Name: Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Lernen Sie eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Medikamentengabe bei fünf Tage alten neonatalen Ratten durch direkte Sichtbarkeit. Diese Technik verbessert die Überlebensraten und reduziert Schmerz sowie Blutungen erheblich.

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Diese Arbeit wurde teilweise von R01HD090887-01A1 von NICHD nach AH unterstützt. Die Autoren erkennen auch die Einrichtungen des Labors von Dr. Peter Mc Farlane an, wie z. B. das Inhalationsanästhesie- / Heizkissensystem. Frau Catherine Mayers wertvolle Unterstützung beim Aufbau des Systems wird geschätzt. Die Fördereinrichtung spielte keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Sammlung, Analyse und Interpretation der Daten oder beim Verfassen des Manuskripts.

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll # 2020-0035) an der Case Western Reserve University genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt.
1. Tiere
<ol><li>Erhalten Sie kommerziell trächtige Sprague Dawley Ratten.</li>
	<li>Halten Sie Tiere in einer zugelassenen tierärztlichen Einrichtung mit 14 h / 10 h Hell-Dunkel-Zyklus und 45-60% relativer Luftfeuchtigkeit.</li>
</ol>2. Herstellung der Prüfmasse
<ol><li>Verwenden Sie Evans blauen Farbstoff als Testverbindung, um die Wirksamkeit des intratrachealen Instillationsverfahrens zu beurteilen.</li>
	<li>Es wird eine 0,25%ige (w/v) Lösung des Farbstoffs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) hergestellt und mit einem 0,45 μm Spritzenfilter sterilisiert.</li>
</ol>3. Verabreichung der Anästhesie
<ol><li>Anästhesieren Sie Rattenwelpen mit Gasanästhesie (3% Isofluran in 100% Sauerstoff), wobei ein modifiziertes Abgabesystem verwendet wird, das für kleine Rattenneugeborene geeignet ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie auf den Verlust von Schwanz- und Pedalreflexen und flache Atmung, um die richtige Tiefe der Anästhesie für die Durchführung des Eingriffs sicherzustellen.</li>
</ol>4. Intratracheale Instillation (ITI)
<ol><li>Verwenden Sie Rattenwelpen am postnatalen Tag 5 (PN 5) für das ITI. Das Durchschnittsgewicht eines PN 5-Rattenwelpen beträgt 12 Gramm.</li>
	<li>Halten Sie den betäubten Rattenwelpen auf einer geneigten flachen Plattform mit Laboretikettierband zurück. Der Welpe wird in Rückenlage in einem Winkel von ca. 45° fixiert.</li>
	<li>Öffnen Sie den Mund des Neugeborenen und ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette zur Seite.</li>
	<li>Verwenden Sie ein kleines Otoskopspekulum von 2 mm Durchmesser, das mit dem Otoskop verbunden ist, um die Zunge sanft zu halten und den Kehlkopf richtig zu visualisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie das Halsbeleuchtungssystem, d. h. das Operationsotoskop und die Lupe, um die Stimmbänder ordnungsgemäß zu visualisieren (Abbildung 1).</li>
	<li>Positionieren Sie die Tiere in einem Winkel von 45° in einer geneigten Ebene. Es werden die verdrahteten Bügeldeckel von Mauskäfigen verwendet (Abbildung 2). HINWEIS: Die Positionierung des Tieres in einem Winkel von 45° ermöglicht eine bessere Visualisierung der Trachealöffnung ohne die Interferenz der Epiglottis.</li>
	<li>Nehmen Sie eine langwinklige Pipettenspitze, die zum Laden von Western Blot Gels verwendet wird. Schneiden Sie die Basis der Pipettenspitze mit einer chirurgischen Klinge so ab, dass sie gut in die Spitze der 1-cm³-Spritze passt.</li>
	<li>Verwenden Sie die sterile 1-ml-Spritze, die in eine langwinklige Pipettenspitze eingebaut ist, um 30-50 μL der Substanz in die Lunge zu bringen. Drehen Sie die Spritze um und saugen Sie fast 0,9 ccm Luft in die 1-ml-Spritze ab, die mit der Pipettenspitze verbunden ist, gefolgt von dem Farbstoff oder der zu liefernden Substanz. Dadurch kann die Luft hinter dem Farbstoff in die Luftröhre gedrückt werden, nachdem der Farbstoff verabreicht wurde, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die intratracheale Verabreichung erfolgt durch Visualisierung des Kehlkopflumens (Stimmbänder) und Einführen der an einer Spritze angebrachten Pipettenspitze in das tracheale Lumen.</li>
	<li>Verwenden Sie das Spekulum des Otoskops, um die Zunge zu halten und die Stimmbänder freizulegen. Spekulum erfüllt die Rolle der Klinge eines Laryngoskops. Biegen Sie die Pipettenspitze in einem Winkel von 30°, um eine einfache Einführung des Mittels durch das kegelförmige Spekulum in die Trachealöffnung zu ermöglichen.</li>
	<li>Führen Sie die Pipettenspitze bis etwa 2 mm über die Stimmbänder hinaus in die Trachealöffnung ein. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um den Farbstoff oder das Arzneimittel durch das Spekulum des Operationsotoskops zu verabreichen, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Einführung von Luft in die Lunge kurz nach der Verabreichung des Mittels verhindert, dass die Substanz in die Kehlkopfhöhle zurückkehrt.</li>
	<li>Nachdem Sie den Welpen mit dem Farbstoff oder normaler Kochsalzlösung verabreicht haben, legen Sie die Welpen auf ein integriertes Heizkissen für zirkulierende Flüssigkeit (38 ° C), bis ihre Atembewegungen regelmäßig sind. Nach vollständiger Genesung von der Anästhesie vereinen Sie die Welpen wieder mit der Mutter.</li>
</ol>5. Charakterisierung der ITI-Lieferung
<ol><li>Nach ITI die Rattenwelpen einschläfern, indem Sie eine übermäßige Anästhesie (Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg) / Thiopenton geben, gefolgt von einer Exsanguination zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Verabreichung. Euthanasie wurde als Teil des Experiments durchgeführt, um Lungengewebe zu sammeln, um die Wirksamkeit zu demonstrieren.</li>
	<li>Sichern Sie den eingeschläferten Rattenwelpen auf einem Dissektionsbrett und wischen Sie Brust und Bauch mit 70% Ethylalkohol ab.</li>
	<li>Um die Verteilung des Farbstoffs in der Lunge zu bewerten, entfernen Sie die Lunge mit steriler Technik vom Tier und zeigen Sie die Lunge als für die Bildgebung geeignet an (Abbildung 4A, B).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die intratracheale Instillation ist eine ausgezeichnete Methode, die mehrere Vorteile gegenüber den bestehenden Methoden für Atemwegserkrankungen sowie für die Entwicklung von Krankheitsmodellen bietet. Es ist eine schnelle Methode und mit Erfahrung, kann mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 2-3 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Die wichtigsten Überlegungen für eine erfolgreiche Intubation sind die richtige Sedierung des Tieres, die korrekte Positionierung, insbesondere des Kopfes, sowie die genaue Platzi...

