Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse
27. Oktober 2020
Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode zur Messung und Visualisierung von FRET- oder zyklischen AMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen in einzelnen Zellen bietet. Zyklische AMP-Verteilungen können nicht nur lateral, sondern auch axial auftreten, und es ist wichtig, zyklische FRET-AMP-Bilddaten in drei Dimensionen zu erfassen, um diese Verteilungen abzutasten. Am Tag der Bildgebung puffern warme Tyroden in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius und montieren einen Deckschirm mit den transfizierten Zellen des Interesses in eine Zellkammer.
Sichern Sie die Oberseite der Kammer mit einer Montagedichtung, um ein Auslaufen zu verhindern, und verwenden Sie einen Feinabwischer, um überschüssiges Medium oder anhaftende Zellen von der Unterseite des Deckglases zu entfernen. Geben Sie 800 Mikroliter Arbeitspuffer und vier Mikroliter fünf Millimolare Kernmarkierung in die Zellkammer und schütteln Sie die Kammer vorsichtig für fünf bis 10 Sekunden. Decken Sie dann die Zellkammer für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit Alufolie ab.
Um die Zellen abzubilden, wählen Sie das 60-fache Wasserimmersionsobjektiv an einem konfokalen Mikroskop, das mit einem Spektraldetektor ausgestattet ist, und geben Sie einen Tropfen Wasser in das Objektiv. Platzieren Sie die bestückte Zellkammer auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Filterknopf ein, um das passende Filterset auszuwählen. Wählen Sie den Fluoreszenz-Weitfeldmodus und verwenden Sie die Okulare, um ein Sichtfeld auszuwählen, das Zellen enthält, die den zyklischen FRET-AMP-Sensor exprimieren.
Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, wählen Sie den konfokalen Modus und entsperren Sie die Laserverriegelungstaste. Öffnen Sie das A1-Einstellungsmenü. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die Laserlinien 405 und 561 Nanometer und stellen Sie diese spektralen Detektionen auf SD, die Auflösung auf 10 und die Kanäle auf 32 ein.
Wählen Sie die Werte für die Start- und Endwellenlänge aus, um den Wellenlängenbereich festzulegen. Öffnen Sie das Menü A1-Einstellungen, um das Symbol zum Überspringen von Binning auszuwählen. Wählen Sie das Feld mit der Zahl 15 aus und klicken Sie auf OK. Stellen Sie die Laserintensitäten für den 405-Nanometer-Laser auf acht Prozent und für den 561-Nanometer-Laser auf zwei Prozent ein.
Stellen Sie die Detektorverstärkung auf 149 und den Lochblendenradius auf 2,4 Airy-Scheibeneinheiten ein. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 25 Spektralbilder pro Sekunde ein und wählen Sie die unidirektionale Scanrichtung aus. Legen Sie die Anzahl auf vier und die Scangröße auf 1024 x 1024 fest.
Um die Z-Stack-Erfassungsparameter zu definieren, klicken Sie auf Ansicht, Erfassungssteuerung und ND-Erfassung und geben Sie das Dateiziel und den Namen in das Popup-Fenster ein, um die ND-Datei zu speichern. Klicken Sie auf das Feld für die Z-Serie und dann im Fenster "A1 Plus-Einstellungen" auf "Live", um ein Live-Anzeigefenster zu öffnen. Stellen Sie den Fokusregler so ein, dass die Zellen im Vorschaufenster fokussiert werden.
Stellen Sie den Fokusregler am Mikroskop ein, um den oberen Rand der Fassung auszuwählen, und klicken Sie im ND-Aufnahmefenster auf oben, um die aktuelle Position als obere Position festzulegen. Stellen Sie den Fokusknopf am Mikroskop ein, um den unteren Rand der Zelle auszuwählen, und klicken Sie auf Unten, um die aktuelle Position als untere Position festzulegen. Geben Sie ein Mikrometer für die Schrittweite ein.
Wählen Sie Oben Unten als Z-Scan-Richtung aus, und klicken Sie auf Ausführen, um einen Z-Stapel zu erhalten. Wenn die Erfassung des Z-Stapels abgeschlossen ist, geben Sie mit einer Pipette das gewünschte Reagenz vorsichtig in die Kammer, ohne die Zellen zu stören. Ändern Sie nach 10 Minuten den Dateinamen und rufen Sie ein zweites Z-Stack-Image ab.
Erstellen Sie nach dem Imaging neue Ordner mit denselben Dateinamen wie die spektralen Z-Stapel-Bilder und öffnen Sie die gewünschte Spektralbilddatei. Klicken Sie auf Datei, Importieren/Exportieren und ND-Dokument exportieren. Wählen Sie im Popup-Fenster den neu erstellten Ordner, TIFF für den Dateityp, Mono-Bild für jeden Kanal und behalten Sie die Bittiefe bei.
