Name: In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Lernen Sie die ultraschallgestützte in vivo CRISPR/Cas9-Screening-Methode zur gleichzeitigen Bewertung von Genfunktionen in Maushaut und Oralhöhle. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung hunderter Tumorsuppressorgene bei Kopf-Hals-Tumoren.

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Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), der Krembil Foundation und des Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065) unterstützt. Sampath Kumar Loganathan ist Träger eines Stipendiums der Canadian Cancer Society (BC-F-16-31919).

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde in In-vitro- und In-vivo-Studien häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und zellulären Prozessen eingesetzt. Die meisten In-vivo-Studien verwenden CRISPR/Cas9-Gen-editierte Zellen, die in ein Tiermodell (Allograft oder Xenograft) eingepfropft wurden. Während dies ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Krebsgenetik und zelluläre Funktionen zu studieren, fehlt es immer noch an der einheimischen Gewebemikroumgebung und könnte Wund- und/oder Immunreaktionen hervorrufen.
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Eine der Herausforderungen für die Krebsforschung in der postgenomischen Ära besteht darin, die riesige Menge an Genomdaten für kausale Genmutationen zu abbauen und Knoten im Gennetzwerk zu identifizieren, die therapeutisch anvisiert werden können. Während bioinformatische Analysen enorm dazu beigetragen haben, diese Ziele zu erreichen, ist die Etablierung effizienter In-vitro- und In-vivo-Modelle eine Voraussetzung, um die Komplexität biologischer Systeme und Krankheitszustände zu entschlüsseln und die Entwicklung von Arzneimitteln zu ermöglichen. Während herkömmliche transgene Mausmodelle ausgiebig für in vivo Krebsgenetik-Studien verwendet wurden, hat ihre kosten-, zeit- und arbeitsintensive Natur die systematische Analyse der Hunderte von vermeintlichen Krebsgenen, die durch die moderne Genomik entwirrt wurden, weitgehend verboten. Um diesen Engpass zu überwinden, kombinierten wir eine zuvor etablierte Ultraschall-geführte in der Utero-Injektionsmethodik1,2 mit einer CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Gen-Editing-Technologie3, um gleichzeitig Funktionsverlustmutationen von Hunderten von Genen in Haut und Mundhöhle einer einzelnen Maus zu induzieren und zu untersuchen.
Die hier beschriebene Methodik nutzt Ultraschall-geführte Injektionen von technisch hergestellten Lentiviren in die Fruchtwasserhöhle lebender Mausembryonen am Embryonaltag E9.5. Die lentivirale Ladung, die CRISPR/Cas9-Komponenten enthält, transduciert das einschichtige Oberflächenektoderm, das später das Epithel der Haut und der Mundhöhle hervorruft. Die Haut besteht aus einer äußeren Epidermis, gefolgt von Kellermembran und Dermis. Epidermis ist ein geschichtetes Epithel, das aus einer inneren Basalschicht besteht, die den Kontakt mit der Kellermembran aufrechterhält und eine proliferative und Stammzellkapazität hat. Die Basalschicht führt zu den differenzierten Schichten oben wie z.B. stachelförmigen, körnigen und stratum corneum Schichten2,4. Lineage-Tracing-Studien zeigen, dass diese direkte in vivo CRISPR/Cas9-Methode geweberesidente Stammzellen innerhalb der Basalschicht genetisch manipuliert, die während des gesamten Erwachsenenalters fortbestehen. Da lentivirus titriert werden kann, um das E9.5-Oberflächenektoderm bei klonaler Dichte zu transduzieren, kann diese Methode verwendet werden, um Mosaikmäuse zu erzeugen, die Tausende von diskreten Gen-Knock-out-Klonen beherbergen. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann dann verwendet werden, um die Wirkung der CRISPR/Cas9-vermittelten Genablation innerhalb dieser Klone in multiplexisierter Weise zu analysieren5.
Wir haben diese Methode vor kurzem verwendet, um die Funktion von 484 Genen zu bewerten, die wiederkehrende Mutationen im menschlichen Kopf- und Hals-Squamous-Zell-Karzinom (HNSCC)5zeigen. HNSCC ist eine verheerende Krebserkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate von 40–50% und sie ist die6. häufigste Krebsart weltweit6. HNSCC entstehen in Schleimhautauskleidungen der oberen Atemwege oder Mundhöhle und sind mit Tabak- und Alkoholkonsum oder einer Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) in Verbindung gebracht. Kutanes Plattenepithelkarzinom (SCC) sind Hauttumoren und stellen die zweithäufigste Krebsart beim Menschendar 7. Kutane SCC und HNSCC sind histologisch und molekular sehr ähnlich, mit einem hohen Prozentsatz von Fällen, die Veränderungen in TP53, PIK3CA, NOTCH1 und HRAS8aufweisen. Während es nur eine Handvoll Gene gibt, die mit hoher Frequenz mutiert sind, gibt es Hunderte von Genen, die mit niedriger Frequenz mutiert sind (< 5%), ein Phänomen, das gemeinhin als Long-tail-Verteilung bezeichnet wird. Da die Mehrheit der Longtail-Gene keine biologische oder klinische Validierung haben, haben wir diese in vivo CRISPR-Screening-Technologie verwendet, um Funktionsverlust dieser Gene bei tumorgefährdeten Mäusen mit sensibilisierenden Mutationen in p53, Pik3ca oder Hras zu modellieren und identifizierten mehrere neuartige Tumorsuppressorgene, die mit p53, Pik3ca oder Hras zusammenarbeiten, um die Tumorentwicklung auszulösen5.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA Bibliotheken und führen CRISPR/Cas9 Gen Knock-out-Screens in der MausOberfläche Ektoderm. Bemerkenswert ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um andere Genmanipulationstechnologien wie CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) und CRISPR-Inaktivierung (CRISPRi) zu integrieren oder modifiziert werden, um andere Organsysteme in der Maus zu zielen, um Genfunktionen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,45 Mikron Filter</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k oder 92k</td><td>Oligo Chip Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm Zellkulturplatten</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Amplicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Chromische Darmnaht</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiefensequenzierung (Next-Seq oder Hi-Seq)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy Blut und Gewebe DNA-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Endura elektrokompetente Zellen</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Wisent Technologies</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Prep Plasmid Kit</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>Maus Sauerstoffanästhesiesystem</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Mikromanipulator</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 ( Puffer für BsmBI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Nadelschärfer</td><td>Sutter Instrument</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Cleanup Kit</td><td>Zymo research</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE gereinigte illumina Sequenzierungsgrundierung</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI (Polyethylenimin)</td><td>Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Permoplast Modelliermasse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale mit zentraler Öffnung</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polymerase 2x Mastermix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometrische Quantifizierung</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>Halbkreisförmiger Silikonstopfen</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonmembran</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2000 Ultraschallsystem</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo crispr/cas9 screening zur gleichzeitigen bewertung der genfunktion in maushaut und oralhöhle

