Name: Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Präparation akuter horizontaler Hippocampus-Entorhinal-Cortex-Schnitte aus Mäusehirnen zur Untersuchung spontaner Netzwerkoszillationen. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufzeichnungen und pharmakologische Manipulationen.

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Der Autor bedankt sich bei Steve Siegelbaum für die Unterstützung. Die Finanzierung erfolgt durch 5R01NS106983-02 sowie 1 F31 NS113466-01.

Der Autor hat nichts zu verraten.

Es gibt mehrere Schritte in diesem Schneideprotokoll entwickelt, um die Gesundheit des Gewebes zu fördern und die Entstehung von spontanen naturalistischen Netzwerkaktivität zu fördern: die Maus ist transkardial durchlässig mit gekühlten Saccharose Schneiden Lösung; horizontal-entorhinale Kortex-Scheiben (HEC) werden mit einer Dicke von 450 m aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus geschnitten; Scheiben erholen sich an der Schnittstelle von erwärmter ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft; Während der Aufnahme...

Die elektrophysiologische Messung von lebenden Hippocampusscheiben in vitro ist ein kraftvoller experimenteller Ansatz mit zahlreichen Vorteilen. Der Experimentator kann ein Mikroskop, Mikromanipulatoren und ein Aufzeichnungssystem verwenden, um Messungen von einzelnen Neuronen im Gewebe direkt zu visualisieren und zu sammeln. Gewebescheiben sind auch sehr zugänglich für Photostimulation oder Arzneimittelabgabe für optogenetische, chemogenetische oder pharmakologische Experimente.
Das Hippocampus-Netzwerk erzeugt eine hochsynchrone Populationsaktivität in vivo, sichtbar als Schwingungen im extrazellulären lokalen Feldpotential1,2,3,4,5. Gehirn-Slice-Methoden wurden genutzt, um Einblicke in die zellulären und Schaltkreis-Mechanismen zu gewinnen, die diesen neuronalen Netzwerk-Oszillationen zugrunde liegen. Grundlagenarbeiten von Maier et al. zeigten, dass scharfe Wellenwellenkomplexe (SWRs) spontan in Scheiben des ventralen Hippocampus entstehen können6,7. Nachfolgende Studien von mehreren Forschern haben nach und nach viele Aspekte von SWRs aufgeklärt, einschließlich der Rolle von Neuromodulatoren bei der Regulierung des Netzwerkzustandes des Hippocampus8,9,10 und der synaptischen Mechanismen, die die In-vitro-Reaktivierung neuronaler Ensembles vorantreiben, die zuvor während des Verhaltens in vivo11aktiv waren. Hirn-Scheibenexperimente haben auch Einblick in die Gamma-Bereichs-Oszillation (30–100 Hz) gegeben, einen ausgeprägten Hippocampus-Netzwerkzustand, von dem angenommen wird, dass er die Speichercodierung und den Rückrufvon 12,13unterstützt. Schließlich haben Forscher, um die zentrale Rolle des Hippocampus und der damit verbundenen Strukturen in der Pathophysiologie der temporalen Lappenepilepsie14,15zu erkennen, Hippocampus-Scheibenpräparate verwendet, um die Erzeugung und Ausbreitung von epiptiformer Aktivität zu untersuchen. Carter et al. zeigten, dass kombinierte hippocampal-entorhinale Kortexscheiben, die von chronisch epileptischen Tieren hergestellt werden, spontan epileptische Einleitungen in vitro16erzeugen können. Anschließend untersuchten die Mittel, die den epileptiforformen Entladungen in Hippocampus-Scheiben zugrunde liegen, die Mechanismen, die den Epileptenableitungen zugrunde liegen, unter Verwendung modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit veränderten Ionenkonzentrationen (reduziert mg2+ oder erhöhte K+) oder zugesetzten Medikamenten (4AP oder Gabazin)17.
Die Forscher haben zahlreiche Hippocampus-Scheibenansätze entwickelt, die sich in schlüsselweisen Unterscheiden: (1) die Region des Hippocampus, die in der Scheibe enthalten ist (dorsal, mittel- oder ventral); (2) das Vorhandensein oder Fehlen von extrahippocampalen Geweben wie dem entorhinalen Kortex; (3) die Ausrichtung, die zum Schneiden von Scheiben (koronal, sagittal, horizontal oder schräg) verwendet wird; und (4) die Bedingungen, unter denen das Gewebe nach dem Schneiden gehalten wird (vollständig in ACSF getaucht oder an der Schnittstelle von ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft gehalten).
Die Wahl des zu verwendenden Schneidansatzes sollte durch das Versuchsziel bestimmt werden. Zum Beispiel wurden quer- oder koronale Scheiben des dorsalen Hippocampus, die unter getauchten Bedingungen gepflegt werden, sehr effektiv für die Untersuchung von intrahippocampalen Schaltkreisen und synaptischer Plastizität18,19,20verwendet. Solche Präparate erzeugen jedoch nicht spontan Netzwerkschwingungen, so leicht wie Scheiben aus dem ventralen Hippocampus21,22,23. Obwohl ein Zustand anhaltender SWR-Aktivität durch tetanische Stimulation in Querscheiben aus dem dorsalen und ventralen Hippocampus24induziert werden kann, werden spontane SWRs leichter in ventralen Scheiben7,25beobachtet.
