Neutronenradiographie und Computertomographie biologischer Systeme am Hochflussisotopenreaktor des Oak Ridge National Laboratory
7. Mai 2021
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Neutronenradiographie und Computertomographie biologischer Proben unter Verwendung eines Hochfluss-Isotopenreaktors (HFIR) CG-1D-Beamlines zur Messung eines Metallimplantats in einem Rattenoberschenkelknochen, einer Mauslunge und einem krautigen Pflanzenwurzel-/Bodensystem.
Die Nährstoffradiographie und die Computertomographie sind aufgrund der Empfindlichkeit der Nährstoffe gegenüber Wasserstoffatomen einzigartig positioniert, um biologische Proben zu messen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, zerstörungsfreie und nicht-invasive dreidimensionale Karten des Wasserstoffgehalts in Gewebeproben oder des Wassergehalts in Pflanzenwurzeln und -böden zu erstellen. Die Nährstoffbildgebung ist auf viele verschiedene Forschungsbereiche anwendbar, z. B. auf Energiematerialien, Materialwissenschaften, Ingenieurwesen, Pflanzen, Boden, Wasserbewegungen usw.
Diese Technik kann aufgrund der Risiken der Strahlenbelastung nicht für die Therapie oder Institutsdiagnostik verwendet werden. Es kann aber zum Beispiel zur Bestimmung von Tumorrändern in kleinen resezierten intakten Tumoren verwendet werden. Ich empfehle einer Person, die sich für diese Technik interessiert, sich mit uns in Verbindung zu setzen und ihre Forschungsfragen zu besprechen.
Unsere Informationen finden Sie auf unserer Website, neutrons.ornl.gov. Yuxuan Zang, Wissenschaftler für Neutronenstreuung, Jean Bilheux, Wissenschaftler für Computerinstrumente, und Erik Stringfellow, wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Imaging-Team, demonstrieren das Verfahren. Öffnen Sie zunächst ein Terminalfenster auf dem Beamline-Computer.
Geben Sie CSS ein und drücken Sie die Eingabetaste, um die Benutzeroberfläche zu starten. Falls nicht standardmäßig geöffnet, wählen Sie auf der Registerkarte Menü die Option Benutzerstart, um die APEX Imaging-Oberfläche zu öffnen. Wählen Sie auf der ersten Registerkarte der Benutzeroberfläche, ProposalCameraSE-Gerät, die Beamline-Optik aus, indem Sie auf die Schaltfläche Optik neben Kamera/Detektoren klicken.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Schlitze, um die Größe der Lochblende und die Öffnung des Schlitzsystems einzustellen. Schrauben Sie den Rotationstisch auf die XY-Tische, auf denen die Probe platziert werden soll. Wenn Sie einen anderen Detektor als CCD verwenden, wählen Sie ein Objektiv entsprechend der gewünschten räumlichen Auflösung und Brennweite aus.
Nachdem Sie die Kamera fokussiert haben, fokussieren Sie das Bild auf die Position des Neutronenszintillators. Legen Sie dann eine neutronenabsorbierende Auflösungsmaske an den Detektorszintillator, um den Linsenfokus mit Neutronen fein abzustimmen. Automatisieren Sie als Nächstes mit APEX die Bewegung des Detektormotors und erfassen Sie übermäßige Röntgenbilder mit verschiedenen Detektorpositionen vom Spiegel aus.
Vergleichen Sie die Röntgenaufnahmen, indem Sie Linienpaare in einer Bildsoftware wie Fiji oder ImageJ auswerten. Befestigen Sie dann die Probe in einem geeigneten Aluminiumbehälter oder einer strapazierfähigen Aluminiumfolie und platzieren Sie die Probe so nah wie möglich am Detektor auf dem Rotationstisch. Messen Sie den Abstand zwischen Probe und Detektor und entnehmen Sie die Probe.
Ersetzen Sie sie durch die Auflösungsmaske, um die Pixelgröße an der Abtastposition in dieser Beamline-Konfiguration auszuwerten. Werten Sie anhand einer bekannten Feature-Dimension die Anzahl der Pixel im Feature aus, um die Pixelgröße zu bestimmen. Positionieren Sie die Probe auf dem Rotationstisch neu.