Frühgeborene Neugeborene haben schlecht entwickelte Lungen, die viele interventionelle Therapien wie Langzeitbeatmung erfordern. Diese Eingriffe setzen die überlebenden Neugeborenen einem hohen Risiko für nachfolgende Folgeerscheinungen1 aus. Experimentelle Tiermodelle dienen als wichtiges Werkzeug, um verschiedene Krankheitszustände zu simulieren, die Pathobiologie von Krankheiten zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu bewerten. Obwohl eine breite Palette von Tiermodellen von Mäusen, Ratten und Kaninchen bis hin zu Frühgeborenen Lämmern und Schweinen verfügbar ist, werden Mäuse und Ratten am häufigsten verwendet. 
Der Hauptvorteil der Verwendung von Mäusen und Ratten sind die relativ kurze Tragzeit und die reduzierten Kosten. Sie sind auch leicht verfügbar, in krankheitsfreien Umgebungen leicht zu pflegen, genetisch homogen und haben relativ weniger ethische Bedenken 2,3. Ein weiterer großer Vorteil des Nagetiermodells besteht darin, dass sich der neonatale Welpe bei der Geburt im späten kanalikulären / frühen sackförmigen Stadium der Lungenentwicklung befindet, das morphologisch der Lunge eines 24-wöchigen frühgeborenen menschlichen Säuglings entspricht, der eine bronchopulmonale Dysplasie entwickelt4. Da ihre Lungenentwicklung innerhalb der ersten 4 Lebenswochen schnell zum Abschluss schreitet, ist es außerdem möglich, die postnatale Lungenreifung in einem angemessenen Zeitrahmen zu untersuchen4. Trotz dieser Vorteile ist die geringe Größe der Mäuse und Rattenwelpen Anlass zur Sorge für verschiedene Interventionen, was die meisten Forscher dazu zwingt, erwachsene Tiere anstelle von Welpenzu verwenden 5. Neugeborene Lungen befinden sich in einem Entwicklungsstadium und die Reaktion eines Neugeborenen auf ein aufhetzendes Mittel unterscheidet sich von der eines Erwachsenen. Dies macht es angemessen, neonatale Tiermodelle zu verwenden, um menschliche neonatale Krankheitszustände zu untersuchen.
Es gibt verschiedene Methoden, um der Lunge Medikamente / biologische Wirkstoffe zu verabreichen. Dazu gehören intranasale6,7 oder intratracheale 8,9,10 Instillation sowie Aerosolinhalation11,12. Jeder Ansatz hat seine eigenen technischen Herausforderungen, Vorteile und Einschränkungen13. Der intratracheale Verabreichungsweg von Therapeutika wird bevorzugt, um die direkte therapeutische Wirkung im Organ unter Umgehung der systemischen Wirkungen zu untersuchen. Diese Route könnte auch verwendet werden, um Lungenpathologie zu untersuchen, die durch Anstiftungsmittel verursacht wird. Es gibt sowohl invasive als auch minimal-invasive Techniken, um dies zu tun, und ist bei Erwachsenen leicht durchzuführen. Bei Welpen gibt es jedoch aufgrund der geringen Größe des Tieres technische Herausforderungen, die mit dem Intubationsprozess verbunden sind. Die aktuelle Studie präsentiert eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische intratracheale Instillationsmethode (ITI) bei Rattenwelpen, die verwendet werden könnte, um die Wirksamkeit verschiedener neonataler therapeutischer Interventionen zu untersuchen und Tiermodelle zu erstellen, die neonatale Atemwegserkrankungen simulieren.