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) waren maßgeblich an der Beurteilung der Genfunktion, der Modellierung menschlicher Krankheiten und als präklinisches Modell zur Bewertung therapeutischer Wege beteiligt. Ihre zeit-, arbeits- und kostenintensive Natur schränkt jedoch ihren Nutzen für die systematische Analyse der Genfunktion ein. Jüngste Fortschritte in den Genom-Editing-Technologien überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen die schnelle Generierung spezifischer Genstörungen direkt in bestimmten Mausorganen in multiplexierter und schneller Weise. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9-basierte Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um Tausende von Gen-Knock-out-Klonen innerhalb des Epithels der Haut und der Mundhöhle von Mäusen zu erzeugen, und liefern ein Protokoll, das die Schritte beschreibt, die notwendig sind, um einen direkten in vivo   CRISPR-Bildschirm für Tumorsuppressorgene durchzuführen. Dieser Ansatz kann auf andere Organe oder andere CRISPR/Cas9-Technologien wie CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Inaktivierung angewendet werden, um die biologische Funktion von Genen während der Gewebehomöostase oder in verschiedenen Krankheitssituationen zu untersuchen.

Abbildung 1A zeigt das Design der Oligonukleotide zum Multiplexieren mehrerer benutzerdefinierter CRISPR-Bibliotheken auf kostengünstige Weise in einem einzigen 12k- oder 92k-Oligochip. Sobald die sgRNAs (blaue Farbe kodiert) ausgewählt sind, werden die Oligonukleotide mit Restriktionsstellen (orange farbene BsmBI) und bibliotheksspezifischen PCR-Primer-Paaren (grüne Farbe codiert) entworfen. Mehrere Bibliotheken können mit einer einzigartigen Kombination von Primerpaaren für Multiplexing in...

