleküle weiter verstärken, da die hochsymmetrischen und starren CB-Moleküle den genauen Abstand zwischen den Au-NPs kontrollieren und die Analytmoleküle im Zentrum oder in unmittelbarer Nähe zu den plasmonischen Hotspots durch Bildung von Wirt-Gast-Komplexen lokalisieren können (Abbildung 1)17, 18,19,20. Frühere Beispiele für SERS-Studien mit Au NP: CBn Nanoaggregate umfassen Nitrosprengstoffe, polyzyklische Aromaten, Diaminostilbene, Neurotransmitter und Kreatinin 21,22,23,24,25, wobei die SERS-Messungen entweder in einer Küvette oder durch Laden eines kleinen Tröpfchens auf einen maßgefertigten Probenhalter durchgeführt werden. Dieses Nachweisschema ist besonders nützlich, um Biomarker in einer komplexen Matrix mit hoher Reproduzierbarkeit schnell zu quantifizieren.
Hierin wurde eine einfache Methode zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen von CB7 und einem wichtigen Biomarker UA und zur Quantifizierung von UA mit einer Nachweisgrenze von 0,2 μM über CB7-vermittelte Aggregationen von Au-NPs in wässrigen Medien unter Verwendung eines modularen Spektrometers demonstriert, das für diagnostische und klinische Anwendungen vielversprechend ist.

<table><tbody><tr><td>40 nm Gold-Nanopartikel</td><td>NanoComposix</td><td>AUCN40-100M</td><td>NanoXact, 0,05 mg/ml, blank (Citrat)</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning Falcon</td><td>14-432-22</td><td>50 mL Volumen</td></tr><tr><td>Cucurbit[7]uril</td><td>Im Labor hergestellt</td><td></td><td>siehe Ref. 19</td></tr><tr><td>Gold(III)-chlorid-Trihydrat</td><td>Sigma aldrich</td><td>520918</td><td>&ge; 99,9 % Spurenmetallbasis</td></tr><tr><td>Luer-Lock-Einmalspritze</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07945-15</td><td>3 mL Volumen</td></tr><tr><td>Luer-to-MicroTight Adapter</td><td>LuerTight</td><td>P-662</td><td>360 &mu; m Außendurchmesser Schlauch zur Luer-Spritze</td></tr><tr><td>PEEK-Schlauch</td><td>IDEX</td><td>1572</td><td>360 &mu; m Außendurchmesser, 150 &mu; m Innendurchmesser</td></tr><tr><td>PEEK-Schlauchschneider</td><td>IDEX</td><td>WZ-02013-30</td><td>Kapillar-Polymerchromatographie-Schlauchschneider für 360 & Mikro; m bis 1/32" OD Schlauch</td></tr><tr><td>Raman-Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>QE pro</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat tribasisches Dihydrat</td><td>Sigma aldrich</td><td>S4641</td><td>ACS Reagenz, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardsonde</td><td>Digi-Sense</td><td>WZ-08516-55</td><td>Typ-K</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Aladdin</td><td>ALADDIN2-220</td><td>2 Spritzen, maximales Spritzenvolumen 60 mL</td></tr><tr><td>Thermoelement-Thermometer</td><td>Digi-Sense</td><td>WZ-20250-91</td><td>Thermoelement-Thermometer mit einem Eingang und NIST-rückführbarer</td></tr><tr><td>Kalibrierung ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td>mit einem Eppendorf SmartBlock für 50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Harnsäure</td><td>Sigma aldrich</td><td>U2625</td><td>&ge; 99%, kristallin</td></tr></tbody></table>

quantitativer sers-nachweis von harnsäure durch bildung präziser plasmonischer nanoverbindungen in aggregaten von goldnanopartikeln und cucurbit[n]uril

Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril

Diese Arbeit beschreibt eine schnelle und hochempfindliche Methode zum quantitativen Nachweis eines wichtigen Biomarkers, Harnsäure (UA), mittels oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS) mit einer niedrigen Nachweisgrenze von ~0,2 μM für mehrere charakteristische Peaks im Fingerabdruckbereich unter Verwendung eines modularen Spektrometers. Dieses Biosensorschema wird durch die Wirt-Gast-Komplexierung zwischen einem Makrozyklus, Kürbis[7]uril (CB7) und UA und der anschließenden Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen innerhalb der selbstorganisierten Au NP: CB7-Nanoaggregate vermittelt. Eine einfache Au NP-Synthese der gewünschten Größen für SERS-Substrate wurde ebenfalls auf der Grundlage des klassischen Citratreduktionsansatzes mit der Option durchgeführt, mit einem im Labor gebauten automatisierten Synthesizer erleichtert zu werden. Dieses Protokoll kann leicht auf den Multiplex-Nachweis von Biomarkern in Körperflüssigkeiten für klinische Anwendungen erweitert werden.

In der vorgestellten Au-NP-Synthese zeigen die UV-Vis-Spektren eine Verschiebung der LSPR-Peaks von 521 nm auf 529 nm nach 10 Wachstumsschritten (Abbildung 4 A,B), während die DLS-Daten eine enge Größenverteilung zeigen, da die Größe der Au NPs von 25,9 nm auf 42,8 nm zunimmt (Abbildung 4C,D). Die durchschnittlichen Größen von G0, G5 und G10, die anhand von TEM-Bildern gemessen werden (Abbildung 4E)...

Ein Host-Gast-Komplex aus Cucurbit[7]uril und Harnsäure wurde in einer wässrigen Lösung gebildet, bevor eine kleine Menge in die Au NP-Lösung für die quantitative oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) mit einem modularen Spektrometer gegeben wurde.

Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[n]uril

This work describes a rapid and highly sensitive method for the quantitative detection of an important biomarker, uric acid (UA), via surface-enhanced ...

