Name: Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Methodik der Trockenwurzelfäule-Assays in Kichererbsen mit Blotting-Paper- und Sick-Pot-Technik. Diese reproduzierbaren Verfahren ermöglichen die Untersuchung von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen mit Rhizoctonia bataticola.

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Projekte im M.S.K-Labor werden vom National Institute of Plant Genome Research unterstützt. VI erkennt DBT- JRF an (DBT/2015/NIPGR/430). Wir danken Den Auszubildenden, Miss. Rishika, Mr. Jayachendrayan und Miss. Durgadevi für die technische Hilfe bei Videoaufnahmen und Herrn Sandeep Dixit, Miss. Anjali und Dr. Avanish Rai für die kritische Bewertung von Rohdaten und den Manuskriptakten. Wir danken Herrn Rahim H Tarafdar und Herrn Sunder Solanki für ihre Hilfe im Labor. Wir würdigen das DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) und die NIPGR Library für den Zugang zu e-Ressourcen und der NIPGR Plant Growth Facility für die Unterstützung/Raum für das Pflanzenwachstum.

1. Isolierung von R. bataticola und Lagerung
<ol><li>Details zum Kichererbsengenotyp und DRR-Symptomen<ol>
<li>Verwenden Sie Kichererbsenpflanzen (Genotyp, JG 62), die in der Regel typische DRR-Symptome zeigen, wie trockene, spröde Primärwurzel ohne laterale Wurzeln und Mikrosklerotie unter der Rinde und innerhalb der Pith1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abholung und Waschen<ol>
<li>Entwurzelung stagnieren Pflanzen, die Symptome wie trockene strohfarbene Blattblätter und spröde Primärwurzel mit Mikrosklerotie unter der Epidermisschicht zeigen. Während der Entwurzelung wird ein großteil der Wurzeln im Boden bleiben, da die infizierten Wurzeln spröde sind. Entfernen Sie die groben Bodenablagerungen, die an der Wurzel befestigt sind. Schneiden Sie die Wurzeln separat und sammeln Sie sie in Papierumschlägen (27,5 cm x 12 cm) mit dem richtigen Etikett und legen Sie sie in eine Probensammelbox.</li>
		<li>Nach dem Transport von Proben ins Labor, legen Sie die Wurzeln in einem 200 ml Becher und Decken mit Mesh (Nylon-Mesh mit der Porengröße von 3 mm Durchmesser), und waschen Sie die Wurzeln gründlich mit fließendem Leitungswasser, um ankende Bodenpartikel zu entfernen.</li>
		<li>Verwenden Sie Umkehrosmose (RO) Wasser, um einmal am Ende zu spülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oberflächensterilisation<ol>
<li>Die Wurzeln mit jeweils 2 cm Länge mit einer Skalpellklinge in vier Stücke brechen und in einen sauberen 200 ml Becher geben.</li>
		<li>Montieren Sie autoklaviertes RO-Wasser, 2% NaOCl, Auswurfglas und autoklaviertes Blottingpapier (5 cm2) in der laminaren Durchflusskammer.</li>
		<li>Waschen Sie die Wurzeln mit 50 ml autoklaviertem RO-Wasser dreimal und dann mit 50 ml von 2% NaOCl für 10 min. Waschen Sie die Wurzeln mit 50 ml RO-Wasser dreimal wieder, um den NaOCl zu entfernen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Wurzeln, indem Sie die Wurzeln auf autoklaviertes Blottingpapier legen und lassen Sie, bis die Wurzeln getrocknet sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medien und Inkubation<ol>