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Forschern ermöglicht, gleichzeitig die tumorsuppressiven Funktionen von Hunderten von Genen bei Kopf- und Halskrebs zu einem Bruchteil der Kosten eines herkömmlichen Knockout-Mausmodells zu untersuchen. Diese Technik ist flexibel und kann angepasst werden, um die Expression von Genen abzudecken, um ihre Funktion in der Haut zu untersuchen. Das zielgerichtete CRISPR-Bibliotheksprotokoll kann auch auf andere Krebsarten angewendet werden.Legen Sie das anästhesierte Tier mit der Bauchseite nach oben auf die beheizte Operationsbühne und halten Sie die Pfoten mit chirurgischem Klebeband an Ort und Stelle. Legen Sie den Nasenkonus-Anästhesieschlauch an, um eine konstante Versorgung mit Isofluran und Sauerstoff zu gewährleisten, bis die Operation abgeschlossen ist. Um eine E9,5-Schwangerschaft zu bestätigen, tragen Sie eine kleine Menge Haarentfernungscreme auf den Bauch auf und verteilen Sie sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze auf eine drei mal drei Zentimeter große quadratische Fläche.Entfernen Sie die Creme nach zwei bis drei Minuten vorsichtig mit Gaze oder Taschentuch und wischen Sie die Stelle mit PBS und 70 % Ethanol sauber. Kontrollieren Sie die trächtige Maus mit der Ultraschallsonde und dem Gel auf den Embryonaltag E9.5. Dies kann auch am Vortag bei E8.5 erfolgen, um am Tag der Operation Zeit zu sparen.Entfernen Sie das Ultraschallgel und wischen Sie den Bereich mit BPS und dann 70% Ethanol sauber. Injizieren Sie am häufigsten subkutanes Analgetikum. Dann sterilisieren Sie Pinzetten und Scheren, um einen vertikalen Schnitt in die Haut zu machen.Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Haut um den Schnitt herum vom Bauchfell zu trennen. Dann sterilisieren Sie Pinzette und Schere, um das Bauchfell zu durchtrennen. Ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig das linke und rechte Gebärmutterhorn heraus und zählen Sie die Embryonen.Setzen Sie die meisten Gebärmutterhörner wieder ein, aber lassen Sie das distale Ende eines Gebärmutterhorns mit drei Embryonen frei. Schieben und ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die Gebärmutter mit den drei Embryonen durch die Öffnung in der Silikonmembran der modifizierten Petrischale. Stabilisieren Sie die Petrischale mit Würfeln aus Modelliermasse.Stabilisieren Sie die Gebärmutter mit den drei Embryonen in der Petrischale mit einer Silikonform. Dann drücken Sie den Silikonstopfen an der Seite der Embryonen mit einem stumpfen Werkzeug flach. Füllen Sie die Petrischale mit sterilem PBS und spülen Sie die Silikonmembran am Boden der Petrischale mit dem Bauch der trächtigen Hündin aus, um ein Auslaufen zu verhindern.Schieben Sie den Ultraschallkopf in die Petrischale, etwa 0,5 Zentimeter über dem oberen Embryo, und stellen Sie den Tisch so ein, dass die Fruchthöhle in der Ultraschallansicht deutlich sichtbar ist. Richten Sie die Injektornadel vorsichtig in die modifizierte Petrischale ein. Platzieren Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Nadel innerhalb von fünf Millimetern um den oberen Embryo und drehen Sie die Nadel hin und her, um sich in die Ebene zu bewegen, in der ihre Spitze auf dem Ultraschallbild am hellsten erscheint.Schieben Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator durch die Gebärmutterwand in die Fruchthöhle. Injizieren Sie 62 Nanoliter des Lentivirus mit der sgRNA-Bibliothek bei langsamer Injektionsgeschwindigkeit. Drücken Sie die Injizieren-Taste achtmal, um insgesamt 496 Nanoliter pro Embryo zu erhalten.Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die beiden anderen Embryonen. Heben Sie dann den Ultraschallkopf an und entfernen Sie den Silikonstopfen. Schieben Sie die ersten beiden der drei Embryonen vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in den Bauch der Maus.Ziehen Sie die nächsten drei Embryonen heraus und schieben Sie den zuvor injizierten dritten Embryo hinein. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert wurde, und achten Sie darauf, dass die Anästhesie 30 Minuten nicht überschreitet. Wenn Sie fertig sind, heben Sie den Ultraschallkopf an, entfernen Sie den Mikromanipulator mit der Nadel, saugen Sie das PBS an und entfernen Sie die Petrischale.Absorbieren Sie mit sterilen Tüchern PBS, das sich möglicherweise in der Bauchhöhle angesammelt hat. Verschließen Sie den Peritonealschnitt mit resorbierbaren Nähten. Verwenden Sie dann zwei Klammern, um den Schnitt in der Bauchhaut zu schließen.Als nächstes sollten Generation-Sequencing-Reads von PCR-amplifizierter DNA aus Plasmid- und lentiviralen Zellen, die mit der Bibliothek transduziert wurden, eine hohe Korrelation aufweisen. Wenn die sgRNA-Reads aus der Plasmid-DNA keine gleiche Repräsentation der sgRNAs aufweisen, muss das Verfahren zur Präparation und Konzentration des Virus mit Vorsicht wiederholt werden. Die Ergebnisse der ultraschallgesteuerten Injektion von Lentivirus-tragender Cre-Rekombinase in E9.5 Lox-STOP-Lox-Konfetti-Mausbabys am postnatalen Tag P0 sind hier dargestellt.Während ein hoher Titer des Virus zu einer größeren Bedeckung der Haut der Maus führen würde, würde er auch zu einer Transduktion mehrerer sgRNAs in dieselbe Zelle führen. Dieses Diagramm zeigt Next-Generation-Sequencing-Reads von PCR-amplifizierter DNA aus Plasmid- und lentiviralen Bibliothekstransduzierzellen sowie Reads von vier repräsentativen Tumoren. sgRNA-Leitfäden, die auf die Tumorsuppressoren ADAM10 und RIPK4 abzielen, sind in den Tumorproben im Vergleich zum Plasmidpool oder infizierten Zellen angereichert.Die Durchführung der Operation bei E9.5 ist von entscheidender Bedeutung. Denken Sie daran, neun Tage nach dem Aufstellen des Kreuzes mit Ultraschall nach einer Schwangerschaft zu suchen und den embryonalen Zeitpunkt bei jeder weiblichen Maus zu identifizieren. Sobald die Welpen geboren sind, können die transduzierten Zellen isoliert und mit den neuesten Genprofilierungstechniken wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung umfassend profiliert werden.

