Name: In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie die Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen mit Proliferationsraten, 3D-Kulturen und Anker-unabhängigem Wachstum. Diese Methode ermöglicht präzise in-vitro-Analysen.

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Das Labor der AG wird vom spanischen Rat für nukleare Sicherheit finanziert. T.A. und A.G. sind Mitglieder einer von der Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503) anerkannten Forschungsgruppe. MT hat einen Vertrag, der von der Wissenschaftlichen Stiftung Asociacion Espaéola Contra el Céncer [AECC-INVES19022TERR] finanziert wird. Der G.F.-Vertrag wird durch einen Zuschuss der Cellex Foundation finanziert.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die in diesem Papier beschriebenen experimentellen Protokolle bieten nützliche Instrumente zur Bewertung der onkogenen Transformation von In-vitro-kulturierten Zellen. Jede Technik bewertet bestimmte Aspekte des Transformationsprozesses, und daher muss bei der Schlussfolgerungausarbeit aus einer einzigen Analyse besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Wachstumskurven-Aufbau ist ein Ansatz, der Informationen erfordert, die bereits verfügbar sind, wenn Zellen für andere Zwecke kultiviert werden. Das macht diese Technik ...

Für die Entwicklung von Neoplasma sind mehrere aufeinanderfolgende Ereignisse erforderlich. Im Jahr 2011 beschrieben Hanahan und Weinberg 10 Fähigkeiten, die das Wachstum, überleben und die Verbreitung transformierter Zellen ermöglichen: die sogenannten "Hallmarks of Cancer"1. Die hier beschriebene Methodik stellt drei verschiedene Werkzeuge zur Bewertung der in vitro zellulären Transformation zusammen, indem sie sich auf einige der Besonderheiten der Tumorzellen konzentriert. Diese Techniken bewerten die Zellproliferationsrate, das Verhalten von Zellen, wenn sie in 3D kultiviert werden, und ihre Fähigkeit, Kolonien mit Ankerunabhängigkeit zu bilden.
Zellmodelle sind entscheidend, um Hypothesen in vitro zu testen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um experimentelle Modelle der zellulären Transformation für die Untersuchung von Krebs zu generieren2,3,4. Da Brustkrebs weltweit die häufigste Krebsart bei Frauen ist und für etwa 15 % der Krebstoten bei Frauen5verantwortlich ist, ist die Bereitstellung geeigneter Zellmodelle von Brustepithelzellen von größter Bedeutung für die weitere Untersuchung. In diesem Artikel haben wir das Potenzial von drei Techniken zur Bewertung der zellulären Transformation anhand eines experimentellen Modells der Transformation von Breast Primary Epithelial Cells (BPECs) veranschaulicht, die ursprünglich von Ince und Kollegen im Jahr 20076 beschrieben und später in unserem Labor implementiert wurden7. Dieses experimentelle Modell basiert auf der sequenziellen Veränderung von drei gezielten Genen (SV40 Large T und small t Antigene hierin, die als Ttag, hTERTund HRASbezeichnet werden) in das Genom von nicht transformierten BPECs. Darüber hinaus begünstigt die Methode, die für die Ableitung von BPECs verwendet wird, die Aufrechterhaltung von Brustepithelzellen mit luminalen oder myoepithelialen Markern, was zu einer heterogenen Zellkultur führt, die einige der physiologischen Merkmale der Brustdrüse beibehält.
In der Brustdrüse befinden sich luminale Brustepithelzellen, die für die Milchproduktion verantwortlich sind, in der Nähe des Lumens, während Myoepithelzellen um Leuchtkörperzellen angeordnet sind und sich um Kontraktionsbewegungen kümmern, die die Milch zur Brustwarze führen. Der Verlust der richtigen Organisation zwischen diesen Zelllinien ist ein Merkmal der tumoralen Transformation8, das in vitro nach immunfluoreszierendem Nachweis von markanten Linienmarkern in 3D-Zellkulturen beurteilt werden kann. Ein weiteres wesentliches Merkmal von Tumorzellen ist ihre Fähigkeit, ohne Bindung an andere Zellen und an die extrazelluläre Matrix1zu wachsen. Wenn gesunde Zellen gezwungen werden, in Suspension zu wachsen, werden Mechanismen wie anoikis - u2012 eine Art von Zelltod induziert als Reaktion auf die Ablösung von der extrazellulären Matrix aktiviert. Die Umgehung des Zelltodes ist eines der kennzeichens Merkmale von Krebs und somit sind transformierte Zellen in der Lage, Anoikis zu inaktivieren und ankerunabhängig zu überleben. Diese Kapazität kann in vitro mit dem anchorage-unabhängigen Assay mit weichem Agar ausgewertet werden. Darüber hinaus ist ein inhärentes Merkmal von Tumorgeweben ihre anhaltende proliferative Signalfähigkeit, die leicht unter In-vitro-Bedingungen überwacht werden kann, indem der Anstieg der Zellzahl entlang der Zeit gemessen wird, nicht nur in Suspensionstests, sondern auch durch die Überwachung der Wachstumsrate von monolayer-anhaftenden Kulturen.
Trotz des besten Modells, um tumorigenic Potenzial zu testen ist die Impfung von Tumorzellen in murinen Modellen und Bewertung der Tumorentwicklung in situ, ist es wichtig, die Anzahl der Tiere in experimentellen Verfahren so weit wie möglich verwendet zu minimieren. Daher hat die Bewertung der Transformation in vitro geeignete Tests oberste Priorität. Hier stellen wir eine Reihe von Werkzeugen zur Verfügung, um das tumorgene Potenzial von teilweise und vollständig transformierten Brustepithelzellen zu bewerten, die leicht in den meisten Laboratorien implementiert werden können, die mit zellulären Transformationsmodellen arbeiten.