Eine inhärente physiologische und anatomische Unterscheidung zwischen dem dorsalen und ventralen Hippocampus wird durch Studien unterstützt, die sowohl in vivo als auch in vitrodurchgeführt werden26. Aufnahmen bei Ratten zeigten stark kohärente Theta-Rhythmen im dorsalen und mittleren Hippocampus, aber eine schlechte Kohärenz zwischen der ventralen Region und dem Rest des Hippocampus27. SWRs in vivo vermehren sich leicht zwischen dem dorsalen und mittleren Hippocampus, während SWRs, die ihren Ursprung im ventralen Hippocampus haben, oft lokal bleiben28. Die Assoziationsprojektionen, die von CA3-Pyramidenneuronen stammen, die sich im dorsalen und mittleren Hippocampus befinden, projizieren große Entfernungen entlang der Längsachse des Hippocampus. CA3-Projektionen aus ventralen Regionen bleiben relativ lokal und werden daher während des Schneidprozesses weniger wahrscheinlich durchtrennt29,30. Ventralslices können daher das wiederkehrende Netzwerk, das zur Erzeugung von Populationssynchronität erforderlich ist, besser erhalten. Die Neigung von ventralen Scheiben, spontane Netzwerkaktivitäten in vitro zu erzeugen, kann auch eine höhere intrinsische Erregbarkeit von pyramidenförmigen Neuronen oder eine schwächere GABAerge Hemmung im ventralen Hippocampus im Vergleich zu mehr dorsalen Regionen widerspiegeln31. Tatsächlich sind ventrale Hippocampusscheiben anfälliger für epilepptrime Aktivität32,33. So haben viele Studien der spontanen physiologischen8,9,11,24 oder pathologischen16,34,35,36 Netzwerkschwingungen traditionell einen horizontalen Schneidansatz verwendet, manchmal mit einem leichten Winkel in fronto-okzipitaler Richtung, der Gewebescheiben parallel zur Querebene des ventralen Hippocampus ergibt.
Die Netzwerkkonnektivität wird durch das Schneidverfahren unweigerlich beeinträchtigt, da viele Zellen im Slice getrennt werden. Der Winkel und die Dicke der Scheibe und das in der Zubereitung zurückgehaltene Gewebe sollten berücksichtigt werden, um die Konnektivität in den von Interesse interessierten Schaltkreisen zu optimieren. Viele Studien haben horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinale Kortexscheiben (HEC) verwendet, um Wechselwirkungen zwischen den beiden Strukturen im Kontext physiologischer oder pathologischer Netzwerkschwingungen zu untersuchen. Roth et al. führten zwei Aufnahmen aus dem CA1-Unterfeld des Hippocampus und der Schicht V des medialen entorhinalen Kortex durch, um die Ausbreitung der SWR-Aktivität durch die HEC-Scheibe37zu demonstrieren. Viele Studien der epileppitischen Aktivität haben die HEC-Scheibenpräparation verwendet, um zu untersuchen, wie sich epileptische Entladungen durch das kortikohippocampale Netzwerk16,35,36,38ausbreiten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Erhaltung der intakten Kortokhippocampalschleife keine Voraussetzung für spontane SWRs, epileptiforme Entladungen oder Gamma-Oszillationen ist; Netzwerkschwingungen können in Querscheiben des dorsalen oder ventralen Hippocampus ohne angehängte parahippocampale Gewebe21,22,23, 25,39,40,41erzeugt werden. Ein wichtigerer Faktor für die spontane Erzeugung von Netzwerkschwingungen in Hippocampus-Scheiben kann die Dicke jeder Scheibe sein, da eine dickere Scheibe (400–550 m) mehr Konnektivität im wiederkehrenden CA2/CA3-Netzwerk21,22,25erhalten wird.
Obwohl abgewinkelte horizontale HEC-Scheiben (mit einem ca. 12° Winkel in Front-Okzipital-Richtung geschnitten) verwendet wurden, um die funktionelle Konnektivität der Kortikohippocampal-Schleife11,16,34,35,42, solche abgewinkelten Präparate sind nicht erforderlich für spontane Netzwerkaktivität43,44,45. Die Verwendung einer abgewinkelten Schnittebene ermöglicht es dem Prüfer jedoch, selektiv Scheiben herzustellen, die die quer ausgerichtete Lamellen des ventralen oder mittleren Hippocampus am besten erhalten, je nachdem, ob ein Abwärts- oder ein Aufwärtswinkel angewendet wird (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt konzeptionell dem von Papatheodoropoulos et al., 2002, der jeden Hippocampus frei sezierte und dann einen Gewebechopper verwendete, um Querscheiben entlang der gesamten dorsal-ventralen Achse21zu erstellen. Angesichts der oben genannten funktionellen Unterscheidungen zwischen dem ventralen und dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus sollten die Forscher den anatomischen Ursprung von Scheiben bei der Gestaltung von Experimenten oder bei der Interpretation von Ergebnissen berücksichtigen. Die Verwendung einer Agarrampe während des Schneidvorgangs ist eine einfache Möglichkeit, bevorzugt Scheiben aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus herzustellen.