Richten Sie als Nächstes auf der Registerkarte "Probe ausrichten" in der APEX-Benutzeroberfläche die Probe auf den Neutronenstrahl aus, indem Sie aufeinanderfolgende, schnelle Röntgenaufnahmen machen, während sich die Probe bewegt, bis sie vollständig vom Detektor aus sichtbar ist. Speichern Sie die Beispielausrichtungsdatei. Bevor Sie mit dem CT-Scan beginnen, klicken Sie auf die Registerkarte Probe ausrichten und verwenden Sie die Option Automatische Probenrotationsprüfung, um zu überprüfen, ob die Probe in verschiedenen Winkeln im Sichtfeld bleibt, indem Sie Röntgenbilder bewerten, da sie in unterschiedlichen Probenausrichtungen mit dem Strahl erstellt werden.
Wählen Sie die erste APEX-Registerkarte mit dem Namen ProposalCameraSE Device aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Vorschlag oder Muster wechseln. Wählen Sie die Projektnummer und die Proben-ID, die gemessen werden sollen, in der Stichprobenliste auf der rechten Seite und der Liste der Vorschläge auf der linken Seite aus.
Verwenden Sie den Zurück-Pfeil, um zur APEX-Hauptschnittstelle zurückzukehren. Wählen Sie in der Optionsliste Kameradetektor den Detektor aus vier verfügbaren Detektoren und/oder CCD und/oder sCMOS, SBIG CCD oder MCP aus. Klicken Sie im Abschnitt Sample Environment Device auf Rotation Stage, CT Scan.
Wählen Sie dann eine der Rotationsstufen aus, die der zu scannenden Probe entspricht. Wählen Sie unten auf der Registerkarte den Datenerfassungsmodus und dann den weißen Strahl aus. Wählen Sie dann die zweite APEX-Registerkarte mit dem Namen Align Sample (Stichprobe ausrichten) aus.
Geben Sie einen Beispieldateinamen ein, drücken Sie die Eingabetaste. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Namen des Unterordners. Angenommen, die Probe ist ausgerichtet und bereit für die CT. Wählen Sie eine gewünschte Aufnahmezeit aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Schnellbilder aufnehmen, um eine Reihe von Röntgenaufnahmen mit unterschiedlichen Aufnahmezeiten zu erfassen.
Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu bewerten, öffnen Sie die gesammelten Röntgenaufnahmen in ImageJ oder Fiji und zeichnen Sie ein Profil, das von der Probe bis zu einem offenen Bereich reicht. Wenn mehrere Samples auf dem XY-Tisch auf mehreren Rotationstischen eingestellt sind, zeichnen Sie jede Probenposition nach der Ausrichtung auf und klicken Sie auf die Schaltfläche In einer Datei speichern, um die Daten als CSV-Datei zu speichern. Wählen Sie als Nächstes die dritte APEX-Registerkarte mit dem Titel Daten sammeln, um die CT-Scan-Parameter einzurichten.
Geben Sie einen Dateinamen in die erste beschreibbare Zeile ein, drücken Sie die Eingabetaste. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Namen des Unterordners. Wählen Sie im Abschnitt "Sample mit der gespeicherten Datei ausrichten" die Datei aus, in der zuvor die Positionen des Sample-Motors aufgezeichnet wurden.
Klicken Sie auf Mit Datei ausrichten, um die Probe wieder in Position im Neutronenstrahl zu bringen. Um die Anzahl der Projektionen basierend auf dem Satz von Nyquist zu berechnen, berechnen Sie zunächst die Anzahl der Pixel über die horizontale Dimension der Stichprobe und multiplizieren Sie sie mit 1,5, um die Anzahl der Projektionen zu erhalten, die erforderlich sind, um die Stichprobe von Nyquist zu erfüllen. Geben Sie den Rotationsstartwinkel, den Rotationsendewinkel, die Rotationsschrittgröße, die Anzahl der Bilder pro Schritt und die Belichtungszeit für jedes Bild ein.
Starten Sie den CT-Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Daten sammeln klicken. Greifen Sie auf dem Linux-Analyseserver auf das Imaris 3D-Notizbuch zu, indem Sie auf die obere Menüverknüpfung, Anwendungen und dann auf Analyse-Bildgebung und CT-Rekonstruktion klicken. Führen Sie die ersten Zeilen des Codes aus, um die Werkzeuge zu laden, die zum Ausführen von Imaris 3D erforderlich sind.
Laden Sie die Daten flach und im Dunkelfeld. Stellen Sie sicher, dass alle drei Datensätze ordnungsgemäß geladen sind. Schneiden Sie die Daten zu, indem Sie den gewünschten Bereich im Bild auswählen.
Führen Sie die Filterung nach Bedarf durch, indem Sie den Code im Filterabschnitt ausführen. Fahren Sie mit der Normalisierung fort, gefolgt von der Korrektur der Strahlfluktuation. Wählen Sie den Hintergrundbereich aus dem Bild aus, gefolgt von der Übertragung zur Dämpfung.