Klicken Sie auf Exportieren, um die einzelnen Dateien in den Ordner zu exportieren und die Software zur linearen spektralen Entmischung zu öffnen. Öffnen Sie die Option Lineare Entmischung. m und klicken Sie auf Ausführen.
Durchsuchen Sie den Ordner, der die exportierte TIFF-Dateisequenz enthält, wählen Sie ihn aus und klicken Sie auf OK, um das Wellenlängen- und Z-Slice-Fenster zu öffnen. Kopieren Sie den Dateinamen der ersten Datei ohne die Z-Slice- und Kanalnummer aus dem Ordner und fügen Sie ihn in den ersten Schritt des Felds Enter of the imagename ein, geben Sie die Anzahl der Kanäle in das Feld Geben Sie die Anzahl der Wellenlängenbänder ein und die Anzahl der Z-Slices in das Feld Geben Sie die Anzahl der Z-Slices ein und klicken Sie auf OK. Durchsuchen Sie dann im Popup-Fenster die Wellenlänge und wählen Sie sie aus. mat-Datei und klicken Sie auf Öffnen.
Durchsuchen und wählen Sie die Datei Library. mat im neuen Popup-Fenster aus und klicken Sie erneut auf Öffnen, um das Aufheben der Slice-Mischung zu starten. Um den FRET-Wirkungsgrad zu berechnen, öffnen Sie den multiFRRCF.
m Programmierskript und geben Sie die Anzahl der zu analysierenden experimentellen Versuche in das Feld Wie viele Ordner sollen neu geschnitten werden. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie die nicht gemischten Ordner aus, und klicken Sie erneut auf OK. Legen Sie im neuen Popup-Fenster den Skalierungsfaktor auf 12,4, den Schwellenwert auf 56, die X-, Y- und Z-Frequenz auf fünf, fünf bzw. eins und den Glättungsalgorithmus auf Gauß fest.
Klicken Sie dann auf Ausführen, um die FRET-Messungen und das Reslicing durchzuführen. Um den FRET-Wirkungsgrad auf zyklische AMP-Pegel abzubilden, öffnen Sie das Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m und klicken Sie auf Ausführen.
Navigieren Sie zum ersten Graustufen-FRET-Bild, wählen Sie es aus und klicken Sie auf OK. Öffnen Sie dann die zyklischen FRET-AMP-Bilder, um die Verteilung der zyklischen AMP-Signale in drei Dimensionen zu überprüfen. In diesen Bildern sind dreidimensionale Ansichten von hyperspektralen Rohbilddaten in falscher Farbe, die mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zu Studienbeginn und 10 Minuten nach der Forskolin-Behandlung aufgenommen wurden, zu beobachten. In dieser Analyse wurde ein Akzeptorfluorophor vollständig photodestruktiv, so dass spektrale Signaturen des Donors und des Akzeptors mit einer Eins-zu-Eins-Stöchiometrie erhalten werden konnten.
Nicht transfizierte Zellen, die mit einem Kernfarbstoff markiert waren, wurden verwendet, um das reine Spektrum des Farbstoffs Fluorophor zu erhalten. Die Kombination der Spektren der Donor-, Akzeptor- und Kernfarbstoff-Fluorophore ermöglicht die Erstellung einer Drei-Komponenten-Bibliothek. Hier können die Quellen von drei spektralen Hintergrundsignaturen beobachtet werden.
Obwohl diese Signale ungleichmäßig innerhalb der Probe verteilt sind und nicht einfach subtrahiert werden können, bietet das Hinzufügen der spektralen Signaturen dieser Signale zur Spektralbibliothek und die Verwendung einer linearen Entmischung zur Trennung der Signale einen Ansatz, um diese Störsignale aus den Donor- und Akzeptorsignalen zu entfernen, bevor ihre FRET-Effizienz berechnet wird. Die Spektralbibliothek mit sechs Komponenten kann dann verwendet werden, um eine lineare spektrale Entmischung für jede Schicht im axialen Bild durchzuführen. Hier können die Veränderungen der FRET-Effizienz und der zyklischen AMP-Spiegel in verschiedenen Schichten der XY-Ebene beobachtet werden, was einen Vergleich zwischen den Ausgangsbedingungen und den Bedingungen 10 Minuten nach der Forskolin-Behandlung ermöglicht.
Diese Technik könnte auch verwendet werden, um die FRET-Effizienz anderer Reporter in drei Dimensionen sowohl in Zellen als auch in Geweben zu quantifizieren.