<table><tbody><tr><td>Evans Blue Farbstoff</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>314-13-6</td><td>Bestätigung der Arzneimittelverabreichung in die Lunge</td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA</td><td>Ausgegeben von einer Tierhaltungseinrichtung</td><td>Zur Sedierung</td></tr><tr><td>Operatives Otoskop</td><td>Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA</td><td>21770- 3,5 V</td><td>Zur Visualisierung von Stimmbändern</td></tr><tr><td>Otoskop Wiederaufladbarer Griff</td><td>Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA</td><td>71050-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitze (Gelladung)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-139</td><td>Verabreichung des Arzneimittels</td></tr><tr><td>Plattform zur Rückhaltung (schiefe Ebene)</td><td>Tierpflegeeinrichtung</td><td>Von Tierpflegeeinrichtung abgegeben</td><td>Verdrahtetes Dach des Mäusekäfigs kann verwendet werden</td></tr><tr><td>3M Micropore Chirurgisches Weißes Papier (Klebeband)</td><td>3M, St. Paul, MN, USA</td><td>1530-2</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock-SpritzeSpritzen (1 ml)</td><td>BD Franklin Lakes, NJ , USA</td><td>NBD2515</td><td>Verabreichung des Medikaments</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA</td><td></td><td>Zur Sedierung</td></tr></tbody></table>

eine minimal-invasive methode zur intratrachealen instillation von medikamenten bei neonatalen nagetieren zur behandlung von lungenerkrankungen

