In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Forschern ermöglicht, gleichzeitig die tumorsuppressiven Funktionen von Hunderten von Genen bei Kopf- und Halskrebs zu einem Bruchteil der Kosten eines herkömmlichen Knockout-Mausmodells zu untersuchen. Diese Technik ist flexibel und kann angepasst werden, um die Expression von Genen abzudecken, um ihre Funktion in der Haut zu untersuchen. Das zielgerichtete CRISPR-Bibliotheksprotokoll kann auch auf andere Krebsarten angewendet werden.

Legen Sie das anästhesierte Tier mit der Bauchseite nach oben auf die beheizte Operationsbühne und halten Sie die Pfoten mit chirurgischem Klebeband an Ort und Stelle. Legen Sie den Nasenkonus-Anästhesieschlauch an, um eine konstante Versorgung mit Isofluran und Sauerstoff zu gewährleisten, bis die Operation abgeschlossen ist. Um eine E9,5-Schwangerschaft zu bestätigen, tragen Sie eine kleine Menge Haarentfernungscreme auf den Bauch auf und verteilen Sie sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze auf eine drei mal drei Zentimeter große quadratische Fläche.

Entfernen Sie die Creme nach zwei bis drei Minuten vorsichtig mit Gaze oder Taschentuch und wischen Sie die Stelle mit PBS und 70 % Ethanol sauber. Kontrollieren Sie die trächtige Maus mit der Ultraschallsonde und dem Gel auf den Embryonaltag E9.5. Dies kann auch am Vortag bei E8.5 erfolgen, um am Tag der Operation Zeit zu sparen.

Entfernen Sie das Ultraschallgel und wischen Sie den Bereich mit BPS und dann 70% Ethanol sauber. Injizieren Sie am häufigsten subkutanes Analgetikum. Dann sterilisieren Sie Pinzetten und Scheren, um einen vertikalen Schnitt in die Haut zu machen.

Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Haut um den Schnitt herum vom Bauchfell zu trennen. Dann sterilisieren Sie Pinzette und Schere, um das Bauchfell zu durchtrennen. Ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig das linke und rechte Gebärmutterhorn heraus und zählen Sie die Embryonen.

Setzen Sie die meisten Gebärmutterhörner wieder ein, aber lassen Sie das distale Ende eines Gebärmutterhorns mit drei Embryonen frei. Schieben und ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die Gebärmutter mit den drei Embryonen durch die Öffnung in der Silikonmembran der modifizierten Petrischale. Stabilisieren Sie die Petrischale mit Würfeln aus Modelliermasse.

Stabilisieren Sie die Gebärmutter mit den drei Embryonen in der Petrischale mit einer Silikonform. Dann drücken Sie den Silikonstopfen an der Seite der Embryonen mit einem stumpfen Werkzeug flach. Füllen Sie die Petrischale mit sterilem PBS und spülen Sie die Silikonmembran am Boden der Petrischale mit dem Bauch der trächtigen Hündin aus, um ein Auslaufen zu verhindern.

Schieben Sie den Ultraschallkopf in die Petrischale, etwa 0,5 Zentimeter über dem oberen Embryo, und stellen Sie den Tisch so ein, dass die Fruchthöhle in der Ultraschallansicht deutlich sichtbar ist. Richten Sie die Injektornadel vorsichtig in die modifizierte Petrischale ein. Platzieren Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Nadel innerhalb von fünf Millimetern um den oberen Embryo und drehen Sie die Nadel hin und her, um sich in die Ebene zu bewegen, in der ihre Spitze auf dem Ultraschallbild am hellsten erscheint.

Schieben Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator durch die Gebärmutterwand in die Fruchthöhle. Injizieren Sie 62 Nanoliter des Lentivirus mit der sgRNA-Bibliothek bei langsamer Injektionsgeschwindigkeit. Drücken Sie die Injizieren-Taste achtmal, um insgesamt 496 Nanoliter pro Embryo zu erhalten.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die beiden anderen Embryonen. Heben Sie dann den Ultraschallkopf an und entfernen Sie den Silikonstopfen. Schieben Sie die ersten beiden der drei Embryonen vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in den Bauch der Maus.

Ziehen Sie die nächsten drei Embryonen heraus und schieben Sie den zuvor injizierten dritten Embryo hinein. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert wurde, und achten Sie darauf, dass die Anästhesie 30 Minuten nicht überschreitet. Wenn Sie fertig sind, heben Sie den Ultraschallkopf an, entfernen Sie den Mikromanipulator mit der Nadel, saugen Sie das PBS an und entfernen Sie die Petrischale.

Absorbieren Sie mit sterilen Tüchern PBS, das sich möglicherweise in der Bauchhöhle angesammelt hat. Verschließen Sie den Peritonealschnitt mit resorbierbaren Nähten. Verwenden Sie dann zwei Klammern, um den Schnitt in der Bauchhaut zu schließen.

Als nächstes sollten Generation-Sequencing-Reads von PCR-amplifizierter DNA aus Plasmid- und lentiviralen Zellen, die mit der Bibliothek transduziert wurden, eine hohe Korrelation aufweisen. Wenn die sgRNA-Reads aus der Plasmid-DNA keine gleiche Repräsentation der sgRNAs aufweisen, muss das Verfahren zur Präparation und Konzentration des Virus mit Vorsicht wiederholt werden. Die Ergebnisse der ultraschallgesteuerten Injektion von Lentivirus-tragender Cre-Rekombinase in E9.5 Lox-STOP-Lox-Konfetti-Mausbabys am postnatalen Tag P0 sind hier dargestellt.

Während ein hoher Titer des Virus zu einer größeren Bedeckung der Haut der Maus führen würde, würde er auch zu einer Transduktion mehrerer sgRNAs in dieselbe Zelle führen. Dieses Diagramm zeigt Next-Generation-Sequencing-Reads von PCR-amplifizierter DNA aus Plasmid- und lentiviralen Bibliothekstransduzierzellen sowie Reads von vier repräsentativen Tumoren. sgRNA-Leitfäden, die auf die Tumorsuppressoren ADAM10 und RIPK4 abzielen, sind in den Tumorproben im Vergleich zum Plasmidpool oder infizierten Zellen angereichert.

Die Durchführung der Operation bei E9.5 ist von entscheidender Bedeutung. Denken Sie daran, neun Tage nach dem Aufstellen des Kreuzes mit Ultraschall nach einer Schwangerschaft zu suchen und den embryonalen Zeitpunkt bei jeder weiblichen Maus zu identifizieren. Sobald die Welpen geboren sind, können die transduzierten Zellen isoliert und mit den neuesten Genprofilierungstechniken wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung umfassend profiliert werden.