Isolierung proximaler Flüssigkeiten zur Untersuchung der Tumormikroumgebung des Pankreas-Adenokarzinoms
5. November 2020
Pankreassaft ist eine wertvolle Quelle von Biomarkern für menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs. Wir beschreiben hier eine Methode für das intraoperative Sammelverfahren. Um die Herausforderung zu meistern, dieses Verfahren in Mausmodellen anzuwenden, schlagen wir eine alternative Probe, die interstitielle Tumorflüssigkeit, vor und beschreiben hier zwei Protokolle für ihre Isolierung.
Die hier beschriebene Methode zur Isolierung von proximaler Flüssigkeit sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen kann zur Untersuchung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs angewendet werden, um neue Biomarker für die Krankheit zu identifizieren. Mit diesem unkomplizierten Protokoll ist es möglich, klinische Befunde aus Pankreassaft auf Mausmodelle von PDAC zu übertragen, um mechanistische Studien durchzuführen. Pankreassaft ist eine weitgehend unerforschte Körperflüssigkeit, die sich als vielversprechende Quelle wertvoller Biomarker erwiesen hat, um die präoperative Diagnose und die Erstellung von Patientenprofilen zu unterstützen.
Ich werde den ersten Teil des Protokolls vorführen, und Marialuisa Barbagallo, eine Postdoktorandin aus unserem Labor, wird den zweiten Teil des Protokolls demonstrieren. Schätzen Sie die Lage des Pankreasgangs anhand von Messungen, die während der Bildgebung erfasst wurden. Palpieren Sie dann die vordere Oberfläche der Bauchspeicheldrüse, um ihre genaue Position zu identifizieren.
Halten Sie den Pankreaskopf von unten in den Zwölffingerdarm und heben Sie ihn mit der linken Hand an, wobei Sie mit dem ersten Finger die Position des Pankreasgangs markieren. Führen Sie mit der rechten Hand eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel in die Bauchspeicheldrüse ein, nur distal zum linken Daumen. Bestimmen Sie die Eindringtiefe und den Neigungsgrad der Nadel auf der Grundlage präoperativer Messungen und der Wahrnehmung, die Kanalwand durchdrungen zu haben.
Ziehen Sie den Saft mit der Spritze heraus. Wenn es nicht möglich ist, den Saft zu entnehmen, verlagern Sie die Nadel, um den Pankreasgang zu kanülieren. Sobald der Pankreassaft entnommen ist, bewegen Sie ihn außerhalb des sterilen Feldes und geben Sie ihn in ein drei Milliliter EDTA-Vakuumreagenzglas.
Halten Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius, bis die Probe ins Labor überführt wird. Um den Pankreassaft zu verarbeiten, zentrifugieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 400 g und vier Grad Celsius, um alle Zellen oder Ablagerungen zu entfernen. Der Überstand wird zurückgewonnen, aliquotiert und bis zu weiteren Analysen bei 80 Grad Celsius gelagert.
Um Tumor-Interstitielle Flüssigkeit oder TIF durch Zentrifugation zu isolieren, schneiden Sie den Tumor in zwei Hälften, spülen Sie die beiden Teile mit PBS ab und tupfen Sie sie vorsichtig auf Filterpapier ab, wobei Sie sich so schnell wie möglich bewegen, um eine Verdunstung aus dem Tumor zu vermeiden. Übertragen Sie den Tumor sofort in ein 20-Mikrometer-Nylon-Zellsieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen befestigt ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Holen Sie das TIF vom Boden des Rohrs, aliquotieren Sie es und frieren Sie es sofort auf Trockeneis ein. Bis zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius lagern. Um das TIF mittels Elution zu isolieren, schneiden Sie den Tumor mit einer Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke und spülen Sie diese vorsichtig mit kaltem PBS ab.
Übertragen Sie die Tumorstücke in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter PBS mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu, um einen Abbau der Analyten zu vermeiden. Inkubieren Sie das Gewebe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und führen Sie eine Reihe von Zentrifugationsschritten bei vier Grad Celsius durch, um alle Zellen aus der Probe zu entfernen.