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Übersicht
Diese Studie behandelt die Herausforderungen bei der Messung von cAMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen mithilfe von auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden Sensoren. Sie stellt eine neuartige hyperspektrale FRET-Bildgebungsmethode vor, die die Visualisierung und Messung der cAMP-Verteilung innerhalb einzelner Zellen ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- cAMP-Signaltransduktion
- FRET-Aufnahmetechnologie
- Zelluläre Dynamik in drei Dimensionen
Hintergrund
- Geringes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) bei herkömmlichen FRET-Sensoren
- Bedeutung dreidimensionaler cAMP-Messungen
- Anwendungen in zellulären Signalwegen
Verwendete Methoden
- Hyperspektrale Bildgebung für die FRET-Analyse
- Konfokale Mikroskopie zur Bildgebung
- Lineare spektrale Entmischungstechniken
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche dreidimensionale Messung der cAMP-Verteilung
- Visualisierung zellulärer Reaktionen auf die Behandlung mit Forskolin
- Nachgewiesene Eignung der linearen Entmischung zur Signaltrennung
Schlussfolgerungen
- Diese Methodik bietet einen robusten Rahmen, um cAMP-Dynamiken mit hoher Auflösung zu untersuchen.
- Sie vertieft das Verständnis von Signalwegen in der Zellbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Eine präzise räumliche Kartierung der Dynamik von sekundären Botenstoffen ist entscheidend, um Risiken bei der Zielvalidierung in GPCR- und Adenylatzyklase-Wegen zu minimieren. Dieser hyperspektrale FRET-Ansatz ermöglicht eine dreidimensionale Auflösung von cAMP-Signalen und verringert mechanistische Unschärfen in Studien zur subzellulären Kompartimentierung. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem räumliche cAMP-Muster mit funktionellen zellulären Reaktionen verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Auflösung der cAMP-Kompartmentalisierung in drei räumlichen Dimensionen.
- Operativer Wert: Bietet funktionelle Zielvalidierung durch die Visualisierung wegweisspezifischer Signalisierungsmuster in lebenden Zellen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem räumliche cAMP-Verteilungen mit phänotypischen Ergebnissen nach pharmakologischer Störung korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative, räumlich aufgelöste FRET-Effizienz-Messwerte, die für High-Content-Screening-Formate geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet lineare spektrale Entmischung, um Autofluoreszenz und spektralen Übersprechen zu minimieren und verbessert so die Signalzuverlässigkeit zwischen Wiederholungen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit der Anpassung an Mehrfach-Well-Platten zur Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf subzelluläre cAMP-Dynamiken.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Anwendbar auf pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen und unterstützt translationsmedizinische Studien zu vaskulären Signalwegen.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Klärt, ob beobachtete cAMP-Änderungen auf eine echte Modulation des Signalwegs oder auf Artefakte der Bildgebung aufgrund spektraler Überlappung zurückzuführen sind.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht die langfristige Verfolgung von cAMP-Dynamiken von der Entdeckung bis zur funktionellen Validierung in klinisch relevanten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung des Targets bis hin zur Optimierung des Leads ein, indem sie räumlich aufgelöste, quantitative Messwerte der Sekundärbotteraktivität liefert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Abbildung der cAMP-Dynamik als Reaktion auf GPCR-Agonisten oder Adenylatzyklase-Modulatoren.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, dreidimensionale cAMP-Daten mit reduzierten falsch-positiven Ergebnissen durch spektrale Interferenzen.
- Analytik: Erstellt Karten der FRET-Effizienz und cAMP-Konzentration, die Vergleiche zwischen Behandlungsbedingungen und genetischen Störungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht Anschluss an präklinische Arbeiten durch Anwendung in primären endothelialen Zellen und Anpassungsfähigkeit an Krankheitsmodelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare bildgebende Kernkompetenz zur Untersuchung räumlicher Signalübertragung in mehreren Systemen von sekundären Botenstoffen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in der cAMP-Signalübertragung, indem axiale und laterale Verteilungen aufgelöst werden.
- Operativer Wert: Standardisiert FRET-Messungen durch spektralbibliotheksbasierte Entmischung und reproduzierbare Aufnahmeparameter.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem räumlich kontextualisierte Daten zur Zielstrukturenbindung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf der subzellulären Signalübertragungstreue.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der hyperspektralen Bildgebung, spektralen Entmischung und Validierung von FRET-Biosensoren.
- Setzt eine konfokale Mikroskopie mit spektralem Detektor und 32-Kanal-Detektionsfähigkeit voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Erstellung der Spektralbibliothek und der Festlegung der Entmischungsparameter.
- Die Anpassung an andere Zelltypen kann eine Optimierung der Markierungsdichte und der Z-Stapel-Parameter erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören das Risiko der Photobleiche während längerer Z-Stapel-Aufnahmen sowie der hohe Rechenaufwand bei der spektralen Bildverarbeitung.
