Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten
25. Juni 2021
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.
Dieses Protokoll kombiniert Fluoreszenz-RNAscope-In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie unter Verwendung von frisch gefrorenen oder fixierten Gehirnpräparaten. Diese Technik ermöglicht Flexibilität durch die Demonstration einer Kombination aus hochempfindlicher In-situ-Hybridisierung und immunhistochemischen Methoden zur räumlichen Visualisierung von RNA- und Proteinzielen in derselben Gewebeprobe. Diese Methode ist für die Multiplex-Markierung in Hirngewebeschnitten anwendbar und hilft bei der Untersuchung der räumlichen Organisation und funktionellen Bedeutung von mRNA und Proteinen innerhalb heterogener neuronaler Populationen in den Neurowissenschaften.
Dieses Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Verarbeitungsschritte für frisch gefrorenes Gewebe und paraformaldehydfixiertes Gewebe. Um mit dem Schneiden des frisch gefrorenen Hirngewebes zu beginnen, befestigen Sie es auf dem vorgekühlten Kryostat-Chuck und schneiden Sie 14 Mikrometer dicke koronale Abschnitte. Montieren Sie die Sektion auf einem Objektträger aus geladenem Glas.
Übertragen Sie das montierte Dia in eine Diabox. Anschließend wird die Box auf Trockeneis in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius transportiert. Zur Gewebefixierung filtrieren Sie die vorbereitete Paraformaldehydlösung.
Auf 4 Grad Celsius abkühlen lassen. Bringen Sie den montierten Objektträger aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius auf Trockeneis und tauchen Sie ihn sofort für 15 Minuten in die vorgekühlte Paraformaldehydlösung. Führen Sie eine Dehydrierung des frisch gefrorenen Gewebes durch, um sicherzustellen, dass der Objektträger vollständig trocken ist. Nachdem das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom aus einer fixierten transkardialen Profusionshalterung entnommen wurde, wurden 30 Mikrometer dicke Gewebeschnitte geschnitten.
Bewahren Sie die geschnittenen Abschnitte in Kryoschutzlösung auf. Am Tag des FISH-Assays wird der frei schwebende Abschnitt in eine 12-Well-Zellkulturplatte mit 0,1 molaren PBS überführt und mit 90 bis 100 U/min auf einem rotierenden Plattformschüttler gerührt, um das Kryoprotektivum abzuwaschen. Befestigen Sie den Abschnitt dann mit einem Pinsel flach auf einem Objektträger für die Glasmikroskopie, um ein Ablösen beim Waschen zu verhindern, und lassen Sie ihn mindestens zwei Stunden lang an der Luft trocknen.
Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um den Abschnitt, um die FISH-Reagenzien aufzunehmen. Nach der Vorverarbeitung wird das Gewebe in Proteaselösung inkubiert und gemäß den Richtlinien des Herstellers zwei Stunden lang mit RNAscope-Sonden hybridisiert. Dann werden sequentielle Amplifikationsschritte und Fluoreszenz-Immunhistochemie durchgeführt.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer befeuchteten, lichtgeschützten Kammer für die Inkubation von Objektträgern. Im Wasserbad 50X Waschpuffer erwärmen und 10 Minuten lang auf 40 Grad Celsius erhitzen. Sobald es auf Raumtemperatur abgekühlt ist, bereiten Sie einen Liter 1-fachen Waschpuffer aus der 50-fachen Stammkonzentration vor.
Bereiten Sie die Sondenmischung wie im Textmanuskript beschrieben vor. Für die Proteinase-Behandlung geben Sie Proteinase 3 in den Gewebeschnitt und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Proteinase abzuwaschen, tauchen Sie den Objektträger vorsichtig in 0,1 molar PBS bei Raumtemperatur ein, um zu vermeiden, dass sich der Abschnitt löst.
Für die Hybridisierung wird die Sondenmischung in den Gewebeschnitt gegeben. Stellen Sie es in die befeuchtete, vorgewärmte Kammer. Anschließend zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren.