<li>Entfernen Sie die Ränder der Wurzeln mit einer sterilisierten Skalpellklinge. Teilen Sie die Wurzeln mit der Klinge und verwenden Sie die sterilisierten Zangen, um sie auf einer Kartoffel dextrose Agar (PDA) Medien Petriplatte mit Streptomycinsulfat (50 mg L-1) und Ampicillin (50 mg L-1) zu platzieren.</li>
		<li>Schließen Sie die Platte, versiegeln Sie sie mit Parafilm und brüten Sie in einem Inkubator bei 28 °C für zwei Tage im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hyphal-Tipp-Methode<ol>
<li>Nach zwei Tagen Inkubation die Platten in die laminare Strömungskammer bringen. Schneiden Sie die Spitze des Hyphalwachstums8 unter einem Stereomikroskop (Leica EZ4 pädagogisches Stereomikroskop) und übertragen Sie sie in eine frische PDA-Platte mit Streptomycinsulfat und Ampicillin.</li>
		<li>Die Platten im Inkubator bei 28 °C zehn Tage lang im Dunkeln bebrüten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lagerung und Wartung von R. bataticola pilzinoculum<ol>
<li>Machen Sie PDA-Schräglagen in Reagenzgläsern und übertragen Sie einen Pilzagar-Stecker von einer zehn Tage alten Kulturplatte mit der flammsterilisierten Impfschleife. Versiegeln Sie die Reagenzglaskappe mit Parafilm.</li>
		<li>Die Schrägen bei 28 °C zehn Tage lang im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Kappe erneut mit Parafilm und lagern Sie sie bei 4 °C im Kühlschrank für die zukünftige Verwendung.</li>
		<li>Subkultur alle sechs Monate, um den Pilz zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufrechterhaltung der Virulenz<ol>
<li>Infizieren Sie die Pflanzen mit reinem Pilzinokulum, wie in derKrankentopftechnik3 erwähnt. Isolieren Sie den gleichen Pilz von den infizierten Pflanzen (Kochs Postulate)9 und verwenden Sie für weitere Experimente. HINWEIS: In dieser Studie wurde ein feldisolierter Pilzstamm verwendet (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Blotting Papiertechnik
HINWEIS: Die Blotting-Papier-Technik beinhaltet die Herstellung von flüssigem Pilzinokulum, Sämlingsvorbereitung und Krankheitsbeurteilung.
<ol><li>Zubereitung von flüssigem R. bataticola inoculum HINWEIS: Flüssiges R. bataticola Pilzinokulum enthält sowohl Mycelia als auch Mikrosklerotie. Beide Strukturen fungieren als primäres Inokulum.<ol>
<li>Bereiten Sie 500 ml PDB-Medien in einem 1.000 ml Kolben vor und autoklavieren Sie es bei 121 lbs für 15 min.</li>
		<li>Nachdem die Medien abgekühlt sind, impfen Sie die Brühe mit einer Schleife von Pilz-Agar-Stecker aus einer Pilzschrägenkultur und bebrüten bei 28 °C für fünf Tage in einem Shaker bei 180 U/min im Dunkeln.</li>
		<li>Montieren Sie einen autoklavierten Glas- oder Kunststofftrichter (10 cm), einen Einliter-Konuskolben und zwei Gewebeschichten (10 cm2 Größe) (Nylon-Mesh mit einer Porengröße von 3 mm Durchmesser) auf den Tisch. Filtern Sie die Pilzmycelia und Mikrosklerotie mit dem Netz heraus. Den Pilz in autoklaviertem Blottingpapier trocknen.</li>
		<li>100 g Mycelia für 50% Inokulum wiegen und bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zubereitung von Kichererbsenpflanzen<ol>
<li>Wählen Sie 50 gesunde Samen (in dieser Studie wurde der DRR-anfällige Genotyp JG 62 verwendet), legen Sie sie in einen 100 ml Becher und decken Sie sie mit einem Netz ab.</li>