<table><tbody><tr><td>1 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>Dark Eppendorfs werden bevorzugt für die MTT-Langzeitlagerung</td></tr><tr><td>10 & mu; l Pipettenspitzen ohne Filter</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Glasflasche</td><td></td><td></td><td>mit Verschluss, autoklavierbar</td></tr><tr><td>1000 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; l Pipettenspitzen ohne Filter</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Röhrchen</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konische Röhrchen</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>Wird für die Fixierung der 3D-Struktur vor der Immunfluoreszenzmarkierung verwendet</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Wird für Verankerungsassays</td> verwendet</tr><tr><td>Anti-Claudin 4 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID:AB_301650</td><td>Arbeitsverdünnung 1:100, Wirt: Kaninchen</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] Antikörper</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID:AB_307087</td><td>Arbeitsverdünnung 1:100, Wirt: Maus</td></tr><tr><td>Anti-Maus Cyanin Cy3 Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Arbeitsverdünnung 1:500, Wirt: Ziege</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Arbeitsverdünnung 1:500, Wirt: Ziege</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur 24-Well-Platte</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>Wird für 3D-Kulturen in Matrigel verwendet. </td></tr><tr><td>Flachboden-Zellkultur 6-Well-Platte</td><td>Labclinics</td><td>PLC30006</td><td>Wird für Verankerungsassays</td></tr><tr><td>verwendet Zellinkubator (37 & ordm; C und 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>Maschenweite: 40 &mu; m</td></tr><tr><td>CellSense Software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Zur Bildaufnahme</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin aus Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Zur Ergänzung von Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, Dicke 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indol-6-carboxamidin</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>Wird zur Inaktivierung der Trypsinwirkung</td></tr><tr><td>verwendet Fidschi Software (ImageJ)</td><td>National Institutes of Health</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Kostenloser Download, keine Lizenz erforderlich</td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>Wird für die Immunfluoreszenz von 3D-Strukturen</td></tr> verwendet <tr><td>Hitzebeständige Handschuhe</td><td></td><td></td><td>Wird für die Agar-Manipulation nach dem Autoklaven</td></tr><tr><td>verwendet Heizbad (37 &ordm; C)</td><td></td><td></td><td>Wird zum Anlassen von Lösungen vor der Zellsubkultur verwendet</td></tr><tr><td>Heizbad (42 &ordm; C)</td><td></td><td></td><td>Wird verwendet, um Agar warm zu halten</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td></td><td></td><td>Wird für die Matrigel-Dehydrierung verwendet</td></tr><tr><td>Feuchtekammer</td><td></td><td></td><td>Wird für die Inkubation von Antikörpern während der Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>verwendet Eis</td><td></td><td></td><td>Wird während der Matrigel-Manipulation verwendet</td></tr><tr><td>Ice-box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses optisches Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>Store bei -20 &ordm; C und während des Gebrauchs kalt halten. Bezeichnet als Basalmembranmatrix</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>Wird für die Fixierung der 3D-Struktur vor der Immunfluoreszenzmarkierung</td></tr><tr><td>verwendet Mikropipette</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 und p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Wird verwendet, um die Verdopplung der Population zu berechnen und die Wachstumsratengleichung</td></tr><tr><td>zu erhalten MilliQ Wasser</td><td></td><td></td><td>Wird als Reinstwasser</td></tr><tr><td>bezeichnet Nagellack</td><td></td><td></td><td>Wird verwendet, um Proben nach dem Aufsetzen zu versiegeln</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Wird verwendet, um Antikörperlösung während der Inkubation abzudecken</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (ohne Kalzium und Magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Steril. Verwendet für die Zellsubkultur</td></tr><tr><td>PBS-Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>In milliQ-Wasser verdünnen. Keine Sterilität erforderlich. Wird für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>verwendet Pipettenhilfe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25-Kolben</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>Wird für BPEC-Kulturen</td></tr><tr><td>verwendet Zepter Automatisierter Zellzähler</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternativ können Sie eine Hämozytometer-Schere</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> verwenden <td>Zum Schneiden von Pipettenspitzen und Parafilm</td></tr><tr><td>Sterilfilter 0,22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Zur Filterung der MTT-Lösung</td></tr><tr><td>Thiazolylblau, Tetrazoliumbromid (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>Bei -20 & ordm; lagern; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Wird für die Immunfluoreszenz von 3D-Strukturen verwendet</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10X</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>Verdünnt in PBS, um 3X-Lösung</td></tr><tr><td>zu erhalten Vectashield Antifade Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC Kulturmedium</td><td>Stemgent</td><td>00-0051</td><td>Wird für primäre BPEC-Kultur</td></tr><tr><td>WIT-T verwendet Nährmedium</td><td>Stemgent</td><td>00-0047</td><td>Wird für transformierte BPEC-Kulturen</td></tr></tbody></table> verwendet