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Forschung

JoVE Journal

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Genetik

Dieses Video beschreibt eine Screening-Methode zur Identifizierung transgener Drosophila-Fliegen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 modifiziert wurde. CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editing-Tool, das die Art und Weise, wie Wissenschaftler das Genom eines Organismus manipulieren können, revolutioniert hat. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie CRISPR-generierte Mutanten identifiziert werden können, bei denen eine Insertion einer Transaktivierungssequenz das erste Exon des...

Screening auf genomische Modifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.

Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Die direkte Lieferung von vormontierten Cas9/Guide-RNA-Ribonukleoprotein-Komplexen ist ein schnelles und effizientes Mittel zur Genombearbeitung in hämatopoetischen Zellen. Hier nutzen wir diesen Ansatz, um einen RUNX1 intronic Schalldämpfer zu löschen und die Transkriptionsreaktionen in OCI-AML3-Leukämischen Zellen zu untersuchen.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

Dieses Manuskript beschreibt einen zellbasierten Screening-Ansatz im Genommaßstab zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.

Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Es wird ein akribischer und strukturierter Ansatz verfolgt, um resistente und empfindliche Strahlengene durch die Anwendung einer genomweiten CRISPR/Cas9-Screening-Methode auszuwählen. Dieses Protokoll hat auch das Potenzial, als vielseitiger Rahmen für andere Forschungsvorhaben zu dienen, die die Mechanismen der Resistenz gegen klinisch verabreichte chemische Arzneimittel untersuchen.

Genomweiter CRISPR-Screen zur Entschlüsselung strahlenempfindlicher und strahlenresistenter Gene

Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

Lernen Sie die ultraschallgestützte in vivo CRISPR/Cas9-Screening-Methode zur gleichzeitigen Bewertung von Genfunktionen in Maushaut und Oralhöhle. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung hunderter Tumorsuppressorgene bei Kopf-Hals-Tumoren.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

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