Hippocampalscheiben können entweder in einer untergetauchten Kammer (mit vollständig empfänglichem Gewebe in ACSF) oder in einer Kammer im Interface-Stil (z. B. Oslo- oder Haas-Kammer, mit Scheiben, die nur von einem dünnen Film fließender Medien bedeckt sind) aufbewahrt werden. Die Schnittstellenpflege verbessert die Sauerstoffversorgung des Gewebes, was das neuronale Überleben fördert und eine anhaltend hohe intereuronale Aktivität ermöglicht. Traditionell verwenden die Bedingungen für die untergetauchte Aufzeichnung eine langsamere ACSF-Durchflussrate, die keine ausreichende Gewebesauerstoffversorgung für eine stabile Expression von Netzwerk-Level-Oszillationen bietet. In untergetauchten Hippocampusscheiben werden Carbachol-induzierte Gamma-Oszillationen nur vorübergehend46,47beobachtet, während sie in Schnittstellenaufnahmekammern10,48,49stabil gehalten werden können. Als solche haben sich viele Studien komplexer spontaner Aktivität in vitro auf Schnittstellenaufzeichnungskammern verlassen, um scharfwellige Wellenkomplexe6,7,8,9,10,25,37, Gamma-Oszillationen10,13und epileptiforme Aktivität16,38,45,47zu untersuchen.
In einer Aufnahmekammer im Untergetauchtstil kann ein Tauchmikroskopobjektiv verwendet werden, um einzelne Zellen zu visualisieren und gezielt gesund aussehende Zellen für Aufnahmen zu zielen. Das untergetauchte Präparat ermöglicht auch eine feine Kontrolle über das zelluläre Milieu, da das Tauchen eine schnelle Diffusion von Medikamenten oder anderen Verbindungen in das Gewebe erleichtert. Eine modifizierte Methodik, bei der stabile Netzwerkschwingungen unter unter Getauchtbedingungen aufrechterhalten werden, stellt somit einen starken experimentellen Ansatz dar. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist die Arbeit von H.jos et al., bei der sich Hippocampusscheiben in einer vereinfachten Haltekammer im Grenzflächenstil für mehrere Stunden erholen, bevor sie in eine modifizierte Unterbrennkammer mit einer hohen Durchflussrate von ACSF (ca. 6 ml/min) übertragen werden, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes zu verbessern12,48,49. Unter diesen Bedingungen können in einer untergetauchten Aufnahmekammer ein hohes Niveau der interneuronen Aktivität und stabile spontane Netzwerkschwingungen aufrechterhalten werden. Dieser modifizierte Ansatz ermöglicht es den Forschern, visuell geführte Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnungen durchzuführen und den Beitrag morphologisch identifizierter Zelltypen zu Carbachol-induzierten Gammaoszillationen12zu charakterisieren. SWRs können auch spontan in untergetauchten Hippocampus-Scheiben mit einer schnellen Durchflussrate von ACSF11,48,49auftreten. Maier et al. zeigten, dass Hippocampus-Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in einer Grenzkammer erholten, zuverlässig spontane SWRs zeigten, während Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in ein Becherglas zurückzogen, kleinere evokierte Feldreaktionen, niedrigere Konzentrationen spontaner synaptischer Ströme zeigten und nur sehr selten spontane SWRs43zeigten. Schlingloff et al. nutzten diese verbesserte Methodik, um die Rolle von parvalbumin-exezierenden Korbzellen bei der Erzeugung spontaner WW44zu demonstrieren.
Das folgende Protokoll stellt eine Schneidmethode vor, mit der spontan aktive Neuronen in horizontalen Hippocampusscheiben unter Schnittstellenbedingungen zurückgewonnen und anschließend in einer untergetauchten Aufnahmekammer aufbewahrt werden können, die für pharmakologische oder optogenetische Manipulationen und visuell geführte Aufnahmen geeignet ist.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationshalter für akute Hirnscheiben</td><td>NIH 3D Print Exchange</td><td>3DPX-001623</td><td>Entworfen von ChiaMing Lee, erhältlich bei https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphate magnesium</td><td>salt Sigma Aldrich</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl gemahlene Pellets</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton, Dickinson</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>Becherglas (250 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>Becherglas (400 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Oster</td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Schere, kleiner</td><td>Becton, Dickinson</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament (AD 1,5 mm, I.D. 0,86 mm, Länge 10 cm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Feuerpolierte Kapillaren sind vorzuziehen.</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Lösung (1 M)</td><td>G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>komprimiertes Carbogen-Gas (95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid)</td><td>Airgas</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>komprimierter Sauerstoff</td><td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>isolierter Stimulator mit konstanter Spannung</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Klebstoff</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td><td>Verwenden Sie idealerweise die Brush-on-Form für die</td></tr><tr><td>Präzisionsdatenerfassungssoftware</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td>Jede gleichwertige Software (z.B. pClamp) würde funktionieren.