Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

Es gibt verschiedene Kristallisationsansätze zur Gewinnung von großen und hochwertigen Kristallen sowohl für die Röntgen- als auch für die Neutronenkristallographie. Einer dieser Ansätze ist die Verwendung der Dialysemethode. Bei dieser Technik wird die Proteinlösung durch eine halbdurchlässige Membran von einer Niederschlagslösung getrennt.

Die Niederschlagsmoleküle diffundieren über die Membran in die Proteinkammer. Wenn die richtige Übersättigung für eine spontane Keimbildung erreicht ist, erscheinen die ersten Kerne. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys ein vollautomatisiertes Instrument verwendet werden kann, das in unserem Labor entwickelt wurde und die temperaturgesteuerte Dialysekristallisation verwendet, und unsere Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle für die natürliche makromolekulare Kristallographie basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Für einen Mikrodialyseknopf mit bestimmter Mikroliter-Volumenpipette 35 Mikroliter Lysozymlösung in die Dialysekammer. Dieses zusätzliche Volumen erzeugt eine leicht kuppelförmige Form auf der Oberseite der Dialysekammer und verhindert die Bildung von Luftblasen. Nehmen Sie einen Applikator und legen Sie das Elastik oder den Ring an der Äußersten Stelle.

Legen Sie die Membran auf die Kammer und fixieren Sie sie, indem Sie den Elastik oder Ring vom Applikator auf die Nut des Dialyseknopfes übertragen. Übertragen Sie die Taste auf den Brunnen, der die Kristallisationslösung enthält. Bedecken Sie den Brunnen mit einem Glasdeckel oder einem Stück Klebeband.

Bewahren Sie die Probe bei 293 Kelvin in einem vibrationsfreien Thermoregler-Inkubator auf. In dem Wissen, dass die Dialysekristallisation Vorteile aus der Sicht des Kristallwachstums bietet, wurde die Kristallisationsbank, sogenannte OptiCrys, in unserem Labor entwickelt, um eine vollautomatische kombinierte Regelung der Temperatur und chemischen Zusammensetzung des biomolekularen Kristallisationsexperiments zu bieten. Die Optimierung des Kristallwachstums durch OptiCrys basiert auf den temperaturumfällten Konzentrationsphasendiagrammen.

Die Keimbildung erfolgt in der Keimungszone in der Nähe der metastabilen Zone und das Kristallwachstum findet dann in der metastabilen Zone nach dem Phasendiagramm statt, bis die Proteinkonzentration die Löslichkeitskurve erreicht, die das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Lösung und Kristallen darstellt. Durch die Senkung der Temperatur im Falle des Proteins mit direkter Löslichkeit oder durch Erhöhung der Niederschlagskonzentration im Falle des Aussalzens bleibt die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone und es tritt keine Keimbildung auf. Kristalle wachsen, bis das Gleichgewicht der zweiten Kristalllösung erreicht ist und danach wird keine weitere Zunahme der Größe der Kristalle beobachtet.

Die Temperatursenkung oder Erhöhung der Niederschlagskonzentration wird mehrmals wiederholt, bis die Kristalle die gewünschte Größe erreichen. Fügen Sie die Proteinlösung in die Dialysekammer des temperaturgeregelten Fließens ein, decken Sie die Überkammer mit der Dialysemembran ab und fixieren Sie die Membran mit dem Elastik oder Ring. Drehen Sie die Überkammer um und legen Sie sie auf die Dialysekammer.

Drücken Sie es sanft und langsam, um die gesamte Luft zwischen zwei Stücken eingeschlossen zu entfernen, fixieren Sie das Reservoir in seiner Position, indem Sie es sanft auf die Überkammer schrauben. Fügen Sie die Kristallisationslösung in die Reservoirkammer ein und decken Sie sie mit der luftdichten Kappe ab. Übertragen Sie diese Baugruppe und in die Brustunterstützung der Kristallisationsbank OptiCrys Crystal Wachstum ist eine Überwachungssoftware der Kristallisation stube OptiCrys.

Es enthält vier verschiedene grafische Schnittstellen oder Ansichten. Die Home-Ansicht enthält Schaltflächen, um zu den anderen Ansichten zu navigieren. Der Zweck der Setup-Schnittstelle besteht darin, ein Experimentszenario zu definieren, das automatisch in der Testansicht ausgeführt werden kann.