		<li>Waschen Sie die Samen zuerst mit Leitungswasser, um Bodenschrott zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie den Becher mit Samen in die laminare Durchflusskammer und waschen Sie sie mit sterilisierten 50 ml RO-Wasser dreimal für 1 min pro Wäsche.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Samen mit 50 ml von 2% wässrigen NaOCl für 2 min mit kontinuierlichem Schütteln und waschen Sie die Samen mit 50 ml sterilisiertem Wasser fünfmal für jeweils 1 min.</li>
		<li>Füllen Sie einen Polythenbeutel (47,5 cm x 25 cm) mit Soilrite (eine Mischung aus Gartenbauqualität expandierter Perlit, Irisches Torfmoos und Peeling-Vermiculit im gleichen Verhältnis, d.h. 1/3:1/3:1/3), säen die oberflächensterilisierten 50 Samen zwei cm tief und halten in einer Wachstumskammer/Raum mit 28 °C ± 2 °C Temperatur, 16 h Photoperiode mit einer Lichtintensität von 150€mol m m und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70 % . Gießen Sie sie mit RO-Wasser und entwurzeln Sie die Pflanzen acht Tage nach der Aussaat.</li>
		<li>Waschen Sie die Wurzeln im Leitungswasser, um die Soilrite-Partikel zu entfernen. Spülen Sie die Wurzeln mit sterilisiertem RO-Wasser und halten Sie sie im RO-Wasser in einem 1000 ml Becher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Blottingpapier in Schalen<ol>
<li>Nehmen Sie ein Blotting-Papier und schneiden Sie es in Stücke (30 cm × 23 cm) in ausreichender Anzahl, um die Replikationen zu erfüllen.</li>
		<li>Verpacken Sie die Blätter in autoklavierbaren Polythenbeutel und autoklavieren Sie sie 15 Minuten lang bei 121 lbs und bewahren Sie sie zum Trocknen in einem Heißluftofen auf.</li>
		<li>Falten Sie jedes Blotting-Papierblatt in der Hälfte.</li>
		<li>Legen Sie das Papier auf eine saubere, mit Spirituosen gewischte Kunststoffschale, wie in Abbildung 2i-ivdargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pflanzenimpfung durch Tauchen<ol>
<li>Lösen Sie 100 g Pilzinokulum in 200 ml autoklaviertem RO-Wasser in einem 200 ml Becher, um 50% Inokulum zu erhalten.</li>
		<li>Tauchen Sie die Pflanzenwurzeln in das vorbereitete Inokulum für 1 min mit intermittierender Auf-und-Ab-Bewegung, um eine gleichmäßige Befestigung von Pilzinokulum zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren der Pflanzen in das Fleckpapier<ol>
<li>Befeuchten Sie die Unterseite des auf das Tablett gelegten Blotpapiers mit sterilem RO-Wasser. Legen Sie die Pflanzen auf das Papier in einer Weise, wo nur die Wurzeln durch das Papier bedeckt sind, und Triebe werden weggelassen.</li>
		<li>Schließen Sie es, indem Sie die Oberseite des Blotting-Papiers falten und das gesamte Papier nass machen, um genügend Wasser zu liefern, um das Pflanzenwachstum aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Gießen Sie das Tablett einmal täglich und halten Sie die Schalen bei 28 °C. Beobachten Sie die Symptome wie Nekrose, Wurzelfäule und Blattvergilbung täglich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kranke TopfTechnik
HINWEIS: Die Kranke TopfTechnik beinhaltet die Herstellung von virulenten Inokulum und einem kranken Topf, die Aufrechterhaltung des Feuchtigkeitsniveaus und die Bewertung von Krankheitssymptomen.