</td></tr><tr><td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td><td>Dell</td><td>N/A</td><td>Die Katalognummer hängt vom jeweiligen Computer ab – jeder Computer funktioniert, solange er elektrophysiologische Erfassungssoftware ausführen kann.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>digitaler Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4-Kanal Rückverfolgbarer Timer</td></tr><tr><td>Einweg-Absorptionspads</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>Dissektorschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>zweischneidige Rasierklingen</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>dual automatisch Temperaturregler</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Surface- oder Laminar-Flow-optimierte Aufnahmekammer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Die in diesem Protokoll vorgestellte Kammer ist eine Sonderanfertigung. Ein kommerzielles Pendant wäre die RC-27L von Warner Instruments.</td></tr><tr><td>Gerätegestell</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70"</td><td>Ein Gestell ist nicht unbedingt erforderlich, aber nützlich für die Organisation der Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-Teetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>Feinkalk</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204DR</td><td></td></tr>Flammender<tr><td>/Brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin 5&prime;-Triphosphat Natriumsalzhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>General Anesthetic Services</td><td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td>Laborband</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Linsenpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloridlösung (1 M)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>magnetisch Rührstäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-56</td><td>Die Katalognummer hängt von der Größe des Rührstäbchens ab.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator (manuell)</td><td>Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B Mikroelektrodenverstärker</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Die MultiClamp 700B sollte Kopftische, Pipettenhalter und eine Modellzelle enthalten.</td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N&prime;-(2-Ethansulfonsäure), (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nadel (20 Gauge, 1,5 Zoll Länge)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Filament</td><td>YLI Wonder Invisible Thread</td><td>212-15-004</td><td>Größe 0,004. Diese Katze. # ist aus Amazon.com</td></tr><tr><td>Nylonnetz</td><td>Warner Instruments Corporation</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>Perstaltikpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>Phosphokreatin Di(tris) Salz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>World Precision</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>Polymilchsäure (PLA) Filament</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumgluconat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Rollenklemme</td><td>Welt Precision Instruments</td><td>14041</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scheibe Harfe</td><td>Warner</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch wasserfrei</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>Spatel/Löffel, groß</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>sterile Skalpellklingen</td><td>Feder</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>Rührer / Heizplatte</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>Absperrventile, 1-Wege</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>Absperrventile, 3-Wege</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Acros Organics</td><td>AC177142500</td><td></td></tr><tr><td>Halterung für Drehklemmen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische Schere, scharf/stumpf</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (60 mL mit Luer-Lok-Spitze)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>dreizinkige Klemme</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange, groß</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange, kleine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 Zoll, AD 3/16 Zoll</td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 Zoll, AD 1/4 Zoll</td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Vibrationsklingen-Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Schwingungsdämpfender Tisch mit Faradayscher Käfig</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>Messkolben (1 L)</td><td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>Messkolben (2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>Warmwasserbad</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

