MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien
23. Februar 2021
Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.
Ms2-Affinitätsreinigung in Verbindung mit RNA-Sequenzierung oder MAPS wurde entwickelt, um das gesamte Targetom jeder RNA von Interesse für Bakterien zu identifizieren. Diese Technologie ermöglicht es, jede Art von sRNA-Partnern unabhängig vom Regulationsmechanismus zu identifizieren. Die Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken wird dazu beitragen, die Produktion, Biofilmbildung und das Überleben der Bakterien in den Wirtszellen besser zu verstehen und letztendlich Staphylokokkeninfektionen zu bekämpfen.
Dieses Protokoll kann auf alle pathogenen oder nicht pathogenen grampositiven Bakterien angewendet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Noemie Mercier, einer Doktorandin aus dem Labor von Dr. Pascal Romby. Zu Beginn züchten Sie eine Kolonie von Stämmen, die entweder pCN51 P3 MS2 sRNA oder pCN51 P3 MS2-Plasmide in drei Millilitern BHI-Medium tragen, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Mikroliter Erythromycin in Duplikaten.
Verdünnen Sie jede Nachtkultur in 50 Millilitern frischem BHI-Medium, ergänzt mit Erythromycin, um einen OD 600 von 0,05 zu erreichen. Züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 180 U / min für sechs Stunden. Jede Kultur in ein 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen geben und die Röhrchen bei 2.900 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, dann den Überstand entsorgen, einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern oder die Pellets auf Eis halten und direkt mechanische Zelllyse durchführen.
Um eine mechanische Zelllyse durchzuführen, resuspendieren Sie Pellets in fünf Milliliter Puffer A und übertragen Die resuspendierten Zellen in 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen mit 3,5 Gramm Kieselsäureperlen. Setzen Sie die Röhren in ein mechanisches Zelllyseinstrument ein und führen Sie einen Zyklus von 40 Sekunden mit vier Metern pro Sekunde durch. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.900 mal G für 15 Minuten, dann bergen Sie den Überstand und halten Sie ihn auf Eis.
Stellen Sie sicher, dass der Überstand klar ist, und wiederholen Sie die Zentrifugation, wenn dies nicht der Fall ist. Entfernen Sie die Säulenspitze, legen Sie dann eine Chromatographiesäule in ein Säulengestell und waschen Sie die Säule mit Reinstwasser. Fügen Sie 300 Mikroliter Amyloseharz hinzu und waschen Sie die Säule mit 10 Millilitern Puffer A.Verdünnen Sie 1.200 Picamolen MBP-MS2-Protein in sechs Milliliter Puffer A und laden Sie es in die Säule.
Waschen Sie die Säule mit 10 Milliliter Puffer A.Führen Sie als Nächstes eine MS2-Affinitätsreinigung durch. Laden Sie das Zelllysat in die Säule und sammeln Sie die Durchflussfraktion in einem sauberen Sammelrohr. Waschen Sie die Säule dreimal mit 10 Millilitern Puffer A und sammeln Sie die Waschfraktion, dann eluieren Sie die Säule mit einem Milliliter Puffer E und sammeln Sie die Elutionsfraktion in einem Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen.
Halten Sie alle gesammelten Fraktionen bis zur RNA-Extraktion auf Eis. Verwenden Sie einen Milliliter jeder Fraktion für die RNA-Extraktion. Fügen Sie der RNA ein Volumen Phenol hinzu und mischen Sie kräftig, dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 16.000 mal G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius.
Übertragen Sie die obere Phase in ein sauberes Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen. Fügen Sie ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation, dann übertragen Sie die obere Phase in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 2,5 Volumina von 100% kaltem Ethanol und 0,1 Volumen von drei molaren Natriumacetat bei pH 5,2 hinzu und fallen Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aus.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 16.000 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Ethanol langsam mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Fügen Sie 500 Mikroliter 80% kaltes Ethanol und Zentrifuge für fünf Minuten hinzu.
Entsorgen Sie das Ethanol, indem Sie es langsam pipettieren, und trocknen Sie das Pellet dann im Betriebsmodus fünf Minuten lang mit einem Vakuumkonzentrator. Das Pellet in einem geeigneten Volumen Reinstwasser wieder auffüllen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das RsaC-Targetom in S.aureus zu untersuchen.