Rückgewinnung des Überstands nach jeder Zentrifugation und Überführung in ein neues Röhrchen. Nach der letzten Zentrifugation wird die TIF-Probe sofort aliquotiert und auf Trockeneis eingefroren. Lagern Sie es bis zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um den Pankreassaft von Patienten mit PDAC und anderen gutartigen Pankreasbeschwerden zu erhalten. Nach dem Filtern der breiten NMR-Signale von Makromolekülen waren die Signale von Metaboliten mit kleinem Molekulargewicht offensichtlich. Die überwachte OPLS-DA-Analyse zeigte, dass das metabolische Profil im Pankreassaft in der Lage war, zwischen PDAC- und Nicht-PDAC-Patienten mit einer Genauigkeit von 82,4 % zu unterscheiden. Interessanterweise ergab die metabolomische Analyse, die an Plasmaproben derselben Patienten durchgeführt wurde, nicht die gleiche Unterscheidungskraft.
Um zu zeigen, dass der Gehalt an interstitieller Flüssigkeit im Tumor Veränderungen in der Tumormikroumgebung zuverlässig widerspiegelt, wurden zwei Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien mit entgegengesetzten glykolytischen Raten subkutan in Mäuse injiziert. Nach der Exzidierung der Tumoren wurden die Konzentrationen von Glukose und Laktat quantifiziert. Die interstitielle Tumorflüssigkeit von hochglykolytischen Tumoren enthielt im Vergleich zu niedrigglykolytischen Tumoren weniger Glukose und mehr Laktat.
In dieser Studie führten wir eine Metabolomik-Analyse durch. Diese proximalen Flüssigkeiten eignen sich jedoch für viele andere nachgelagerte Anwendungen, wie z. B. Massenspektrometrie und microRNA-Profiling.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur intraoperativen Gewinnung von Pankreassaft vor, einer wertvollen Quelle für Biomarker des Pankreaskarzinoms. Außerdem führt er eine alternative Probe, die tumorinterstitielle Flüssigkeit, ein und beschreibt Protokolle zu deren Isolierung in murinen Modellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Biomarker-Entdeckung
Hintergrund
- Pankreassaft ist als Biomarkerquelle bisher wenig erforscht.
- Er bietet ein Potenzial zur Unterstützung der präoperativen Diagnose.
- Das Verständnis des Mikroumfeldes von Pankreaskrebs ist entscheidend.
- Die Übertragung von Erkenntnissen aus humanen Studien auf murine Modelle kann die Forschung voranbringen.
Zweck der Studie
- Isolierung von Pankreassaft und tumorinterstitieller Flüssigkeit zur Identifizierung von Biomarkern.
- Bereitstellung von Protokollen, die sowohl bei humanen als auch bei murinen Modellen anwendbar sind.
- Erleichterung mechanistischer Studien des Pankreaskarzinoms.
Verwendete Methoden
- Intraoperative Sammlung von Pankreassaft.
- Isolierung von tumorinterstitieller Flüssigkeit.
- Bildgebende Verfahren zur Lokalisation des Pankreasgangs.
- Palpation der Bauchspeicheldrüse zur präzisen Identifizierung.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesene Protokolle zur Flüssigkeitsisolierung.
- Hervorhebung des Potenzials von Pankreassaft als Biomarkerquelle.
- Zeigte die Durchführbarkeit der Übertragung klinischer Befunde auf murine Modelle.
- Schuf eine Grundlage für zukünftige mechanistische Studien.
Schlussfolgerungen
- Pankreassaft und tumorinterstitielle Flüssigkeit sind aussichtsreich für die Biomarker-Forschung.
- Die Protokolle können das Verständnis von Pankreaskrebs verbessern.