akute maus gehirn schneiden, um spontane hippocampal-netzwerk-aktivität zu untersuchen

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Akutes Nagetier-Gehirnschneiden bietet einen belastbaren experimentellen Ansatz, um Einblicke in die Organisation und Funktion neuronaler Schaltkreise mit einzelliger Auflösung mittels Elektrophysiologie, Mikroskopie und Pharmakologie zu gewinnen. Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung von In-vitro-Experimenten ist jedoch das Ausmaß, in dem verschiedene Scheibenpräparate naturalistische Muster der neuronalen Aktivität rekapitulieren, wie sie in vivo beobachtet werden. Im intakten Gehirn erzeugt das Hippocampus-Netzwerk eine hochsynchronisierte Populationsaktivität, die den Verhaltenszustand des Tieres reflektiert, wie die scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel der scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel des Aufwachens oder des Nicht-REM-Schlafs. SWRs und andere Formen der Netzwerkaktivität können unter geeigneten Bedingungen spontan in isolierten Hippocampusscheiben entstehen. Um das leistungsstarke Gehirn-Slice-Toolkit auf die Untersuchung der Hippocampus-Netzwerkaktivität anzuwenden, ist es notwendig, einen Ansatz zu nutzen, der die Gewebegesundheit und die Erhaltung der funktionellen Konnektivität innerhalb des Hippocampus-Netzwerks optimiert. Mäuse werden transkardial mit kalter, auf Saccharose basierender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchlässig. Horizontale Scheiben, die den Hippocampus enthalten, werden mit einer Dicke von 450 m geschnitten, um die synaptische Konnektivität zu erhalten. Slices werden in einer Kammer im Interface-Stil wiederhergestellt und für Aufnahmen in eine untergetauchte Kammer übertragen. Die Aufnahmekammer ist für die doppelte Oberflächensuperfusion von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei hoher Durchflussrate ausgelegt, um die Sauerstoffversorgung der Scheibe zu verbessern. Dieses Protokoll liefert gesundes Gewebe, das für die Untersuchung komplexer und spontaner Netzwerkaktivitäten in vitrogeeignet ist.