Die letzte Ansicht ist die Wartungsansicht. Um ein Experiment neu zu starten, muss die Wartungsansicht geöffnet sein, in der alle wesentlichen Parameter für den reibungslosen Ablauf der Kristallisationsexperimente gefunden werden. Erhöhen Sie die Leuchtkraft aus dem Lichtabschnitt, Licht kann von Null, kein Licht auf 100 maximale Helligkeit erhöhen.

Zur Steuerung und Überwachung der Temperatur wird der Temperaturreglerverwendet. Klicken Sie auf die Schaltfläche, um sie einzuschalten. Stellen Sie die Temperatur auf dem Sollwertabschnitt ein, und drücken Sie die Eingabetaste.

Unterhalb dieser Schaltfläche befinden sich zwei Diagramme. Die rote zeigt das Finale, die Auftragstemperatur und das gelbe Diagramm die aktuelle Temperatur. Durch das Mischen einer Stammlösung wird eine Injektion der Kristallisationslösung in die Reservoirkammer durch Palm-Sektion gesteuert.

Fügen Sie die Konzentration der Stammlösung in der ersten Stufe hinzu. Dann finden Sie die endgültige Konzentration jeder neuen Grouper-Lösung und fügen Sie sie dem endgültigen Konzentrationsabschnitt hinzu. Nach dem Drücken der Berechnungstaste, finden Sie heraus, Volumen der Lagerlösung wird berechnet werden und wird in der Volumenplatte vor jedem Konzentrationspanel hinzufügen.

Drücken Sie die Startvorbereitungstaste und warten Sie, bis die neue Premier-Lösung fertig ist. Um die Kristallisationslösung auszutauschen, klicken Sie auf die Schaltfläche Lösungseingabe. Um den Vorgang zu beenden, drücken Sie die Taste Verteilung anhalten.

Auf der rechten Seite des Mikroskop-Abschnitts, Es gibt mehrere Panels für die Aufzeichnung wichtiger Informationen aus jedem Kristallwachstumsexperiment. Fügen Sie in diesem Abschnitt den entsprechenden Proteinnamen, das Molekulargewicht und den Kristallisationszustand hinzu. Definieren Sie einen Namen für Ihre Experimente, indem Sie ihn einfach in den Ordnernamen eingeben.

Wählen Sie im Abschnitt nb images die Anzahl der Bilder aus, die während des Experiments aufgenommen werden sollen. Fügen Sie die Nummer der Bilder und aus dem Panel auf der rechten Seite, wählen Sie die Timer-Skala. Klicken Sie auf die Ordnerschaltfläche, um den Ordner zu öffnen.

In diesem Ordner befindet sich eine Textdatei mit allen Informationen, die Sie zuvor für Ihr Experiment definiert haben. Bilder, die für jede weitere Behandlung bereit sind, werden ebenfalls in diesem Ordner gespeichert. Zoomen Sie das Mikroskop kann auch automatisch variiert werden.

Ändert den Zoom, indem Sie die Plus- und Minustaste oben im Mikroskopbereich verwenden, um die Vergrößerung zu erhöhen bzw. zu verringern. Es gibt drei verschiedene Möglichkeiten, die Kristallgröße zu messen. Verwenden Sie zum Messen der Länge oder Breite den Breitenvektor.

Je nach Kristallform können die spezifischen Werkzeuge aus dem linken Teil des Mikroskopteils ausgewählt werden. Z. B. ein rechteckiges oder Polygon. Die Werte werden im Measureabschnitt angezeigt.

In den ersten Experimenten wurden Mikrodialyseknöpfe in die Kristallisationslösungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen eingetaucht. In diesem einfachen Kristallisationsgitterexperiment ist die einzige Variable die Niederschlagskonzentration. während die Temperatur konstant gehalten wird.