Dieses Protokoll bietet eine vielseitige Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Harnsäure mit hoher Empfindlichkeit. Daher handelt es sich um ein Protokoll für diagnostische und klinische Anwendungen. Dieses Protokoll kann Biomarker in einer komplexen Matrix, wie z. B. Körperflüssigkeiten, schnell quantifizieren.Diese Technik kann möglicherweise erweitert werden, um Krankheiten zu diagnostizieren, bei denen Harnsäure als Biomarker verwendet wird, wie z. B. Gicht, Bluthochdruck und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Es kann auch zur Detektion und Quantifizierung anderer gefährlicher Stoffe für die Umweltüberwachung verwendet werden. Beim ersten Versuch des Protokolls könnten Forscher Schwierigkeiten haben, stabile Aggregate aus CB7- und Gold-Nanopartikeln zu bilden.Es wird empfohlen, die Goldnanopartikel in CB7-Lösungen mittels Ultraschall zu mischen, da andere Techniken die Aggregationskinetik beeinflussen könnten. Ein Video, das kritische Schritte der Zugabe von CB7-Mischen zeigt, kann die Erfolgschancen und die Reproduzierbarkeit für Forscher erhöhen, wenn sie neu mit dem System sind. Für die Synthese von Goldsamen lösen Sie 98,5 Milligramm Auric in 10 Millilitern deionisiertem Wasser in einem Glasfläschchen, um eine 25 Millimolare Aurinchloridlösung und 64,5 Milligramm Natriumcitratpulver in 500 Mikrolitern deionisiertem Wasser in einem Glasfläschchen zu erhalten.Als nächstes verdünne man einen Milliliter der Aurachloridlösung mit 99 Millilitern Wasser in einer 250 Milliliter Flasche mit blauem Deckel, um eine 0,25 Millimolare Aurachloridlösung zu erhalten, und füge 99,5 Milliliter der 0,25 Millimolaren Aurachloridlösung in einen 250 Milliliter Dreihalskolben mit rundem Boden hinzu, der mit einem Kondensator ausgerüstet ist. Dann erhitzen Sie die Lösung 15 Minuten lang unter kräftigem Rühren auf 90 Grad Celsius, bevor Sie 500 Mikroliter der Natriumcitratlösung in den Kolben injizieren und so lange rühren, bis die Lösung rubinrot wird. Um das Wachstum der Goldnanopartikel zu initiieren, geben Sie 25 Milliliter der Goldsamenlösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und kühlen Sie die Lösung in einem ThermoMixer auf 70 Grad ab.Während die Lösung abkühlt, füllen Sie eine drei Milliliter Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 Millilitern 25 Millimolar Aurachloridlösung und füllen Sie eine weitere drei Millimeter Luer-Lock-Einwegspritze mit 2,5 Millilitern 60 Millimolar Natriumcitratlösung. Setzen Sie die Spritzen in Spritzenpumpen ein und verwenden Sie Luer-zu-MicroTight-Adapter, um PEEK-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 150 Mikromolaren an die Spritzen anzuschließen. Führen Sie den Schlauch in das Zentrifugenröhrchen mit der abgekühlten Goldsamenlösung in den ThermoMixer ein und stellen Sie beide Spritzenpumpen so ein, dass sie über einen Zeitraum von 20 Minuten 167,5 Mikroliter Lösung abgeben.Stellen Sie die Drehzahl des ThermoMixers auf 600 Umdrehungen pro Minute ein und drücken Sie Start an der Spritzenpumpe mit der 25 millimolaren Aurachloridlösung. Drücken Sie nach zwei Minuten an der Spritzenpumpe mit der 60 millimolaren Natriumcitratlösung auf Start. Entfernen Sie nach 30 Minuten ein Aliquot der Goldnanopartikellösung zur Analyse.Um eine 0,4 Millimolare CB7-Lösung herzustellen, geben Sie 4,65 Milligramm CB7 in ein 15-Milliliter-Glasfläschchen und 10 Milliliter Wasser in das Fläschchen. Nachdem Sie das Fläschchen fest verschlossen haben, beschallen Sie es bei Raumtemperatur, bis sich der CB7-Feststoff vollständig aufgelöst hat. Um eine 0,4 Millimolare Harnsäurelösung herzustellen, geben Sie 2,69 Milligramm Harnsäure in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 40 Milliliter Wasser in das Röhrchen.Nach dem festen Verschließen die Mischung in einem ThermoMixer auf 70 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute zwei Stunden lang schwenken. Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, verdünnen Sie einen Milliliter der 0,4 Millimolaren Harnsäurelösung mit neun Millilitern Wasser in einem 15 Milliliter Glasfläschchen, um eine 0,04 Millimolare Harnsäurelösung zu erhalten. Nachdem Sie das Fläschchen fest verschlossen haben, beschallen Sie es 30 Sekunden lang.Zur Herstellung der CB7-Harnsäurekomplexe geben Sie 750 Mikroliter der 0,4 Millimolaren CB7-Lösung und 750 Mikroliter der 0,4 Millimolaren Harnsäurelösung in ein 1,5 Milliliter-Röhrchen und beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang. Halten Sie dann die Röhre 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Bildung der Gastgeber-Gast-Komplexe sicherzustellen. Klicken Sie in der Raman-Systemsoftware auf das Symbol für den Spektroskopie-Anwendungsassistenten und wählen Sie Raman aus.Starten Sie eine Neuerfassung und setzen Sie die Integrationszeit auf 30 Sekunden, die Scans auf durchschnittlich fünf und den Güterwagen auf null. Speichern Sie dann das Hintergrundspektrum und geben Sie die Laserwellenlänge ein. Für die SERS-Substratbildung geben Sie 900 Mikroliter der 40-Nanometer-Gold-Nanopartikellösung und 100 Mikroliter der vorgeformten CB7-Harnsäure-Komplexlösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und beschallen, bis die Lösung von rubinrot nach violett wechselt.Übertragen Sie die Probenlösung in eine Semi-Mikroküvette und setzen Sie die Küvette in den Raman-Probenhalter ein. Schließen Sie die Abdeckung und starten Sie die Messung. Stellen Sie dann die automatische Speicherung so ein, dass fünf aufeinanderfolgende SERS-Spektren aufgezeichnet werden.Die ultravioletten sichtbaren Spektren für die synthetisierten Goldnanopartikel zeigen eine Verschiebung der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanzpeaks von 521 auf 529 Nanometer nach 10 Wachstumsschritten, während die dynamischen Lichtstreudaten eine enge Größenverteilung zeigen, wenn die Größe der Nanopartikel von 25,9 auf 42,8 Nanometer zunimmt. Die durchschnittlichen Größen von G0, G5 und G10, die aus Transmissionselektronenbildern gemessen werden, betragen etwa 20, 33 bzw. 40 Nanometer. In diesen repräsentativen Analysen wurden Wirt-Gast-Komplexe aus CB7 und Harnsäure mit leerem CB7 gebildet, was die Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen innerhalb der Goldnanopartikel CB7-Nanoaggregate vermittelt, was durch die charakteristischen Harnsäuresignale im SERS-Spektrum unterstützt wird.Umgekehrt können in Abwesenheit von CB7 keine SERS-Signale von Harnsäure beobachtet werden, was die Schlüsselrolle von CB7 bei der Auslösung der Goldnanopartikelaggregation verdeutlicht. Die hohe Empfindlichkeit des in diesem Protokoll vorgestellten Nachweisschemas wird durch die Beobachtung klarer SERS-Signale von den Harnsäurepeaks bei 640 und 1130 reziproken Zentimetern bis hinunter zur 0,2 mikromolaren Nachweisgrenze demonstriert. Darüber hinaus wurden sehr starke Korrelationen zwischen der SERS-Intensität und den logarithmischen Konzentrationen der Harnsäure für beide Peaks mit linearen Bereichen im Bereich von 0,2 bis 2 Mikromolaren nach dem Potenzgesetz erhalten.Harnsäure hat eine geringe Wasserlöslichkeit, daher muss sichergestellt werden, dass das Harnsäurepulver vor dem nächsten Schritt weich wird. Es kann eine fortschrittliche Datenanalyse durchgeführt werden, die es ermöglicht, mehrere in der Matrix vorhandene Biomarker zu quantifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Es wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele bereitgestellt, basierend auf einer einstellbaren Methode zur Auswahl magnetischer Beads. Aptamere, die mit strukturwechselnden Eigenschaften ausgewählt wurden, sind vorteilhaft für Assays, die eine Konformationsänderung erfordern, um das Vorhandensein eines Ziels zu signalisieren, wie z. B. der beschriebene Goldnanopartikel-Assay.