Mehrere mRNAs, die direkt mit RsaC interagieren, wurden mithilfe der MAPS-Technologie identifiziert, was ihre entscheidende Rolle bei oxidativem Stress und metallbedingten Reaktionen aufzeigt. Um die MS2-sRNA-Konstrukte zu bestätigen und ihr Expressionsmuster zu visualisieren, wurden Zellen nach zwei, vier und sechs Stunden Wachstum in BHI-Medium geerntet. RNA wurde extrahiert und die Northern Blot-Analyse mit der RsaC-spezifischen DIG-Sonde durchgeführt.
Der Gehalt an endogenem RsaC stieg nach sechs Stunden Wachstum signifikant an. Wichtig ist, dass das Niveau von MS2-RsaC 544 und MS2-RsaC 1, 116 mit endogenem RsaC nach sechs Stunden vergleichbar war. Es wurde eine Affinitätsreinigung durchgeführt und RNAs wurden aus den Rohextrakt-, Durchfluss- und Elutionsfraktionen im Wildtypstamm extrahiert, der allein das MS2-Tag und der mutierte RsaC-Stamm das MS2-RsaC 544-Konstrukt exprimiert.
Das 1.116 Nukleotid lange endogene RsaC wurde in der Elutionsfraktion angereichert, interagierte aber aufgrund seiner Länge und komplexen Sekundärstruktur unspezifisch mit der Affinitätssäule. Das MS2-RsaC 544 wurde in der Elutionsfraktion stark angereichert, was zeigt, dass es erfolgreich vom MS2-MBP-Fusionsprotein zurückgehalten wurde. Eine bioinformatische Analyse ergab mutmaßliche mRNA-Targets entsprechend der Faltenänderung zwischen MS2 sRNA und MS2-Kontrolle, was darauf hindeutet, dass sodA das erste mutmaßliche Ziel war.
Eine Northern Blot-Analyse, die nach der MS2-Affinitätsreinigung eine sodA-spezifische DIG-Sonde durchgeführt hat, zeigt, dass sodA im Vergleich zur MS2-Kontrolle effizient mit MS2-RsaC 544 co-angereichert wurde. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass das Hinzufügen des MS2-Tags die sRNA-Bestätigung, Stabilität oder Funktion beeinträchtigen kann. Dies sollte sorgfältig überwacht werden.
MAPS liefert eine Momentaufnahme der Paarung von sRNA-RNA-Targets. Weitere experimentelle Validierungen werden ihre Funktion entwirren. Diese Technik stellt ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um sRNA-regulatorische Netzwerke in bakterien aufzubauen.
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Übersicht
Die MAPS-Technologie ermöglicht die Identifizierung des Targetoms spezifischer regulatorischer RNAs in vivo, insbesondere in Gram-positiven Bakterien. Diese Methode nutzt die MS2-Affinitätsreinigung und die RNA-Sequenzierung, um RNA-Partner gleichzeitig anzureichern und zu identifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiologie
- RNA-Biologie
Hintergrund
- Das Verständnis sRNA-abhängiger regulatorischer Netzwerke ist entscheidend für die Untersuchung des bakteriellen Verhaltens.
- Die Identifizierung von RNA-Partnern kann Aufschluss über Virulenzfaktoren und Biofilmbildung geben.
- Die MAPS-Technologie ermöglicht die unabhängige Identifizierung von sRNA-Partnern.
- Dieses Protokoll ist sowohl auf pathogene als auch auf nicht-pathogene Gram-positive Bakterien anwendbar.
Zweck der Studie
- Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken in Bakterien.
- Verbesserung des Verständnisses bakterieller Überlebensmechanismen in Wirtszellen.
- Entwicklung von Strategien gegen Staphylokokken-Infektionen.
Verwendete Methoden
- MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung.
- Züchtung bakterieller Stämme in BHI-Medium mit Erythromycin.
- Gleichzeitige Reinigung der sRNA und ihrer Bindungspartner zur Analyse.
- Identifizierung der RNA-Bindungspartner mittels Sequenzierverfahren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von sRNA-Partnern in grampositiven Bakterien.
- Einblicke in regulatorische Netzwerke, die Virulenz und Überleben beeinflussen.
- Demonstration des Protokolls durch einen Doktoranden aus dem Labor von Dr. Pascal Romby.