<ol><li>Herstellung von Substrat<ol>
<li>Nehmen Sie ein kg aller handelsüblichen Kichererbsensamen. Entfernen Sie infizierte Samen (Samen mit Pilzwachstum, Infektionsflecken und Insektenschäden). Legen Sie sie in 5 L KunststoffBecher und waschen Sie mit Leitungswasser gründlich 3-4 Mal, um große Schmutz zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Samen mit 2 L RO-Wasser dreimal und tränken Sie die 1 kg Samen in einem 5 L Becher mit dreifach mehr Wasser für fünf h.</li>
		<li>Sobald die Samen das Wasser imprägniert haben, waschen Sie sie dreimal mit RO-Wasser, um die Samenexsudate zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Wasser vollständig und verpacken Sie die Samen in Marmeladenflaschen (300 ml, 12 cm Höhe, 6 cm Durchmesser und 155 g Gewicht) auf ca. 1/4Th Kapazität (100 g pro Marmeladenflasche) und schließen Sie die Flaschen mit Kappen. Packen Sie zehn Marmeladenflaschen in eine autoklavierbare Plastiktüte (48 cm x 30 cm) Autoklav zweimal bei 121 lbs für 15 min kontinuierlich.</li>
		<li>Trocknen Sie die Samen bei 40 °C über Nacht im Ofen, um die Wassertröpfchen in der Flasche zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Krankenkultur<ol>
<li>Schalten Sie die Laminar-Durchflusskammer BSL-2 ein. Wischen Sie den Boden gründlich mit 70% Ethanol ab und schalten Sie UV für 15 min ein. Bewahren Sie dann die Samen in der laminaren Strömungskammer auf.</li>
		<li>Nehmen Sie die 10 Tage alte, frisch isolierte R. bataticola Kultur (Teil 1). Dann nehmen Sie drei Pilz-Agar-Stecker (4 mm Durchmesser) mit einer sterilen Pipettenspitze oder Korkbohrer, und legen Sie sie in Marmeladenflaschen aseptisch. Bedecken Sie die Flaschen mit Kappen und versiegeln Sie sie mit Parafilm.</li>
		<li>Schütteln Sie die Flaschen, um die Pilzscheibe mit den Kichererbsensamen gleichmäßig zu mischen.</li>
		<li>Die Flaschen 15 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln bebrüten.</li>
		<li>Nehmen Sie Marmeladenflaschen mit schwarzem Pilzwachstum (Abbildung 4iii) und übertragen Sie die Krankenkultur (Samen mit Mikrosklerotie) von Marmeladenflaschen auf eine glasierte Petriplatte mit steriler Zange. Trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Tage in einer Glas-Petri-Platte.</li>
		<li>Die Pilzmasse mit Mörtel und Stößel pulverisieren und bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Autoklav Soilrite zweimal bei 121 lbs für 15 min.</li>
		<li>Trocknen Sie die autoklavierte Soilrite-Mischung unter einem Sonnenschirm.</li>
		<li>Mischen Sie das Pilzpulver mit Soilrite bei 50% w/w, füllen Sie die Töpfe mit der Mischung, und halten Sie sie bei Raumtemperatur für einen Tag.</li>
		<li>Säen Sie ein oberflächensterilisiertes DRR-anfälliges Kichererbsensaatgut pro Topf (10 cm runde Töpfe)(Materialtabelle)und halten Sie einen Feuchtigkeitsgehalt von 80% Feldkapazität (FC).</li>
		<li>Beobachten Sie die Symptome wie Nekrose und Wurzelfäule, indem Sie die Pflanzen nach der Keimung entwurzeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewertung der Effizienz des Krankentopfs HINWEIS: Pflanzen zeigen gelbe Blattsymptome, wenn die Wurzeln vollständig verrottet sind.<ol>
<li>Entwickeln Sie einen Krankheitsscore basierend auf der Läsion (nekrotische Flecken) (Ergänzende Abbildung 2C) Zahlen und Schweregrad der Wurzelfäule. Kranke Töpfe mit 90% Pflanzentod können weiter verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genotyp-Screening<ol>
<li>Bereiten Sie die Krankenkultur in großen Mengen vor und mischen Sie sie entweder mit sterilisiertem Soilrit oder Felderde (5% w/w) in 30 cm hohen Töpfen. Gießen Sie die Töpfe, um die Oberfläche zu befeuchten und lassen Sie sie für sieben Tage ungestört.</li>
		<li>Säen Sie einen oberflächensterilisierten Samen pro 10 cm rundem Topf und drei Samen pro 30 cm runde Töpfe und gießen Sie sie ausreichend.</li>
		<li>Beobachten Sie die gelben Blatt- und Wurzelfäule-Symptome.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinierte Dürre und R. bataticola Infektion<ol>
<li>Beungung von Dürrestress durch Befolgung der in Sinha et al. (2019) erwähnten Protokolle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu verraten

Die Blotting-Papier-Technik bietet einen einfachen Ansatz, um Kichererbsen-Genotypen unter Laborbedingungen zu untersuchen. Die Dip-Impfung ermöglicht die untersuchung der Wechselwirkung auf zeitlicher Basis mit einfacher Kontrolle der Inokulumbelastung (Zusatzabbildung 1) und erleichtert das In-vitro-Screening. Darüber hinaus können auch junge Sämlinge verwendet werden. Fünf Tage alte Pilzkultur (Abbildung 1B) kann genug Inokulum liefern, um die Pflanzen zu infizieren. Flüs...