Führen Sie dann eine automatische Neigungskorrektur durch, indem Sie die Neigung anhand des Codes berechnen und die Neigungskorrektur anwenden. Führen Sie als Nächstes die Streichentfernung und die Berechnung des Rotationszentrums durch. Führen Sie dann eine volumetrische Rekonstruktion durch, und zeigen Sie die Daten an.
Speichern Sie die Daten im Projektnummernordner mit dem Namen Freigegeben. Schalten Sie dann die Amira-Software auf dem Facility Analysis-Server ein, laden Sie die rekonstruierten Slices in die Software und fahren Sie mit der Visualisierung, weiteren Filterung und Analyse fort. Eine speziell entwickelte Schnittstelle wurde entwickelt, um dieses experimentelle Protokoll zu steuern und menschliche Fehler zu minimieren.
Die Schnittstelle durchläuft logisch die notwendigen Schritte vor der Messung einer Probe. Die Neutronen-Computertomographie (NCT) des Oberschenkelknochens einer Ratte mit einem Titanimplantat wird hier gezeigt. Die auf Falschfarbendämpfung basierende NCT des Femurs und ein diagonaler Schnitt durch den Knochen, um das Implantat freizulegen, wurden erhalten.
Das Implantat interagiert nicht so stark mit Neutronen wie das Knochenmaterial, so dass seine Dämpfung minimal ist und es dunkler erscheint als der umgebende Knochen. Der trabekuläre Knochen, der sich im Markraum des Femurs befindet, ist am proximalen Ende der Probe deutlich sichtbar. Die Fähigkeit von Neutronen, Weichteilproben zu detektieren, wurde an einer ethanolfixierten Mauslunge demonstriert.
Das rekonstruierte Volumen der Lunge wurde aus NCT gewonnen. Ein Schnitt durch den rechten Lungenlappen ist hier dargestellt. Die volumetrische Falschfarbenwiedergabe eines Pflanzenwurzel- und Bodensystems in einem rechteckigen Aluminiumbehälter wurde ebenfalls erhalten.
Trotz eines schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses ist das Wurzelsystem im Boden in vertikalen Schnitten der Probe deutlich sichtbar. Es ist wichtig, die Pixelgröße zu bewerten, damit die aufgenommenen Bilder auf die physischen Abmessungen übertragen werden können. Die Qualität der 3D-Volumenrekonstruktion hängt von einer guten Abtastung nach dem Nyquist-Theorem ab.
Fortgeschrittenere Neutronenbildgebungsverfahren, wie z. B. die Neutronenbewertungsinterferometrie, können nach einem ähnlichen Verfahren durchgeführt werden. Diese neuartigen Methoden würden Fragen beantworten, wie zum Beispiel die dreidimensionale Verteilung der Nanoporosität in porösen Materialien. Neutronenröntgen und Computertomographie haben eine breite wissenschaftliche Wirkung.
Diese Techniken dienen der Anwendung und dem Verständnis von Batterien und ihrem Ausfallmechanismus. Fortschrittliches Materialverhalten wie 3D-gedruckte Materialien, Archäologie, Biologie und bessere Lokalisierung von Tumoren.
Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Neutronenradiographie und die Computertomographie biologischer Proben mithilfe der Strahllinie CG-1D am Hochfluss-Isotopenreaktor (HFIR). Das Verfahren zielt darauf ab, detaillierte dreidimensionale Karten des Wasserstoff- und Wassergehalts in Geweben und Bodensystemen bereitzustellen, wobei speziell ein metallisches Implantat im Femur einer Ratte, eine Mauslunge sowie ein Wurzel-Boden-System einer krautigen Pflanze untersucht werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Bildgebende Verfahren in der biologischen Forschung
- Nicht-destruktive Analyse biologischer Proben
- Beurteilung von Metallimplantaten in biologischen Kontexten
Hintergrund
- Mit der Neutronenradiographie und der Computertomographie können entscheidende Informationen über wasserstoffsensitive Proben gewonnen werden.
- Diese Bildgebungstechnik ist in Bereichen wie der Energiewerkstoffforschung, der Materialwissenschaft und der Umweltforschung anwendbar.
- Wichtig zur Bestimmung von Aspekten wie Tumarrändern in intakten Tumorproben.