in vitro-bewertung der onkogenen transformation in menschlichen mammaepithelzellen

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenese ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem Zellen Fähigkeiten erwerben, die ihr Wachstum, überleben und verbreiten unter feindlichen Bedingungen ermöglichen. Verschiedene Tests zielen darauf ab, diese Merkmale von Krebszellen zu identifizieren und zu quantifizieren; Sie konzentrieren sich jedoch häufig auf einen einzigen Aspekt der zellulären Transformation, und tatsächlich sind mehrere Tests für ihre korrekte Charakterisierung erforderlich. Ziel dieser Arbeit ist es, Forschern eine Reihe von Instrumenten zur Verfügung zu stellen, um die zelluläre Transformation in vitro aus einer breiten Perspektive zu bewerten und so fundierte Schlussfolgerungen zu ziehen.
Eine nachhaltige proliferative Signalaktivierung ist das Hauptmerkmal von Tumorgeweben und kann leicht unter In-vitro-Bedingungen überwacht werden, indem die Anzahl der im Laufe der Zeit erreichten Bevölkerungsverdoppelungen berechnet wird. Außerdem ermöglicht das Wachstum von Zellen in 3D-Kulturen ihre Interaktion mit umgebenden Zellen, ähnlich dem, was in vivo vorkommt. Dies ermöglicht die Bewertung der zellulären Aggregation und zusammen mit der immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von ausgeprägten zellulären Markern, Um Informationen über ein weiteres relevantes Merkmal der Tumortransformation zu erhalten: den Verlust der richtigen Organisation. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal transformierter Zellen ist ihre Fähigkeit, ohne Bindung an andere Zellen und an die extrazelluläre Matrix zu wachsen, die mit dem Anker-Assay ausgewertet werden kann.
Detaillierte experimentelle Verfahren zur Bewertung der Zellwachstumsrate, zur immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von Zelllinienmarkern in 3D-Kulturen und zur Erprobung des verankerungsunabhängigen Zellwachstums in weichem Agar werden bereitgestellt. Diese Methoden sind für primäre Epithelzellen (BPEC) der Brust aufgrund ihrer Relevanz bei Brustkrebs optimiert; Nach einigen Anpassungen können jedoch Prozeduren auf andere Zelltypen angewendet werden.

Ein experimentelles Modell der zellulären Transformation mit der Einführung von drei genetischen Elementen in BPECs wurde gewählt, um repräsentative Ergebnisse der onkogenen Transformation zu generieren6,7 ( Abbildung3). Nicht transformierte BPECs (N) wurden aus krankheitsfreiem Brustgewebe abgeleitet, wie von Ince und Kollegen6 beschrieben und gemäß dem hier angegebenen Protokoll kul...