Hier werden repräsentative Aufnahmen von HEC-Slices präsentiert, die wie in diesem Protokoll beschrieben vorbereitet werden. Nach der Wiederherstellung in einer Schnittstellenhaltekammer (Abbildung 1C) werden die Scheiben einzeln in eine untergetauchte Aufnahmekammer übertragen (Abbildung 2B). Die Aufnahmekammer wird mit autobogengesättigtem ACSF mit einer peristaltischen Pumpe geliefert (Abbildung 2A). Die Pumpe zieht ACSF zunächst...

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Mit diesem Protokoll können Forscher die Mechanismen untersuchen, die den Oszillationen des Hippocampus-Netzwerks in akuten Präparaten von Maushirnschnitten zugrunde liegen. Bei dieser Zubereitung werden Aufzeichnungen unter getauchten Bedingungen in Schichten durchgeführt, die spontane Netzwerkschwingungen erzeugen, wodurch pharmakologische und optogenetische Techniken durchgeführt und Einzelzellaufzeichnungen sichtbar gemacht werden können. Für die transkardiale Perfusion füllen Sie unmittelbar vor der Entnahme der Maus aus der Isoflurankammer einen Deckel der Petrischale mit drei bis fünf Millimetern gekühlter Saccharoselösung und füllen Sie den Boden der Petrischale mit etwa einem Zentimeter gekühlter Saccharoselösung.Übertragen Sie die betäubte Maus schnell auf das linke saugfähige Pad und befestigen Sie die Vordergliedmaßen und den Schwanz mit drei Stücken Klebeband. Befestigen Sie die Haut mit einer großen Gewebezange und einer chirurgischen Schere und machen Sie einen Längsschnitt von der Unterseite des Brustbeins bis zur Oberseite der Brust. Ziehe mit der Pinzette das Brustbein nach oben und schneide mit der Schere durch das Zwerchfell.Schneide mit der Schere den Brustkorb auf jeder Seite in einer großen Bewegung in Richtung des Punktes, an dem die Vordergliedmaße auf den Körper trifft, und positioniere mit der Pinzette die Vorderseite des Brustkorbs zum Kopf. Verwenden Sie die Schere, um einen horizontalen Schnitt zu machen, um die Rippen vollständig zu entfernen, und verwenden Sie die Pinzette, um das Herz an Ort und Stelle zu halten, während Sie eine 20-Gauge-Perfusionsnadel in den linken Ventrikel einführen. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, verwenden Sie eine kleine Präparierschere, um einen Schnitt in den rechten Vorhof zu machen, und lassen Sie das Blut aus dem Kreislaufsystem spülen.Um das Gehirn zu extrahieren, verwenden Sie nach der Enthauptung eine kleine Bondschere, um zwei seitliche Schnitte durch den Schädel in Richtung der Mittellinie an der Vorderseite des Schädels in der Nähe der Augen zu machen, und machen Sie zwei weitere Schnitte auf beiden Seiten der Schädelbasis. Tauchen Sie den Kopf in die Petrischale aus Glas und schneiden Sie mit der Schere entlang der Mittellinie über die gesamte Länge des Schädels, während Sie ihn mit der Schere nach oben ziehen, um die Schädigung des darunter liegenden Hirngewebes zu minimieren. Verwenden Sie eine kleine Gewebezange, um jede Seite des Schädels fest zu greifen, und heben Sie den Knochen nach oben und vom Gehirn weg, um den Schädel wie ein Buch zu öffnen.Halten Sie mit den Fingern der linken Hand die Klappen des Schädels offen, führen Sie den Mikrospatel unter das Gehirn in der Nähe der Riechkolben ein und drehen Sie das Gehirn aus dem Schädel in die Saccharose. Verwenden Sie den Mikrospatel, um den Hirnstamm zu durchtrennen, und waschen Sie das Gehirn, um Blutreste, Fell oder Gewebe zu entfernen. Verwenden Sie den großen Spatel, um das Gehirn auf den gläsernen Petrischalendeckel zu übertragen, und verwenden Sie die Hälfte einer zweischneidigen Rasierklinge, um einen koronalen Schnitt im vordersten Teil des Gehirns zu machen, einschließlich der Riechkolben.Machen Sie als Nächstes einen koronalen Schnitt, um das Kleinhirn zu entfernen, und tragen Sie Cyanacrylatkleber auf eine Agarrampe auf. Trocknen Sie das Gehirn mit einer Pinzette kurz auf einem Stück Filterpapier, bevor Sie das Gewebe mit der Bauchseite nach unten in den Klebstoff auf der Agarrampe legen. Platzieren Sie die Schneideplattform in der Schneidekammer eines Mikrotoms und bedecken Sie die Anlage vollständig mit gekühlter Saccharoselösung.Mit dem großen Spatel etwas Saccharose-Aufschlämmung in die Kammer einrühren, gefrorene Saccharose schmelzen und die Temperatur der Mischung schnell auf ein bis zwei Grad Celsius senken. Schneiden Sie Scheiben bis zu einer Dicke von 450 Mikrometern bei einer Schnittgeschwindigkeit von 0,07 Millimetern pro Sekunde. Wenn jede Scheibe frei ist, verwenden Sie die Kleinteilzange und ein scharfes Skalpell, um die beiden Hemisphären zu trennen und Gewebe wegzuschneiden, bis die Scheibe hauptsächlich aus dem Hippocampus und der Perihippocampusregion besteht.Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Scheiben einzeln in eine Grenzflächen-Rückgewinnungskammer mit erwärmtem aCSF zu übertragen. Die Scheiben befinden sich an der Grenzfläche zwischen aLiquor und Luft und sind nur von einem dünnen Meniskus aus aLiquor bedeckt. Wenn alle Scheiben aufgenommen wurden, schließen Sie die Kammer fest, damit sich die Scheiben 30 Minuten lang bei 32 Grad Celsius erholen können.Stellen Sie die Kammer am Ende der Erholungsphase auf ein Rührwerk, das auf eine langsame Geschwindigkeit eingestellt ist, um die Zirkulation des Liquor in der Kammer zu fördern. Um lokale Feldpotentiale zu erfassen, füllen Sie ein 400-Milliliter-Becherglas mit karbogenblasigem aCSF und stecken Sie ein Ende des Pumpenschlauchs in das Becherglas. Schalten Sie eine Peristaltikpumpe mit 8 bis 10 Millilitern pro Minute ein, um aCSF aus dem 400-Milliliter-Becherglas in ein beheiztes Reservoir und aus dem Reservoir in die Aufnahmekammer bei 32 Grad Celsius zu leiten.Klemmen Sie anschließend den Schlauch kurz fest und schalten Sie die Pumpe aus, um den Durchfluss zu unterbrechen. Übertragen Sie mit einer feinen Pinzette eine Gehirngewebescheibe in die Aufnahmekammer an der Ecke des Linsenpapiers, auf dem das Gewebe ruht, und schneiden Sie sie nach unten. Ziehen Sie das Linsenpapier ab, lassen Sie die Scheibe in der Aufnahmekammer hinter sich und befestigen Sie die Scheibe mit einer Harfe.Unter Verwendung eines manuellen Mikromanipulators wird die Spitze einer mit Natriumchlorid gefüllten Stimulationspipette langsam in einem Winkel von 30 bis 45 Grad in die Oberfläche der Scheibe geschoben, dann wird mit einem zweiten Mikromanipulator die Spitze einer mit aCSf gefüllten Pipette mit lokalem Feldpotential in einem Winkel von 30 bis 45 Grad langsam in den interessierenden Bereich geschoben. und erfassen Sie das lokale Feldpotenzial der Probe gemäß Standardprotokollen. In dieser Abbildung sind repräsentative Aufzeichnungen von Schnitten des entorhinalen Kortex des Hippocampus zu sehen, die gemäß dem gezeigten Protokoll erstellt wurden. In gesunden Schnitten sollte die elektrische Stimulation ein postsynaptisches Feldpotential mit einer kleinen präsynaptischen Fasersalve und ein großes postsynaptisches Potential mit einem schnellen anfänglichen Abstieg erzeugen.Spontane scharfwellige Wellen sollten auch als positive Ablenkungen im lokalen Feldpotential im Stratum pyramidale sichtbar sein. In suboptimalen Schichten zeigen die postsynaptischen Potentiale des evozierten Feldes eine große Fasersalve und ein relativ kleines postsynaptisches Potential, und solche Schichten zeigen keine spontanen Sharp-Wave-Ripples. In vitro zeigen scharfwellige Welligkeiten ein positives Feldpotential in der Stratum pyramidale Schicht, mit einer überlagerten hochfrequenten Oszillation gepaart mit einem negativen Feldpotential in der Stratum radiatum Schicht.Wie dargestellt, haben scharfwellige Kräuselungen in hippokampalen entorhinalen Kortexschnitten ihren Ursprung in den rekurrenten Schaltkreisen von CA2/CA3 und breiten sich auf CA1 aus. Es ist wichtig, während des gesamten Verfahrens Carbogen in die Lösungen zu sprudeln, um sicherzustellen, dass die Saccharoselösung gekühlt wird, und um jeden Schritt so schnell wie möglich durchzuführen. Nach der Präparation dieser Schnitte können extrazelluläre oder intrazelluläre Ableitungen sowie optogenetische oder pharmakologische Experimente durchgeführt werden, um festzustellen, wie verschiedene Zelltypen zur Funktion neuronaler Netzwerke beitragen.