Verwendete Methoden
- Neutronen-Radiographie und Computertomographie
- Zu den biologischen Proben gehören Femuren von Nagetieren, Lungen und Pflanzenwurzeln
- Verwendung der APEX Imaging-Schnittstelle zur Datenaufnahme und -analyse
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung des Wasserstoffgehalts in biologischen Geweben
- Erzeugung dreidimensionaler Bilder zur Beurteilung des Wassergehalts in Pflanzensystemen
- Technologische Fortschritte ermöglichen genaue Messungen biologischer Strukturen
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Wirksamkeit von Neutronenabbildungstechniken für biologische Anwendungen.
- Die Ergebnisse sind für verschiedene Bereiche der Biologie und der Werkstoffkunde von Bedeutung.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Die Neutronenradiographie und die Computertomographie ermöglichen eine zerstörungsfreie, dreidimensionale Abbildung des Wasserstoff- und Wassergehalts in biologischen Systemen und erlauben dadurch eine detaillierte strukturelle Analyse, ohne die Probe zu verändern. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase, indem sie die Gewebearchitektur, die Integration von Implantaten und die Fluiddynamik in physiologisch relevanten Kontexten sichtbar macht. Die Methode verbindet Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem sie quantitative, reproduzierbare Daten für Go/No-Go-Entscheidungen bei der Identifizierung von Leitstrukturen und der Auswahl präklinischer Kandidaten liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung wasserreicher biologischer Strukturen wie Weichgewebe und Knochenmark.
- Operativer Wert: Unterstützt die Aufklärung von Wegen, indem Wasserfluss und Nährstoffverteilung in Wurzel-Boden-Systemen als krankheitsrelevante Modelle nichtinvasiv abgebildet werden.
- Prädiktiver Wert: Steigert die Zielgenauigkeit, indem Implantat-Gewebe-Wechselwirkungen und strukturelle Integrität in exzidiertem Gewebe nachgewiesen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem strukturelle und zusammensetzungsbasierte Basisdaten bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch automatisierte Datenaufnahme über die APEX-Bildgebungs-Schnittstelle und Nyquist-basierte Abtastprotokolle.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Wiederverwendung der Plattform für verschiedene Probenarten, darunter Femora von Nagetieren, Lungen und krautige Pflanzensysteme.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Visualisierung der trabekulären Knochenstruktur und von Weichgewebeproben in exzidierten Nagetiermodellen.
- Präklinische Abstimmung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine longitudinale, nicht destruktive Überwachung struktureller Veränderungen ermöglicht wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Fortschrittsentscheidungen, indem strukturelle Parameter wie Implantatpositionierung und Gewebedichte quantifiziert werden, ohne dass histologische Schnitte erforderlich sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung über die Wirkstoffidentifizierung bis hin zur präklinischen Forschung und unterstützt Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen sowie die biologische Risikominderung durch nichtdestruktive strukturelle Phänotypisierung.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode das Hypothesentesten und die Aufklärung von Wegen durch die Visualisierung der Wasserstoffverteilung in biologischen Systemen unter physiologischen oder fixierten Bedingungen unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Probeneinlagerung, Detektorkalibrierung und automatisierte Radiografensammlung mittels der APEX-Schnittstelle.
- Analytik: Hebt quantitative Ergebnisse hervor, wie beispielsweise dämpfungs-basierte Rekonstruktionen, Kalibrierung der Pixelgröße und volumetrische Daten, die Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die strukturelle Beurteilung von exzidiertem Gewebe und die Integration von Implantaten ermöglicht, was für Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen Gerät und Gewebe relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbares Verfahren über verschiedene Projekte hinweg dar, bedingt durch ihre Anwendbarkeit auf unterschiedliche biologische Systeme und ihre zerstörungsfreie Natur.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei Struktur-Funktions-Beziehungen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Probenarten und Bildgebungssitzungen hinweg.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige strukturelle Risikominimierung.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantitativen, nicht-destruktiven strukturellen Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Neutronenbildphysik, Strahllinienbetrieb und computergestützten Rekonstruktion.
- Notwendige Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Zugang zu einer Neutronenquelle mit hoher Flussdichte, Szintillationsdetektoren und Software zur 3D-Visualisierung wie Imaris und Amira.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Probenvorbereitung, Ausrichtungsprotokollen und Datenanalyse-Pipelines.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich Anpassungen für Probendichte, -größe und Variabilität des Wasserstoffgehalts.
- Praktische Einschränkungen, einschließlich Strahlenschutzvorschriften, die eine therapeutische oder diagnostische Anwendung ausschließen, sowie die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von Strahlzeit an spezialisierten Einrichtungen.