Trockenwurzelfäule (DRR) ist eine der wirtschaftlich signifikanten Krankheiten bei Kichererbsen1,2. Es ist eine wurzelspezifische Krankheit, die durch Rhizoctonia bataticola (Teleomorph, Macrophomina phaseolina)verursacht wird. Infizierte Pflanzen haben seitliche Wurzeln und besitzen spröde Taproots und gelbes Laub1,3. DRR unter Dürrestress wurde berichtet, eine aufkommende Bedrohung für kichererbsenanbau1,2,3. Darüber hinaus wird berichtet, dass die DRR-Inzidenz unter Dürrestress unter Feldbedingungen1,2,3verschlimmert wird. DRR ist in Regengebieten häufiger als in bewässerten Feldern4. Die Verwendung resistenter Sorten ist der Weg, um die Krankheit zu überwinden und Fungizid-Einsatz zu umgehen1,13. Da Kichererbsen-Keimplasma, das auf der ganzen Welt verfügbar ist, genetische Variationen für das Merkmal5aufweist, sind das Screening und die Identifizierung resistenter/anfälliger Genotypen für die molekulare Züchtung für die Verbesserung der Ernte von entscheidender Bedeutung.
Robuste, einfache und kostengünstige Krankheitstests sind unerlässlich, um R. bataticola Infektionsmuster in Kichererbsen zu untersuchen. Die primäre Krankheit Assay verwendet, um die Reaktion von Kichererbsen-Genotypen auf R. Bataticola-Infektion zu beobachten ist die Blotting-Papier-Technik1,4. Es ist eine einfache Technik und kann mit flüssigem Pilzinokulum, Sämlingen mit Wurzeln und sterilem Blotting-Papier ausgeführt werden. Diese Technik wurde jedoch nicht maximal verwendet, da in der Literatur kein Step-by-Step-Protokoll verfügbar ist.
In der Zwischenzeit beinhaltet die Kranke Topftechnik die Vorbereitung einer potentiellen Krankenkultur und die Auferlegung von Dürrestress. Angesichts der Tatsache, dass Dürrestress die InzidenzderDRR-Krankheit 3 verschlimmert, ist es wichtig, die Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkung unter Dürrestress zu untersuchen6,7. Die Sick-Topf-Technik bietet die Plattform für eine solche simultane Studie, fördert bessere Möglichkeiten für das Keimplasma-Screening und das Verständnis der mechanistischen Basis der Interaktion. Pathomorphologische Veränderungen wie eine Erhöhung der Wurzellänge und eine Verringerung der lateralen Wurzelzahl – inhärent für DIE DRR-Krankheit – können mit der Krankentopftechnik1,3,7angegangen werden.
Hierin wird ein detailliertes Protokoll zum Blotting von Papier und Krankentopftechniken vorgestellt, mit dem die Wechselwirkung zwischen Kichererbsen und R. Bataticola und Screen-Kichererbsen-Keimplasma untersucht werden kann. Die Einzelheiten der in der Studie verwendeten Materialien sind in der Tabelle der Materialienangegeben.