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In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Signal-Verbesserung der Nanoprobe-basierte Biosensoren vorgestellt. Das Protokoll basiert auf die Reduzierung der Chlorogoldsäure auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden, die aus Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln bestehen.

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Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Kalzium im Urin, die Nanokristalle von gesunden Erwachsenen enthält, nachweisen und quantifizieren kann. Die Ergebnisse der aktuellen Studie deuten darauf hin, dass NTA ein potenzielles Werkzeug zur Abschätzung von Urin-Nanokristallen während einer Nierensteinerkrankung sein könnte.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt einen bequemen Ansatz zur Integration von optischem Fang und oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), um plasmonische Nanopartikel für die empfindliche molekulare Detektion zu manipulieren. Ohne Aggregationsmittel setzt der Fanglaser plasmonische Nanopartikel zusammen, um die SERS-Signale von Zielanalyten für spektroskopische In-situ-Messungen zu verbessern.

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Hier wird die Synthese von Gold (Au)-Samen mit der Turkevich-Methode beschrieben. Diese Seeds werden dann zur Synthese von Nanopartikeln aus Gold-Zinn-Legierung (Au-Sn) mit einstellbaren plasmonischen Eigenschaften verwendet.

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Lernen Sie die quantitative SERS-Detektion von Harnsäure mit Cucurbit[7]uril und Goldnanopartikeln für diagnostische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Quantifizierung von Biomarkern in komplexen biologischen Matrices.

Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit n uril (Video) | JoVE Journal

Quantitativer SERS-Nachweis von Harnsäure durch Bildung präziser plasmonischer Nanoverbindungen in Aggregaten von Goldnanopartikeln und Cucurbit[n]uril

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