Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Die Methode ermöglicht nanoskalige Untersuchungen von Bakterien. Es gibt uns einen detaillierten Einblick in die chemischen Veränderungen der Antibiotikaresistenz. Daher kann es zu unserem Verständnis von AMR und der Arzneimittelentwicklung beitragen.

Die nanoskalige Größe von Bakterien schränkt die verfügbaren Forschungsinstrumente, die ihre Chemie untersuchen können, erheblich ein. AFM-IR ermöglicht es uns, dies auf eine zerstörungsfreie, beobachterunabhängige Weise zu tun, sogar auf subzellulärer Ebene. Durch einen Einblick in die Antibiotikaresistenz kann die Methode helfen, molekulare Angriffspunkte für neue antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren und zu testen.

Neben Bakterien kann das AFM-IR eine Reihe von Zellen, Geweben und sogar Viren untersuchen. Um eine Probe für die AFM-IR-Bildgebung vorzubereiten, verwenden Sie nach dem Züchten der interessierenden Bakterien auf dem geeigneten Medium unter den geeigneten Kulturbedingungen eine sterile Schlaufe, um vorsichtig Bakterien von der Oberseite der Kolonien zu entnehmen, um sie in ein Glasröhrchen zu übertragen. Geben Sie einen Milliliter Reinstwasser in das Röhrchen und wirbeln Sie es ein bis zwei Minuten lang, bis das gesammelte Bakterienpellet am Boden des Röhrchens nicht mehr sichtbar ist.

Schätzen Sie die grobe Trübung der Lösung durch visuellen Vergleich zwischen der vorbereiteten Lösung und den McFarland-Standards. Wenn die Trübung der Bakteriensuspension sehr gering zu sein scheint, fügen Sie weitere Bakterien hinzu und wirbeln Sie so lange, bis die grobe Trübung der Lösung mit den McFarland-Standards von 0,5 und 1 vergleichbar ist. Die Bakterien werden durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand wird vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt.

Resuspendieren Sie das Bakterienzellpellet in einem Milliliter Reinstwasser mit Vortexing und sedimentieren Sie die Bakterien mit einer weiteren Zentrifugation. Nachdem Sie die Bakterien wie gerade gezeigt bis zu drei weitere Male gewaschen haben, aspirieren Sie den Überstand und wirbeln das Pellet mindestens zwei Minuten lang, bevor Sie fünf Mikroliter Zellen auf das Versuchssubstrat geben. Handelt es sich bei der gewünschten Dicke um eine Monoschicht oder einzelne Bakterien, geben Sie unmittelbar nach dem Abscheiden zwischen 20 und 100 Mikroliter Reinstwasser auf das Substrat und mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipettenspitze an.

Wenn die Probe an der Luft getrocknet ist, verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um das Substrat auf eine AFM-Metall-Probenscheibe zu montieren. Um das AFM-IR-Spektroskopie-Instrument für eine Analyse vorzubereiten, drücken Sie nach dem Einschalten der Software und des Lasers auf Initialisieren und vergewissern Sie sich, dass sich der Laserverschluss in der geöffneten Position befindet. Während dieses Vorgangs wird das Fenster Phaseninitialisierung angezeigt.

Wenn der Initialisierungsvorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Initialisieren und dann auf OK. Schalten Sie nach Möglichkeit den Stickstofffluss ein, um das Gerät mit Stickstoff zu spülen, und stellen Sie die Stickstoffspülung so ein, dass ein stabiles Feuchtigkeitsniveau erreicht wird. Legen Sie die Probe vorsichtig in die Probenkammer, ohne die Spitze zu beschädigen, und klicken Sie in der Software auf Laden. Folgen Sie dem Assistenten, um die Probe zu laden, und konzentrieren Sie sich dabei in jedem Schritt auf die Spitze und die Probe.

Klicken Sie dann auf Ansatz, um sich der Probe zu nähern, ohne sich zu engagieren. Bevor Sie das Sample aktivieren, wählen Sie "Werkzeuge", "IR-Hintergrundkalibrierung" und "Neu". Stellen Sie im Popup-Fenster die Auflösung und den Spektralbereich entsprechend dem Ziel der Analyse ein und setzen Sie die Co-Mittelwerte und die Hintergründe auf Durchschnittswerte.

Wählen Sie Aktivieren aus. Legen Sie im Popup-Fenster die Start- und Endparameter fest und klicken Sie auf Akzeptieren und Übernehmen. Wenn die Hintergrunddaten abgerufen wurden, klicken Sie auf Speichern.