<table><tbody><tr><td>Pilz- Rhizoctonia bataticola</td><td>Pathogen-Inokulum</td><td>Indian Type Culture Collection No. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Soilrite mix</td><td>Bodenmedium im Labor</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, Indien</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Löschpapier Löschpapier zur Unterstützung des Pflanzenwachstums</td><td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Topf</td><td></td><td>Wachsende Pflanzen Töpfe mit einer Größe von 10 und 30 cm Routinemäßig</td><td>verwendete Anzuchttöpfe, z. B. https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar/Brühe</td><td>Den Pilz Züchten und pflegen</td><td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Kultivieren Sie den Pilz</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, Inkubator und Schüttler</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>Anbau von Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen</td><td>Modell Nr. A1000, Conviron, Kanada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Laminarer Luftstrom</td><td>Durchführung von aseptischen Übungen</td><td>Telstar, Bio II Advance, Klasse II Schrank, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Filterung des Pilzmyzels</td><td>Nylon-Moskitonetz</td><td>Mesh mit 0,6-1 mm Durchmesser Porengröße</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Autoklaviermedien und Kichererbsensamen</td><td>Autoklav</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>Mikroskope</td> Visualisierung <td>der Infektion mit Pilzmyzel</td><td>SMZ25 / SMZ18, Forschungsstereomikroskope, Leica EZ4 pädagogisches Stereomikroskop</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Wägewaage</td><td>Wiegen von Pilzen und Chemikalien</td><td>Sartorius Elektronische Waage, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Pilzfärbung</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>Anilinblau</td><td>Pilzfärbung</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

dry root rot disease assays in chickpea: eine detaillierte methodik

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Die Trockenwurzelfäule (DRR)-Krankheit ist eine sich abzeichnende biotische Stressgefahr für den Kichererbsenanbau auf der ganzen Welt. Es wird durch einen bodengestützten Pilzerreger, Rhizoctonia bataticolaverursacht. In der Literatur sind umfassende und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle zu Krankheitsassays spärlich. Dieser Artikel enthält vollständige Details zu den Schritten bei der Einrichtung einer Blotting-Papiertechnik zum schnellen Screening von Genotypen auf DRR-Resistenz. Die Blotting-Papiertechnik ist einfach und kostengünstiger. Eine andere Methode, die auf dem Krankentopfansatz basiert, ist eine Mimik natürlicher Infektion und kann angewendet werden, um die interagierenden Komponenten – Pflanze, Krankheitserreger und Umwelt – zu untersuchen, die am Krankheitsdreieck beteiligt sind.
Darüber hinaus kommt DRR in der Natur vor allem in regengespeisten Kichererbsenanbaugebieten vor, wo die Bodenfeuchtigkeit mit fortschreitendem Pflanzenwachstum abgeht. Dürrestress ist dafür bekannt, Kichererbsenpflanzen für DIE DRR-Krankheit prädisponieren. Das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress kann den Weg für die Identifizierung von ELITE-DRR-resistenten Sorten aus dem Kichererbsen-Keimplasmapool ebnen. Dieser Artikel enthält eine schrittweise Methodik für die Vorbereitung eines Krankentopfs und den anschließenden Krankheitstest. Insgesamt werden die hier vorgestellten Informationen den Forschern helfen, R. bataticola pilzinoculum vorzubereiten, diesen Erreger zu erhalten, die Blotting-Papier-Technik einzurichten, Krankenkultur und Krankentopf vorzubereiten und Krankheitserreger-Infektionen in Kichererbsenpflanzen zu bewerten.

Diese Studie zielte darauf ab, Techniken wie das Bloten von Papier und Kranke Topftechniken zu demonstrieren, um das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress zu erleichtern. Um dies zu erreichen, wurden Pflanzen mit DRR-Symptomen1,3,4 aus einem Kichererbsenfeld gesammelt, und der Pilz wurde mit der Hyphal-Spitzenmethode8isoliert. R. bataticola<...

Diese Studie stellt Methoden zur Untersuchung der pathomorphologischen und molekularen Mechanismen vor, die der Kichererbsen–Rhizoctonia-Bataticola-Interaktion zugrunde liegen. Die Blotting-Papier-Methode ist nützlich, um Kichererbsen-Genotyp-Antworten schnell zu studieren, während die kranke Topf-basierte Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig Dürre und R. Bataticola-Infektion und Bildschirm für tolerante Genotypen aufzuerlegen.