Spülen Sie den Gewebeschnitt zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer aus. Zur Signalverstärkung mit einer Tropfflasche eine Amplifikationslösung hinzufügen, um den Gewebeabschnitt abzudecken, und wie im Text beschrieben inkubieren. Geben Sie die Blockierungslösung auf den Gewebeschnitt und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
Schnippen Sie den Objektträger, um den überschüssigen Blockierungspuffer nach der Inkubation zu entfernen. Inkubieren Sie nun den Abschnitt mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Tag dreimal mit 1X TBS.
Fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. Erfassen Sie repräsentative Bilder mit 20-facher Vergrößerung und speichern Sie sie als TIF-Dateien.
In der vorliegenden Studie wurden die Gewebequalität, die Integrität und die Abwesenheit von bakterieller Kontamination durch das Fehlen einer DAPI-Markierung bestätigt. Die Markierung von Positivkontrollsonden, die auf Ubiquitin C, Peptidylprolylisomerase B und RNA-Polymerase IIA mRNA abzielen, bestätigte die RNA-Integrität. In frisch gefrorenen Präparaten zur Unterscheidung von GalR1-mRNA-positiven Neuronen innerhalb des NTS wurden zusätzliche neurochemische Marker verwendet.
Der membrangebundene vesikuläre Transporter war eindeutig markiert. Im Gegensatz dazu wurden zytoplasmatische Proteine wie Tyrosinhydroxylase und GFP, die unter der Kontrolle des PHOX2B-Promotors exprimiert wurden, schwach beobachtet und als flockig beschrieben, da ihnen eine klare Kontur fehlt. Die GalR1 FISH-Sondenmarkierung der zytoplasmatischen GalR1-mRNA war punktuell und konnte deutlich beobachtet werden.
Um zu bestätigen, dass die Qualität der Immunhistochemie von der subzellulären Lokalisation des Proteins abhängt, wurden verschiedene nukleäre und zytoplasmatische Proteine parallel zu FISH in denselben Gewebeschnitten markiert. Das zytoplasmatische PHOX2B GFP hatte ein flockendes Aussehen. Das nukleäre PHOX2B-Proteinsignal hingegen war eindeutig, was eine qualitativ hochwertigere Immunmarkierung in Kombination mit FISH bestätigte.
Bei der Durchführung an fixierten Schnellschnitten in Kombination mit FISH war die Immunhistochemie unabhängig von der subzellulären Lokalisation zuverlässig. GlyT2-mRNA-positive Neuronen befanden sich ventral des NTS und nicht innerhalb des NTS. GlyT2-mRNA-positive und PHOX2B-mRNA-positive Neuronen kolokalisierten nicht.
Eine Subpopulation von PHOX2B-mRNA-positiven NTS-Neuronen war Tyrosinhydroxylase-immunreaktiv, und keines enthielt GlyT2-mRNA. RNAscope ermöglicht die Visualisierung und Analyse der RNA-Verteilung mit Einzelmolekülauflösung in Zellen und Geweben. Es ermöglicht die Erforschung neuartiger RNA-Spezies, Krankheitsmechanismen, Genexpressionsmuster, Neuronenvielfalt und zellulärer Interaktionen.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll für die Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) an frisch gefrorenen und fixierten Mausgehirnschnitten. Die Technik ermöglicht die räumliche Visualisierung von RNA- und Protein-Zielen gleichzeitig und unterstützt die Untersuchung neuronaler Populationen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Molekulare Biologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Die Studie untersucht die räumliche Organisation von mRNA und Proteinen in heterogenen neuronalen Populationen.
- Die Kombination von FISH und IHC ermöglicht eine Multiplex-Markierung in Gehirngewebeschnitten.
- Ziel ist es, das Verständnis der Genexpression und Proteinlokalisation im Gehirn zu verbessern.
- Das Protokoll ist sowohl für frisch gefrorenes als auch für Paraformaldehyd-fixiertes Gewebe anwendbar.
Zweck der Studie
- Zur Demonstration einer zuverlässigen und flexiblen Methode zur gleichzeitigen RNA- und Proteindetektion.
- Zur Verbesserung der Untersuchung der mRNA-Verteilung und Proteinlokalisation in neuronalen Zellen.
- Zur Validierung der Qualität der immunhistochemischen Markierung in Kombination mit FISH.
Verwendete Methoden
- Als Hauptplattform wurden frisch gefrorene und Paraformaldehyd-fixierte Gehirnschnitte verwendet.