- Potentielle Anwendungen bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.
Schlussfolgerungen
- Die MAPS-Technologie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von RNA-Interaktionen.
- Das Verständnis von sRNA-Netzwerken kann zu besseren therapeutischen Strategien führen.
- Diese Methode kann für verschiedene bakterielle Arten angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die MAPS-Technologie ermöglicht eine umfassende Targetom-Mapping von kleinen regulatorischen RNAs in grampositiven Pathogenen und unterstützt die Target-Validierung bei der Entwicklung antimikrobieller Wirkstoffe. Durch die Aufdeckung von sRNA-mRNA-Interaktionen, die Virulenz und Überleben beeinflussen, bietet sie eine mechanistische Entlastung für antibakterielle Programme in frühen Entwicklungsstadien. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Priorisierung von sRNA-Targets für therapeutische Eingriffe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung sRNA-abhängiger regulatorischer Netzwerke, um therapeutische Hypothesen bei grampositiven Bakterien zu klären.
- Operativer Wert: Liefert eine Momentaufnahme der sRNA-Targetome, um die biologische Risikominderung und funktionale Zielvalidierung zu unterstützen.
- Wissenschaftlicher Wert: Identifiziert putative mRNA-Ziele wie sodA und verknüpft damit die sRNA-Aktivität mit Wegen des oxidativen Stresses und der Metallantwort.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative RNA-Sequenzierungsdaten aus co-purifizierten Fraktionen, um die reproduzierbare Identifizierung von Zielstrukturen zu ermöglichen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Anreicherung mittels MS2-MBP-Fusion an Amyloserharz und ermöglicht die Skalierbarkeit des Assays über verschiedene grampositive Stämme hinweg.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Anreicherungsmetriken (z. B. Elutionsfraktion), um spezifische von unspezifischen RNA-Interaktionen zu unterscheiden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet sRNA-Regulons mit phänotypischen Ausgaben wie der Produktion von Virulenzfaktoren und der Biofilmbildung bei Staphylococcus aureus.
- Operationaler Wert: Unterstützt die translationale Biomarkerabstimmung, indem sRNA-Aktivität mit für die Infektion relevanten Stressantwortwegen verknüpft wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem sRNA-Ziele durch orthogonale Methoden wie Northern Blot validiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
MAPS fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leadoptimierung ein, insbesondere für antibakterielle Programme, die auf die RNA-basierte Regulation abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Funktion von sRNAs durch Kartierung von RNA-Interaktomen in vivo unter definierten Wachstumsbedingungen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Lyse, Affinitätsanreicherung und RNA-Extraktionsworkflows, die mit Sequenzierung kompatibel sind.
- Analytik: Stellt Faltungsänderungsmessungen zwischen MS2-sRNA- und Kontrollfraktionen bereit, um Ziele mit hoher Zuverlässigkeit für nachfolgende Untersuchungen zu priorisieren.
- Translationale Forschung: Verbindet sRNA-Targetome mit Überlebensmechanismen des Wirts und unterstützt so die präklinische Validierung von antiinfektiven Strategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung von sRNA-Targetomen über pathogene und nicht-pathogene Gram-positive Arten hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Identifizierung von sRNA-Zielen, Verringerung mechanistischer Uneindeutigkeiten in der posttranskriptionellen Regulation.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Erfassung von RNA-Protein-Wechselwirkungen in bakteriellen Lysaten.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen bei der Auswahl antimikrobieller Zielstrukturen, Kapitalwirksamkeit und reduziertes biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von sRNA-Zielen basierend auf Anreicherungsdaten und phänotypischer Korrelation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, bakterieller Kultur und RNA-Handhabung.
- Benötigt Infrastruktur für mechanische Lyse, Chromatographiesysteme und RNA-Sequenzierungskapazitäten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg hinsichtlich Konstruktgestaltung (z. B. MS2-sRNA-Fusionen) und Expressionvalidierung.
- Erfordert Anpassungsbetrachtungen hinsichtlich sRNA-Stabilität und Sekundärstruktur bei der Anwendung auf verschiedene grampositive Modelle.
- Praktische Einschränkung: Putative Zielstrukturen erfordern eine orthogonale Validierung (z. B. Northern Blot), um die Spezifität aufgrund möglicher unspezifischer Wechselwirkungen zu bestätigen.