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Das Hauptziel dieser Studie ist es, eine detaillierte Methodik der Trockenwurzelfäule-Krankheit Assays zu demonstrieren, wie Blotting Papiertechnik und KrankentopfTechnik. Diese Techniken werden hilfreich sein, um die Wechselwirkung zwischen Kichererbsenpflanze und Rhizoctonia bataticola zu studieren. Das Verständnis der Wechselwirkung von Kichererbsen mit dem Pilzerreger Rhizoctonia bataticola ist landwirtschaftlich wichtig.Dazu werden vielseitige und hochreproduzierbare Assays benötigt. Hier werden zwei Assays gezeigt, die in unserem Labor weit verbreitet sind. Der eine von ihnen ist das Blotting auf Papierbasis, und der andere ist ein kranker Topf-basierter Assay.Um den Blotting-Papier-Test auszuführen, bereiten Sie Den Rhizoctonia bataticola Pilz inoculum vor, indem Sie von der schrägen Kultur zur Petriplatte und dann zur flüssigen Kultur aufsteigen. Bereiten Sie Kichererbsen-Kindergarten durch, Saat Samen in einem großen Topf. Entwurzeln Sie sie und legen Sie sie in das flüssige Inokulum und legen Sie sie auf Fleckpapier.Achten Sie auf Krankheitssymptome, nämlich Nekrose an der Wurzel, Wurzelfäule, und Blattvergilbung acht Tage nach der Impfung. Hier ist eine Nussschale, die Schritte in der Blotting-Papier-Technik. Um den kranken Topf Assay auszuführen, impfen Kichererbsenmehl mit Pilz.Nach der Inkubation bei 30 Grad Celsius für 15 Tage wird eine Krankheitskultur erlangt. Dann pulverieren und mit Topfmischung mischen. Säen Sie Samen auf Kontrolltopf und Krankentopf.Beachten Sie an den folgenden Tagen 10 Tage nach der Aussaat die Symptome, nämlich Nekrose an der Wurzel, Wurzelfäule und Blattvergilbung auf den infizierten Pflanzen. Der Kranke Topf kann verkleinert und für großflächige Screenings verwendet werden. Hier ist eine Nussschale der Schritte in der Krankentopftechnik.Rhizoctonia bataticola ist ein sich entwickelnder Erreger. Dieser Pilz produziert Hyphen und Mikrosklerotie, die während der Pflanzeninfektion als primäres Inuclum fungieren. Die reine Kultur, die durch die isolative Methode angewendet wird, wird für die Assays verwendet.Der Schlüsselpunkt für diese erfolgreichen Assays ist die optimale Inokulumbelastung. Hier beginnt die Demonstration der Blotting-Papiertechnik. Um flüssige Rhizoctonia bataticola inoculum zuzubereiten, impfen Sie die 500 ml Brühe mit dem Pilzagar-Stecker aus drei Tagen alten frischen Tellerkultur und bebrüten den Kolben in einem Brutkasten bei 28 Grad Celsius für fünf Tage.Filtern Sie die dunkelgraue Pilzmycelia mit Mikrosklerotie heraus. Setzen Sie in autoklaviertem Wasser und entfernen Sie die Medien. Wieder filtern Sie die Mycelia heraus und entfernen Sie Feuchtigkeit, indem Sie die Myzelelie für ein paar Minuten trocknen.100 Gramm Pilzinokulum in 200 ml autoklaviertem Wasser in einer Marmeladenflasche aussetzen und richtig mischen. Entwickeln Sie Kichererbsen-Kinderzimmer durch Aussaat von Oberflächen sterilisierten Samen in Solerant. Entwurzeln Sie die Pflanzen acht Tage nach der Aussaat, waschen Sie sie und spülen Sie sie mit autoklavierten RO. Nehmen Sie ein Blotting-Papier und falten Sie es einmal und legen Sie die Hälfte davon auf das Tablett.Machen Sie es nass mit