Um den Tipp mit dem Beispiel zu verknüpfen, klicken Sie auf Übernehmen. Das System nähert sich der Probenoberfläche, bis ein direkter Kontakt erkannt wird. Klicken Sie auf Scannen, um ein erstes AFM-Bild mit größerer Fläche und geringer räumlicher Auflösung aufzunehmen, um die Oberfläche zu visualisieren, bevor Sie die Spitze an einen relevanten Messpunkt bewegen.

Um den Infrarotlaser auf eine Wellenzahl auszurichten, bei der die Probe absorbiert wird, geben Sie die Wellenzahl, bei der die Probe absorbiert wird, in das Feld Wellennummer ein und klicken Sie auf Start IR.At mindestens ein deutlicher Peak im Diagramm Amplitude versus Frequenz beobachtet werden sollte. Das Diagramm Ablenkung über Zeit sollte eine periodische Wellenform anzeigen. Klicken Sie auf Optimieren, um ein herkömmliches Infrarot-Bakterienspektrum auszuwählen, um die Positionen der Bänder zu identifizieren, und verwenden Sie das Spektrum, um die Hotspots bei verschiedenen Wellenzahlwerten aus verschiedenen Spektralbereichen zu optimieren.

Wenn die Infrarot-Spots für ausgewählte Wellenzahlwerte optimiert wurden, definieren Sie die spektrale Auflösung sowie den Bereich und die Anzahl der Co-Mittelwerte und klicken Sie auf Erfassen, um das AFM-IR-Spektrum zu erfassen. Um ein Intensitätsverteilungsbild für einen ausgewählten Wellenzahlwert zu erfassen, nehmen Sie nach der Aufnahme eines einzelnen AFM-IR-Spektrums ein AFM-Bild des ausgewählten Probenbereichs auf und wählen Sie die Wellenzahlwerte für die AFM-IR-Bildgebung aus. Vergewissern Sie sich, dass der IR-Spot des Lasers für die ausgewählten Wellenzahlwerte optimiert wurde, und stellen Sie die Anzahl der Datenpunkte in X- und Y-Richtung des Bildbereichs ein.

Stellen Sie im Fenster Allgemein die Laserleistung ein. Definieren Sie im Fenster "AFM-Scan" die Abtastrate. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen IR-Bildgebung aktivieren und klicken Sie auf Scannen, um die Bildgebung zu starten.

Das AFM-IR der Intensität des Signals bei der gewählten Wellenzahl wird gleichzeitig mit den AFM-Daten aus diesem Bereich erfasst. Dieses Protokoll ermöglicht die Erfassung einer Reihe von Arten von Bakterienzellverteilungen auf einem Substrat, von Einzelzellen bis hin zu Monolayern und Multilayern. Das Protokoll kann verwendet werden, um dynamische Veränderungen in lebenden Bakterien zu überwachen.

Zum Beispiel bei der Bildung eines Septums während der Zellteilung von S.aureus. Das AFM-IR-Spektrum des Septums war durch eine höhere relative Intensität der Banden bei 1.240 und 1.090 Zentimetern im Vergleich zu AFM-IR-Spektren gekennzeichnet, die aus dem Zellbereich gesammelt wurden, was darauf hindeutet, dass das Septum aus Kohlenhydrat- und Phosphodiestergruppen von Zellwandkomponenten besteht. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung zu untersuchen, die sich aus der Entwicklung von Resistenzen ergeben.

Wie in dieser repräsentativen Analyse beobachtet, wurden keine morphologischen Unterschiede zwischen der intermittierenden Vancomycin-Resistenz und Vancomycin-anfälligen S.aureus-Zellen gemessen. Die Auswertung der AFM-IR-Spektren und ihrer zweiten Derivate ergab jedoch einen deutlichen Anstieg der relativen Intensität der Banden, die mit den Kohlenhydrat- und Phosphodiestergruppen aus den Zellwandkomponenten im resistenten Stamm im Vergleich zum anfälligen Gegenstück assoziiert sind. Es ist wichtig, eine saubere Probe vorzubereiten, also achten Sie darauf, den Mediumsbeitrag von Anfang an zu reduzieren und ihn bei mehreren Wäschen vollständig zu entfernen.

Da es sich bei der AFM-IR um eine zerstörungsfreie Technik handelt, kann die Probe später mit anderen Techniken wie Färberei oder konfokaler Ionenspektroskopie untersucht werden, die ergänzende Informationen über ihre Chemie liefern können.