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Diese Methodik nutzt die Integration verschiedener Indikatoren, um den Grad der Transformation eines Zellmodells zu bewerten. Diese Technik bietet den Forschern eine Reihe von zeitaufwändigen, aber einfach zu bedienenden Instrumenten zur Beurteilung der Zelltransformation in vitro. Dadurch kann die Methode in den meisten Laboren eingesetzt werden.Teresa Anglada, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, und Joan Repulles, eine Spezialistin für Mikroskopie, werden das Verfahren vorführen. Wenn die primäre Epithelzellkultur der Brust eine Konfluenz von 90 % erreicht, wird der Überstand aus dem Kulturkolben in ein 15-Liter-Röhrchen mit zwei Millilitern fötalem Rinderserum überführt und die Zellen mit PBS gewaschen. Behandeln Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einem Milliliter Trypsin.Wenn sich die Zellen abgelöst haben, inaktivieren Sie das Trypsin mit dem reservierten Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Schnippen Sie mit dem Röhrchen, um das Pellet wieder zu suspendieren, und fügen Sie ein bis zwei Milliliter frisches Medium zum Zählen hinzu. Nach der Bestimmung der Zellkonzentration werden 300.000 Zellen in ein neues Röhrchen gegeben und das endgültige Volumen mit zusätzlichem frischem Kulturmedium auf fünf Milliliter gebracht.Keimen Sie die Zellen in einen neuen T25-Kolben und geben Sie die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück. Verwenden Sie dann die Formel, um die Anzahl der kumulierten Bevölkerungsverdopplungen zu berechnen. Um die Proliferationsrate der Zellen zu beurteilen, stellen Sie die kumulierte Anzahl der Populationsverdopplungen für ein bestimmtes Zeitintervall dar.Eine erhöhte Steigung deutet auf eine erhöhte Zellproliferationsrate hin. Um eine 3D-Zellkultur einzurichten, spülen Sie Vertiefungen mit einer Oberfläche von 1,9 Quadratzentimetern mit kaltsterilem PBS und beschichten Sie den Boden jeder Vertiefung mit 100 Mikrolitern Basalmembranmatrix. Legen Sie die Platte dann für ca. 20 Minuten in den Zellkultur-Inkubator, damit sich die Matrix verfestigen kann.In der Zwischenzeit werden Brustzellen wie gerade demonstriert entnommen und die Zellen auf 400.000 Zellen pro Milliliter mittlerer Konzentration verdünnt. Mischen Sie die Zellen mit frischem Medium, das mit einer 8%igen Basalmembranmatrix im Verhältnis eins zu eins ergänzt wird, und geben Sie 500 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung der verfestigten Matrix. Inkubieren Sie die Zellen einige Minuten lang bei 37 Grad Celsius und geben Sie dann 500 Mikroliter Medium, das mit einer 4%igen Basalmembranmatrix ergänzt ist, in jede Vertiefung.Legen Sie die Zellen für 14 Tage in den Zellkultur-Inkubator. Die ausgesäten Zellen gruppieren sich und vermehren sich, um acini-ähnliche Strukturen zu bilden. Für den Nachweis von immunfluoreszierenden Proteinen in den 3D-kultivierten Brustzellen verwenden Sie eine abgeschnittene P200-Pipettenspitze, um die Basalmembranmatrix aus jeder Vertiefung zu entfernen, und schmieren Sie etwa 50 Mikroliter disaggregierte Matrix aus jeder Vertiefung auf einzelne Glasobjektträger.Wenn die Proben vollständig getrocknet sind, fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit einer Eins-zu-Eins-Methanol-Aceton-Lösung bei minus 20 Grad Celsius. Nach dem Fixieren werden die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung blockiert. Am Ende der Inkubation fügen Sie 30 Mikroliter der primären Antikörper-Arbeitslösung von Interesse hinzu und bedecken Sie die Objektträger mit einem Streifen Laborverpackungsfolie für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius in einer feuchten Kammer.Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen dreimal eine Stunde lang pro Waschgang mit PBS und markieren Sie die Proben mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung, wie gerade gezeigt. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben zweimal pro Waschgang zwei Stunden lang in PBS, bevor Sie sie mit DAPI, verdünnt in Anti-Fade-Eindeckmedium, gegenfärben und jeden Objektträger mit einem Deckglas abdecken. Analysieren Sie dann die Fluoreszenzsignalverteilung für jeden Acinus an einem konfokalen Mikroskop.Um einen verankerungsunabhängigen Assay durchzuführen, bedecken Sie zunächst den Boden der entsprechenden Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,5 Millilitern 0,6%-Agar in mittlerer Lösung und lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Bereiten Sie als nächstes eine Lösung von fünf mal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter vor und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Halten Sie das Röhrchen in einem 45-Grad-Winkel und fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,6 % Agar in mittlerer Lösung an der Wand des Röhrchens hinzu.Und nach gründlichem Mischen schichten Sie einen Milliliter der Zellen in Agarsuspension in jede Vertiefung der zuvor vorbereiteten Sechs-Well-Platte. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen homogen im Agar verteilt wurden. Wenn der Agar vollständig erstarrt ist, geben Sie vorsichtig einen Milliliter Auffrischungsmedium in jede Vertiefung, ohne den Agar zu stören, und inkubieren Sie die Zellen drei Wochen lang, wobei Sie das Medium zweimal pro Woche wechseln.Ersetzen Sie das Medium am Ende der Koloniebildungsphase durch einen Milliliter eines Milligramms pro Milliliter MTT pro Vertiefung für eine 24-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie am nächsten Tag das MTT aus jeder Vertiefung und nehmen Sie Bilder von jeder Vertiefung mit dem inversen Mikroskop auf. Wenn alle Bilder erfasst wurden, öffnen Sie die Bilder in ImageJ und klicken Sie auf Bild, Anpassen, Schwellenwert und Anwenden, um eine binäre Maske durch Schwellenwertsetzung des Originalbilds zu erhalten.Wenn gut abgegrenzte Kolonien erhalten wurden, wählen Sie Plugins und Biovoxxel aus, um den erweiterten Partikelanalysator zur Identifizierung der MTT-positiven Kolonien zu starten. Über einen bestimmten Zeitraum erreichen teilweise und vollständig transformierte Zellen im Vergleich zu nicht transformierten Zellen eine höhere Anzahl von Populationsverdopplungen, was darauf hindeutet, dass die Zellteilungsrate mit dem Transformationsprozess erhöht wird. Während der zweiwöchigen 3D-Zellkulturperiode aggregieren und vermehren sich die Zellen, wodurch sich die Acini-Größe erhöht.Die richtige Polarisation jedes Acinus kann mit Hilfe der Protein-Immunfluoreszenzdetektion in Verbindung mit der dreidimensionalen Signallokalisierung durch konfokale Mikroskopie genau bestimmt werden. Während alle Acini, die von nicht transformierten Brustzellen gebildet werden, richtig organisiert sind, wird ein Polarisationsverlust bei Acini beobachtet, die von teilweise und vollständig transformierten Zellen gebildet werden. Nach drei Wochen eingebetteter Agarkultur bilden Zellen mit einer verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität Kolonien, die aus mehreren Zellen bestehen.Nur metabolisch aktive Zellen sind in der Lage, den Tetrazolium-MTT-Ring zu spalten, was nach 24 Stunden zu violetten MTT-Formazan-Kristallen führt. Die Messung des Koloniedurchmessers durch automatische Bildanalyse ermöglicht die Filterung von niedrig proliferativen Kolonien oder einzelnen Zellen. Die Anzahl der Kolonien, die von nicht transformierten Zellen gebildet werden, ist im Vergleich zu denen aus teilweise und vollständig transformierten Zellen vernachlässigbar.Die Koloniegröße kann auch verwendet werden, um zwischen Zellen mit unterschiedlichem Transformationsgrad zu unterscheiden. Diese Assays können zum Screening von Zelllinien vor jeder Inokulation verwendet werden, da nur die Zelllinien, die in vitro positiv getestet wurden, in Mäuse geimpft werden sollten.