Leichte Schwankungen der Salzkonzentration ermöglichen die Untersuchung des Kristallisationsphasendiagramms durch Erhöhung der Salzkonzentration von 0,7 auf 1,2 molare Übersättigung und die Lösung in der Keimationszone bewegt sich von der metastabilen Zone weg. Folglich wird eine Variation in Größe und Anzahl der Kristalle beobachtet, wobei die Anzahl der Kristalle zunimmt und ihre Größe abnimmt. Im ersten Experiment mit OptiCrys unter der gegebenen experimentellen Bedingung befindet sich die Kristallisationslösung in der Kernzone in der Nähe der metastabilen Zone des Kristallisationsphasendiagramms, sobald das Gleichgewicht in der Dialysekammer erreicht ist.

Infolgedessen werden in der ersten Phase des Experiments nur wenige Kerne erzeugt. Um das Wachstum von Kristallen in der metastabilen Zone zu halten und den Kristallwachstumsprozess zu steuern, wurde die Temperatur in unterschiedlichen Zeitintervallen verändert. Jedes Mal, wenn das Gleichgewicht der Kristalllösung abgeschlossen war, wurde die Temperatur variiert.

Daher sank die Temperatur auf 291 Kelvin, 288 Kelvin und schließlich 275 Kelvin, um das Wachstum des ausgewählten Kristalls in der metastabilen Zone aufrechtzuerhalten. Das Ergebnis dieses Experiments ist ein einziger großer Kristall mit dem Volumen, das für die natürliche makromolekulare Kristallographie erforderlich ist. Die nächsten beiden Experimente zeigen die Reversibilität der temperaturgesteuerten Dialyseexperimente für Keimbildung, Kristallwachstum, Auflösung und Nachwachsen.

Im zweiten Experiment mit OptiCrys wurde die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung durch das Experiment konstant gehalten und die Temperatur variiert. Die Anfangstemperatur wurde auf 291 Kelvin eingestellt. Aufgrund der hohen Übersättigung tauchte eine große Anzahl kleiner Kristalle in der Kristallisationskammer auf.

In Übereinstimmung mit dem Konzept der direkten Proteinlöslichkeit sollten sich durch allmähliche Erhöhung der Temperatur auf 313 Kelvin alle Kristalle auflösen. Schließlich, durch die Senkung der Temperatur auf 295 Kelvin, die zweite Keimbildung in der Nähe der metastabilen Zone initiiert und erlaubt, den Keimbildungsprozess zu kontrollieren, was zur Bildung einer geringeren Anzahl von Kernen. Weiteres Kristallwachstum ermöglichte die Erzeugung der einheitlichen Population größerer Kristalle.

In diesem Experiment führt die Veränderung der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung bei konstanter Temperatur zu einer gleichmäßigen Population größerer Kristalle. Der Kristallisationszustand war ähnlich wie beim vorherigen Experiment. Die Auflösung der Kristalle wurde erreicht, indem die NaCl-Konzentration schrittweise von 0,9 Mol auf Null gesenkt wurde.

Durch die Reduzierung der Salzkonzentration bleibt die Lösung in der untergesättigten Zone des Phasendiagramms, was zur Auflösung der Kristalle führt. Dann wurde die neue Kristallisationslösung mit geringerer Ionenstärke als bisher in die Reservoirkammer injiziert. Bei dieser Niederschlagskonzentration erscheint die geringere Anzahl von Kristallen und die Kristalle erreichen ein größeres Volumen als zuvor.

Hier stellten wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Probenvorbereitung beschreibt und die Steuerungssoftware für den Anbau von großen und hochwertigen Kristallen für die natürliche makromolekulare Kristallographie mit einem vollautomatischen Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde, anpasst. Dieses Schritt-für-Schritt-Verfahren wurde entwickelt und profitiert von den Kenntnissen des Kristallisationsphasendiagramms, um Keimbildung und Kristallwachstum zu trennen. Darüber hinaus wird ein Protokoll für den Anbau von Kristallen mit Mikrozytosemustern auch mit Makrozytose-Tasten als Alternative präsentiert, wenn OptiCrys nicht verfügbar ist.

Zusätzlich zu den Strategien, die ich für OptiCrys erwähnt, die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung und Temperatur zu ändern und Bilder zu machen, sollte manuell durchgeführt werden. Die Verwendung der thermisch geregelten Schwingung für den Inkubator, um die Temperatur konstant zu halten, ist erforderlich, was ein entscheidender Schritt in der demonstrierten Methodik ist.