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Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung horizontaler Hippocampus-Hirnschnitte von Mäusen, wobei der Schwerpunkt auf der Erhaltung der Integrität der hippokampalen Faserwege liegt. Der Prozess beinhaltet das sorgfältige Halbieren und Sichern des Gehirns, die Verwendung eines Vibratoms zum Schneiden und die Aufrechterhaltung optimaler Gewebebedingungen mit einer karbogenierten Flüssigkeit, was zu Hippocampus-Gehirnschnitten führt, die für weitere Experimente bereit sind.

Gewinnung horizontaler Schnitte des Hippocampus-Gehirns der Maus

Das Video zeigt ein Verfahren zur Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials (LFP) in hippocampus-entorhinalen Kortexschnitten der Maus. Die elektrische Stimulation erfolgt am CA3 stratum radiatum des Hippocampus, was zu Veränderungen des postsynaptischen Potentials am CA1 stratum pyramidale führt. Aufgezeichnet wird die kombinierte Änderung des Membranpotentials von CA1-Neuronen, die als lokales Feldpotential bezeichnet wird.

Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials in hippocampus-entorhinalen Kortexschnitten der Maus

Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden.

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Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die Präparation akuter horizontaler Hippocampus-Entorhinal-Cortex-Schnitte aus Mäusehirnen zur Untersuchung spontaner Netzwerkoszillationen. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufzeichnungen und pharmakologische Manipulationen.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

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