autoklaviertem Wasser. Nehmen Sie Pflanzen und tauchen Sie in das Inokulum für 30 Sekunden mit intermittierenden Auf- und Abbewegung. Legen Sie die Pflanzen so, dass Wurzeln im Blatt bedeckt sind und Dielien draußen bleiben.Falten Sie die andere Hälfte und biegen Sie das Papier. Zur Kontrolle tauchen Sie die Pflanzen in autoklaven Wasser, halten Sie die Schalen acht Tage lang in einer Wachstumskammer. Ergebnisse. Beachten Sie die Symptome wie Blattvergilbung, Wurzelfäule, Nekrose in der Wurzel und Verringerung der seitlichen Wurzelzahl.Hier beginnt die Demonstration der Krankentopftechnik. Nehmen Sie ein Kilogramm kommerzielle Kichererbsensamen. Die Samen mit Leitungswasser waschen und mit dem RO-Wasser wieder waschen.Die Samen fünf Stunden einweichen. Erneut die Samen mit RO-Wasser waschen 300 Gramm in einer Marmeladenflasche hinzufügen. Autoklavieren Sie sie bei 121 LVS für 15 Minuten zweimal kontinuierlich.Nach dem Abkühlen die Flasche durch den laminaren Fluss übertragen. Impfen Sie die Flaschen mit drei Pilzagar-Steckern etwa vier Millimeter quadratische Größen und schütteln Sie es gut, um richtig zu mischen. Die Flaschen einwickeln und 15 Tage lang in einem Brutkasten bei 30 Grad Celsius bebrüten.Beobachten Sie für die Flaschen mit dunklem mycelialwachstum um die Kichererbsensamen und entfernen Sie die Samen. Trocknen Sie sie bei Raumtemperatur und pulverisieren Sie sie. Rhizoctonia bataticola Pulver mit Solorit mischen und fünf Tage bei Raumtemperatur aufbewahren.Oberfläche sterilisieren die GT62 Samen und säen sie in zwei Zentimeter Tiefe. Ergebnisse. Beobachten Sie die 90%-Sterblichkeit im Krankentopf. 10 Tage nach der Aussaat, beobachten Sie die Symptome wie Nekrose in den Wurzeln und Verringerung der seitlichen Wurzelzahl und Blattvergilbung in den folgenden Tagen.Krankentopf kann auch im Feldboden zubereitet werden. Dürre und Rhizoctonia bataticola Infektion. Stellen Sie Dürrestress im Krankentopf auf, indem Sie das Wasser zurückhalten.Hier sind die Pflanzen zu sehen, die der Kontrolle, Trockenheit, Krankheitserreger und gleichzeitiger Dürre und Krankheitserregerstress ausgesetzt sind. Beachten Sie die Symptome, nämlich mehr Nekrose, Wurzelfäule und Reduktion der lateralen Wurzelzahl und Wurzellänge in kombinierter Stressbehandlung im Vergleich zur rein pathogenen Behandlung. Schlussfolgerungen. Blotting Papiertechnik kann In Vitro Bedingungen durchgeführt werden.Kranke Topftechnik kann unter In-Vivo-Bedingungen ausgeführt werden. Im kranken Hafen kann abiotischer Stress, nämlich Dürrestress, zusammen mit der Krankheitserreger-Infektion auferlegt werden. Mit diesen Techniken kann man das Infektionsmuster des Erregers untersuchen.Die meisten physiologischen Veränderungen treten während der Kichererbsen-Rhizoctonia Bataticola Interaktion auf, und auch die Kichererbsen-Genotypen auf Resistenz zu überprüfen. Der Blotting-Papier-Assay ist sehr nützlich, um Qualitätsproben für Mikroskopie- und molekularbiologische Studien zu generieren. Der Kranke Topf-Assay, der die natürlichen Infektionsbedingungen imitiert, ist für das Screening von Kichererbsen-Keimplasma anwendbar.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik

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