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

Die Behandlung von neugeborenen Nagetieren mit Medikamenten, die direkt in die Luftröhre eingeträufelt werden, könnte als wertvolles Werkzeug dienen, um die Auswirkungen eines lokal verabreichten Medikaments zu untersuchen. Dies hat direkte translationale Auswirkungen, da Tensid und Medikamente lokal in die Lunge verabreicht werden. Obwohl die Literatur viele Publikationen enthält, die die minimalinvasive transorale Intubation von erwachsenen Mäusen und Ratten in therapeutischen Experimenten beschreiben, fehlt dieser Ansatz bei neonatalen Rattenwelpen. Die geringe Größe der orotrachealen Region / des Pharynx in den Welpen erschwert die Visualisierung von Kehlkopflumen (Stimmbändern) und trägt zur variablen Erfolgsrate der intratrachealen Arzneimittelabgabe bei. Wir demonstrieren hiermit eine effektive orale Intubation von neonatalen Rattenwelpen - eine Technik, die nicht-traumatisch und minimal-invasiv ist, so dass sie für die serielle Verabreichung von Medikamenten verwendet werden kann. Wir verwendeten ein Operationsotoskop mit einem Beleuchtungssystem und einer Lupe, um die Trachealöffnung der Rattenneugeborenen zu visualisieren. Das Medikament wird dann mit einer 1-ml-Spritze eingeträufelt, die mit einer Pipettenspitze verbunden ist. Die Genauigkeit der Verabreichungsmethode wurde unter Verwendung der Verabreichung von Evans blauem Farbstoff nachgewiesen. Diese Methode ist leicht zu trainieren und könnte als eine effektive Möglichkeit dienen, Medikamente in die Luftröhre einzuflößen. Diese Methode könnte auch für die Verabreichung von Inokulum oder Wirkstoffen zur Simulation von Krankheitszuständen bei Tieren und auch für zellbasierte Behandlungsstrategien für verschiedene Lungenerkrankungen verwendet werden.

Die Instillation von Evans-Blau zeigte eine multifokale Verteilung des Farbstoffs unter Einbeziehung aller Lungenlappen (Abbildung 4A,B). Unser Ergebnis, wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigt die Wirksamkeit der Verteilung auf alle Lappen. Das Bild wird unmittelbar nach dem ITI des Farbstoffs in die Luftröhre aufgenommen. Eine 100%ige Wirksamkeit wurde erreicht, indem der Farbstoff in die Luftröhre eingeträufelt wurde, gefolgt von seiner Ausbreitung...

Diese Technik, Medikamente direkt in die Luftröhre von neonatalen Nagetieren einzuträufeln, ist wichtig, um die Auswirkungen von lokal verabreichten Medikamenten oder Biologika auf neonatale Lungenerkrankungen zu untersuchen. Darüber hinaus kann diese Methode auch zur Induktion von Lungenverletzungen in Tiermodellen eingesetzt werden.

Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Dieses Protokoll zeigt, dass es möglich ist, Forschungsmaterial in die Luftröhre von fünf Tage alten neonatalen Rattenwelpen durch direkte Visualisierung einzuflößen. Diese Methode verbessert die Zuverlässigkeit der Verabreichung von Forschungsmaterial oder Medikament in die Luftröhre durch direkte Visualisierung. Durch die Vermeidung der Injektion in die Luftröhre reduziert diese Methode Schmerzen und, was noch wichtiger ist, Blutungen in die Luftröhre, was ein verbessertes Überleben ermöglicht.Die Entwicklung von feinen Fähigkeiten ist erforderlich, um dieses Protokoll durchzuführen, einschließlich der angemessenen Positionierung des Tieres, der korrekten Verwendung des Operationsautoskops zur Visualisierung der Stimmbänder und der Wirksamkeit der Verabreichung in die Lunge. Das Verfahren wird von Tara Sudhadevi, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, und Alison Ha, einer Doktorandin, demonstriert. Bestätigen Sie vor Beginn des Experiments einen Verlust des Schwanz- und Pedalreflexes bei einem betäubten fünf Tage alten Rattenwelpen und verwenden Sie Laboretikettierband, um den Welpen in Rückenlage auf einer flachen, um 45 Grad geneigten Plattform zurückzuhalten.Verwenden Sie stumpfe Pinzetten, um die Zunge sanft zur Seite zu ziehen, und halten Sie die Zunge mit Hilfe eines Otoskopspekulums mit einem Durchmesser von zwei Millimetern vorsichtig an Ort und Stelle, so dass der Kehlkopf sichtbar ist. Mit dem Operationsotoskop mit dem Spekulum in der richtigen Größe lokalisieren Sie die Stimmbänder durch die Lupe des Otoskops. Für die intratracheale Instillation laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer langwinkligen, gelbeladenen Pipettenspitze ausgestattet ist, mit 0,9 Kubikzentimetern Luft, gefolgt von 30 bis 50 Mikrolitern der interessierenden Substanz.Biegen Sie die Pipettenspitze in einem Winkel von 30 Grad und führen Sie die geladene Pipettenspitze durch das Spekulum bis etwa zwei Millimeter über die Stimmbänder hinaus. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die interessierende Substanz und die Luft durch das Spekulum in die Stimmbänder zu verabreichen. Wenn die gesamte Substanz geliefert wurde, legen Sie den Welpen auf ein integriertes 38-Grad-Zirkulationsflüssigkeitsheizkissen mit Überwachung bis zur regelmäßigen Atmung, bevor Sie den Welpen wieder mit dem Damm vereinen.Um die Verteilung der Substanz innerhalb einer Lungengewebeprobe zu bewerten, wischen Sie die Brust und den Bauch der eingeschläferten Rattenwelpen mit 70% Ethylalkohol ab und verwenden Sie eine sterile Technik, um die Lunge gemäß den Standardprotokollen für ihre visuelle Beurteilung zu entfernen. In dieser Studie wurde die Wirksamkeit der intratrachealen Instillationstechnik durch visuelle Untersuchung des Lungengewebes beurteilt, das von einem fünf Tage alten Rattenwelpen gesammelt wurde, der mit Evans blauem Farbstoff instilliert wurde. Die Instillation war fast 100% effizient, da sich der Farbstoff sofort nach der Verabreichung in die Lunge ausbreitete und sich über alle Lappen des Lungengewebes verteilte.Der Farbstoff wurde in keinem Gewebe außerhalb der Lunge beobachtet, was die Fähigkeit der Technik bestätigt, für die selektive Verabreichung eines für die Lunge interessanten Therapeutikums verwendet zu werden. Das anfängliche Platzieren des Tieres im richtigen Winkel über eine feste Oberfläche ist entscheidend für den Erfolg des nächsten Schritts, die Stimmbänder mit dem Bedienautoskop zu visualisieren.

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Die Verwendung eines Modells, das den Zustand von Lungenerkrankungen in Menschen nachahmt, ist für die Untersuchung der Pathophysiologie und / oder Ätiologie von bestimmten Krankheiten und für die Entwicklung von therapeutischen Eingriff. Hier eine nicht-invasive Methode, die intratracheale Intubation direkt liefern kann exogene Materialien Maus Lunge wird vorgestellt.

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Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.

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Dieser Artikel stellt eine schnelle und einfache Methode zur Bleomycin direkt in die Luftröhre Maus über Intubation verabreicht wird. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass sie in hohem Maße reproduzierbar, leicht zu beherrschen ist, und nicht spezialisierte Ausrüstung oder langwierige Wiederherstellungszeiten erfordern.

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Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.

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Described ist ein Protokoll zur Durchführung einer intratrachealen Transplantation von mesenchymalen Stromalzellen (MSCs) durch intratracheale Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Technik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lungen der neonatalen Ratte, um ihre Wirksamkeit zu bewerten.

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Dieses Protokoll zeigt, wie die optimale Positionierung einer Maus und das transorale Einsetzen eines kamerabasierten Otoskops die Visualisierung der Stimmritze, eine schnelle Intubation mit minimalem Gewebetrauma und eine gleichmäßige Flüssigkeitsabgabe an die Lunge ermöglicht.

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Lernen Sie eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Medikamentengabe bei fünf Tage alten neonatalen Ratten durch direkte Sichtbarkeit. Diese Technik verbessert die Überlebensraten und reduziert Schmerz sowie Blutungen erheblich.

Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen (Video) | JoVE Journal

Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen

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