- Das biologische Modell umfasste Mausgehirngewebe und konzentrierte sich auf RNA- und Proteinsignale in Neuronen.
- Die Methode umfasst kritische Schritte wie Schnittherstellung, Fixierung, Hybridisierung und Signalverstärkung.
- Detaillierte Inkubations- und Waschprotokolle wurden befolgt, um klare Ergebnisse zu gewährleisten.
Hauptergebnisse
- Positive Kontrollsonden bestätigten die RNA-Integrität, während unterschiedliche Grade der Signalklarheit bei Proteinen beobachtet wurden.
- Die Studie zeigte die Fähigkeit, zwischen cytoplasmatischen und nuklearen Signalen in Neuronen zu unterscheiden.
- Es wurden Hinweise auf unterschiedliche neuronale Populationen und deren RNA/Protein-Expressionen berichtet.
- Die Kombination von FISH und IHC erwies sich als zuverlässig zur Visualisierung mehrerer Ziele innerhalb derselben Schnitte.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine fortgeschrittene Erforschung der Neuronenvielfalt und -interaktion innerhalb des Gehirngewebes.
- Diese Studie bietet einen Rahmen für zukünftige Untersuchungen zu neuronalen Mechanismen und potenziellen Krankheitsmodellen.
- Die Methode bereichert unser Verständnis der molekularen und zellulären Dynamik in der Neurowissenschaft.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Combining multiplex FISH with fluorescence IHC enables biopharma R&D to resolve spatial co-expression of RNA and protein targets within heterogeneous neuronal populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. This approach enhances predictive confidence by linking molecular signatures to cellular phenotypes, informing go/no-go decisions in early discovery. The method’s applicability to fresh-frozen and fixed tissues provides workflow flexibility for target interrogation across preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping low-abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high-abundance transcripts within immunohistochemically defined brain nuclei.
- Operational Value: Supports biological de-risking through concurrent RNA-protein labeling, clarifying target engagement and pathway modulation in neuronal circuits.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing neuronal subpopulations based on neurochemical signatures, reducing ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by confirming RNA integrity via positive control probes (ubiquitin C, peptidylprolyl isomerase B, RNA polymerase IIA).
- Operational Value: Enables assay standardization through optimized protease incubation and hybridization conditions, improving reproducibility across fresh-frozen and fixed tissue preparations.
- Scalability Value: Supports platform reuse for multiplex RNA-protein detection, aiding reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances translational biomarker alignment by visualizing spatial organization of mRNA and protein expression in disease-relevant brainstem nuclei (e.g., NTS).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining IHC quality post-FISH, particularly for membrane-bound targets.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decision-making by revealing lack of colocalization between GlyT2 mRNA-positive and PHOX2B mRNA-positive neurons, refining mechanistic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling spatial validation of molecular targets in neuronal populations prior to phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving RNA distribution within immunohistochemically identified neurons, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized FISH-IHC workflows, ensuring reproducible spatial readouts for compound response evaluation.
- Analytics: Generates quantitative spatial data via fluorescence signal detection, enabling comparison of RNA and protein expression levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating target expression in fixed tissue preparations, supporting biomarker-aligned disease modeling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable spatial profiling capability across neuroscience discovery programs, maximizing infrastructure investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through direct visualization of RNA-protein co-expression, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via optimized protease and hybridization steps, minimizing variability in multiplex labeling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through subcellular resolution, reducing late-stage attrition due to biological mismatch.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying neuronal subpopulations with distinct RNA-protein profiles, informing indication selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, RNA probe handling, and antibody optimization to manage signal specificity.
- Dependent on RNase-free environments, cryostat or microtome sectioning tools, and fluorescence imaging systems with appropriate filter sets.
- Necessitates cross-team standardization of protease incubation times and antibody validation protocols to ensure consistent IHC quality post-FISH.
- Requires adaptation based on protein subcellular localization, as cytoplasmic targets may need extensive troubleshooting while membrane-bound proteins show retained specificity.
- Limited by tissue handling challenges in fixed-frozen preparations, though IHC quality is superior when optimized with RNAscope.