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Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Bericht zeigen wir ein System zur Isolierung und Kultur Spenderzellen von der Maus Brustdrüse und orthotop Transplantation dieser Zellen in Empfängermäuse zu Stromatumoren analysieren: epitheliale Interaktionen während Mammatumor Entwicklung.

Mammary Transplantation von Stromazellen und Carcinoma Cells in C57BL/6J-Mäuse

Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Der Fokus Formation Assay bietet eine einfache Methode, um die transformierende Potential eines Kandidaten Onkogen zu bewerten.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden.  Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Der In-vitro-Zellinvasionstest wird verwendet, um das Potenzial von Krebsmetastasen zu messen, indem das zelluläre Potenzial für Invasion und Migration mithilfe von Zellkultureinsätzen, die Proteinmatrix enthalten, quantifiziert wird. Die Zellen werden herausgefordert, durch die Proteinmatrix und eine poröse Membran in Richtung eines Chemoattractants zu wandern und dann durch Lichtmikroskopie quantifiziert zu werden.

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intraduktale Injektion von viralen Vektoren über die Zitze, um Gene von Interesse in die Brustepithelzellen einzuschleusen.

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Lernen Sie die Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen mit Proliferationsraten, 3D-Kulturen und Anker-unabhängigem Wachstum. Diese Methode ermöglicht präzise in-vitro-Analysen.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

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