- Weitere Studien sind erforderlich, um das volle Potenzial dieser Flüssigkeiten zu erschließen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Isolierung von proximalem Fluid ermöglicht eine direkte Untersuchung des Mikroumfelds des Pankreasadenokarzinoms und bietet einen Weg zur Biomarker-Entdeckung, der klinische Beobachtungen mit präklinischen mechanistischen Studien verbindet. Durch die Bereitstellung technisch zugänglicher Methoden zur Gewinnung von Pankreassaft und tumorinterstitiellem Fluid sowohl beim Menschen als auch bei murinen Systemen unterstützt das Protokoll Bemühungen zur Target-Validierung und Assay-Entwicklung, die auf mikroumgebungsbedingten Veränderungen fokussiert sind. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckung, indem er krankheitsrelevante Fluide liefert, die Wechselwirkungen zwischen Stroma und Tumorzellen widerspiegeln, und somit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der Arzneimittelentwicklung für Pankreaskrebs unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Isolierung von Flüssigkeiten, die Biomarker aus dem Tumormikroumfeld anreichern.
- Operationaler Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur funktionellen Zielvalidierung unter Verwendung von proximalen Flüssigkeitsbiomarkern.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch vergleichende Analyse glykolytischer Tumorphänotypen mittels Quantifizierung von Glukose und Laktat in TIF.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Flüssigkeiten für nachgeschaltete Anwendungen wie Massenspektrometrie und Mikro-RNA-Profilierung vor.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte, reproduzierbare Isolationsprotokolle (Zentrifugation und Elution), die für die Skalierbarkeit von Assays geeignet sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Metabolitenmesswerte, die eine screeningtaugliche Biomarker-Detektion mit diskriminativer Aussagekraft ermöglichen (82,4 % Genauigkeit in der OPLS-DA).
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Schafft Krankheitsrelevanz durch die Übertragung von Befunden aus humanem Pankreassaft auf murine TIF-Modelle.
- Operativer Wert: Ermöglicht die präklinische Validierung durch die Isolierung von TIF aus subkutanen Tumormodellen, die mikroumgebungsbedingte Veränderungen widerspiegeln.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem Flüssigkeits-Biomarkerprofile mit dem Tumorphänotyp verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung und ermöglicht eine Profilierung des Mikroumfelds, die mechanistische Studien und biomarkergeführte Screening-Kampagnen unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung von Flüssigkeiten, die die Stroma-Tumor-Interaktionen bei PDAC widerspiegeln.
- Screening: Ermöglicht die Bereitstellung von Proben für Assays durch standardisierte Isolierung von TIF und Pankreassaft mit quantitativen Ausgaben an Metaboliten und Nukleinsäuren.
- Analytik: Stellt messbare Biomarker (Glukose, Laktat, Metaboliten) für den vergleichenden Analysen von Krankheitszuständen und phänotypische Screenings bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem gezeigt wird, dass TIF im murinen Modell den glykolytischen Tumorstatus widerspiegelt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Isolierung von benachbarten Flüssigkeiten in menschlichen und murinen Systemen und verringert damit Barrieren bei der Modellübertragung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch die Detektion mikroumgebungsbezogener Biomarker und Zielvalidierung bei PDAC.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch einfache Zentrifugations- und Elutionsverfahren zur TIF-Isolierung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Verknüpfung von flüssigen Biomarkern mit dem Tumorphänotyp und damit verbundene Verringerung des biologischen Risikos in späteren Stadien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf biomarkerdiskriminierenden Flüssigkeitsprofilen (82,4 % Genauigkeit bei PDAC im Vergleich zu Nicht-PDAC).
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im chirurgischen Umgang mit Flüssigkeiten und in der Tumordissektion zur proximalen Flüssigkeitsisolation.
- Benötigt Zentrifugalausrüstung (400 G, 4°C) sowie sterilen Umgang mit Flüssigkeiten für die Verarbeitung von Pankreassaft und TIF.
- Setzt eine standardisierte Zusammenarbeit zwischen chirurgischen, pathologischen und analytischen Teams zur Sicherstellung der Probenechtheit voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen zur Isolation von murinem TIF mittels Zentrifugation oder Elution, abhängig von der Gewebegröße und der geplanten Weiterverwendung.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die technische Schwierigkeit bei der Gewinnung von murinem Pankreassaft, wodurch TIF als Surrogat notwendig wird.
